郭杉，袁濤，劉英

近年干細胞相關(guān)治療方法是子宮內(nèi)膜修復(fù)研究領(lǐng)域的新興熱點。在眾多種類的干細胞中，人胚胎干細胞分化潛能最為全面，具有極高的研究價值。有動物實驗表明，將人胚胎干細胞分化成的子宮內(nèi)膜樣細胞接種于子宮內(nèi)膜損傷的小鼠體內(nèi)，小鼠子宮中有分化后的細胞存活，內(nèi)膜損傷得到修復(fù)[1]。但是，現(xiàn)有報道的將人胚胎干細胞向子宮內(nèi)膜樣細胞分化方法中，目的細胞獲得率低（約為16.9%），給后續(xù)的體內(nèi)移植帶來一定困難[2-3]。本研究使用無飼養(yǎng)層培養(yǎng)的人胚胎干細胞，分別通過共培養(yǎng)誘導(dǎo)法和細胞因子誘導(dǎo)法向子宮內(nèi)膜樣細胞分化，尋找更為高效可靠的分化方法，為后續(xù)深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究材料

1.1.1 干細胞來源人胚胎干細胞購自北京賽貝生物技術(shù)有限公司，為h1干細胞系。

1.1.2 主要試劑DMEM/F12、青鏈霉素、胎牛血清（FBS）、0.25%胰酶-EDTA、磷酸鹽緩沖液（PBS）及膠原酶Ⅳ均購自美國Gibco 公司；PSCeasy 人多潛能干細胞鋪底工作液、PSCeasyⅡ人多潛能干細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基、PSCeasy人多潛能干細胞消化液均購自北京賽貝生物技術(shù)有限公司；轉(zhuǎn)化生長因子α（TGF-α）、上皮生長因子（EGF）、血小板源性生長因子-BB（PDGF-BB）均購自美國Peprotech公司；β雌二醇（β-E2）購自美國Sigma公司；鼠抗人細胞角蛋白18抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；兔抗人波形蛋白抗體購自英國Abcam公司；dylight594羊抗小鼠抗體、dylight649羊抗小鼠抗體、dylight488羊抗兔抗體均購自美國Earthox公司；4%多聚甲醛購自北京索萊寶科技有限公司；聚乙二醇辛基苯基醚（tritonX-100）購自美國Invitrogen公司；固定緩沖液、通透緩沖液Ⅲ均購自美國BD公司。

1.1.3 主要儀器及耗材TDL-40B離心機（無錫市瑞江分析儀器有限公司）；C6流式細胞儀（美國BD公司）；移液槍（德國Eppendorf公司）；CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；超凈臺（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；水浴鍋（北京市長風(fēng)儀器儀表公司）；凍存管、15 mL和50 mL離心管、6 cm和10 cm細胞培養(yǎng)皿均購自丹麥NUNC公司；6孔板細胞培養(yǎng)皿及Transwell-膜嵌套3412均購自美國Corning公司。

1.2 研究方法

1.2.1 子宮內(nèi)膜細胞組織獲取及原代培養(yǎng)選取在2018年2—10月于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院（我院）生殖中心行子宮內(nèi)膜診刮術(shù)患者的無病變子宮內(nèi)膜。納入標(biāo)準(zhǔn)：①有正常排卵性月經(jīng)周期；②3個月內(nèi)無宮腔操作及激素服用史。本研究已獲得我院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)，并獲得患者的知情同意。參照本實驗室既往使用的方法[4]，將診刮取得的子宮內(nèi)膜組織迅速放入4 ℃預(yù)冷含有0.5%青鏈霉素和DMEM/F12培養(yǎng)液的15 mL無菌離心管中，轉(zhuǎn)移至實驗室。350×g離心5 min后，于超凈臺中棄上清，將組織移入6 cm無菌培養(yǎng)皿中，用無菌眼科剪剪碎成1 mm3塊狀，PBS沖洗后移入15 mL離心管，向管內(nèi)加入約為組織塊體積3倍的0.1%膠原酶Ⅳ，充分吹打后置于37 ℃孵箱中消化30 min，每10 min吹打1次。加入等量培養(yǎng)液終止消化，依次過100 μm和40 μm濾網(wǎng)后，將含有內(nèi)膜細胞的濾液收集于新的離心管中，350×g離心5 min，此次的細胞沉淀為進一步純化的子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞。將細胞沉淀用含有10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液重懸計數(shù)后，以1×105/cm2的密度接種于10 cm細胞培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。24 h后于倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)、密度及生長狀態(tài)。每天換液至細胞達到80%～90%融合，使用0.25%胰酶-EDTA進行傳代，傳代至第2～3代以后通過免疫熒光實驗檢測細胞純度，并根據(jù)需要將細胞接種于Transwell嵌套中備誘導(dǎo)分化用。

1.2.2 人胚胎干細胞無飼養(yǎng)層培養(yǎng)將4 mL PSCeasy人多潛能干細胞鋪底工作液（含基質(zhì)膠）加入6 cm細胞培養(yǎng)皿中，置于孵箱中至少孵育4 h。復(fù)蘇凍存的人胚胎干細胞，適量PSCeasy培養(yǎng)液重懸后，取出孵箱中提前鋪底的培養(yǎng)皿，吸棄多余的鋪底工作液，以1×105/cm2的密度接種于培養(yǎng)皿中。24 h后觀察細胞形態(tài)及復(fù)蘇情況。

1.2.3 共培養(yǎng)法及細胞因子法誘導(dǎo)分化將實驗需要的6孔板提前做好鋪底處理過夜。吸棄人胚胎干細胞培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，加入2 mL PSCeasy人多潛能干細胞消化液，置于孵箱中37 ℃消化2 min 30 s后取出，棄上清，加入適量PSCeasy培養(yǎng)液吹打，按1∶10比例將人胚胎干細胞接種于預(yù)先鋪底的6孔板中。24 h后于倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)，然后分組進行誘導(dǎo)分化。①共培養(yǎng)組：在6孔板中加入Transwell嵌套，并接種6×104個子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞。在6孔板底部和Transwell嵌套中各加入2 mL分化培養(yǎng)基（10 ng/mL EGF、10 ng/mL PDGF-BB、10 ng/mL TGF-α、1×10-7mol/L β-E2及含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液）；②細胞因子組：在6孔板的每孔中加入2 mL分化培養(yǎng)基（成分同共培養(yǎng)組）；③對照組：在6孔板的每孔中加入2 mL子宮內(nèi)膜細胞培養(yǎng)基（DMEM/F12+10%FBS）。3組均每天換液，在第4天用0.25%胰酶-EDTA消化傳代。

1.2.4 細胞形態(tài)記錄、免疫熒光染色及流式細胞學(xué)實驗分析子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞于第2～3代進行免疫熒光實驗檢測細胞角蛋白18及波形蛋白表達情況。將子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞接種于激光共聚焦皿中，4%多聚甲醛固定10 min，PBS清洗，0.1%tritonX-100通透20 min后，加入10%FBS封閉后，4 ℃孵育1∶500稀釋的兔抗人波形蛋白抗體和鼠抗人細胞角蛋白18抗體過夜，同時設(shè)置陰性對照，4 ℃孵育PBS過夜。第2天洗凈一抗，孵育1∶200稀釋的羊抗兔二抗1 h，封片后于熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。另外，誘導(dǎo)分化的3組細胞于第4天拍照記錄倒置相差顯微鏡下觀測的形態(tài)，經(jīng)0.25%胰酶-EDTA消化傳代后，于第7天再次拍照記錄形態(tài)，第8天收細胞進行流式細胞學(xué)實驗分析其分化效率。將分化的細胞消化成單細胞后，經(jīng)固定緩沖液37 ℃固定12 min，通透緩沖液Ⅲ冰上通透30 min后，于冰上孵育1∶500稀釋的兔抗人波形蛋白抗體和鼠抗人細胞角蛋白18抗體1 h，PBS洗凈后再孵育1∶200稀釋的羊抗兔二抗30 min，洗凈重懸于流式管中上機分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析。定量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，3組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞形態(tài)和免疫熒光染色 光鏡下可見子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞呈長梭狀貼壁生長（見圖1A）。經(jīng)免疫熒光染色，培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜細胞波形蛋白表達陽性，細胞角蛋白18表達陰性，證實為間質(zhì)細胞（見圖2）。

2.2 人胚胎干細胞分化的細胞形態(tài)改變 光鏡下可見未分化的人胚胎干細胞呈克隆貼壁生長（見圖1B），高倍鏡下見細胞呈圓形，體積小，細胞核大（見圖1C）。分化后第4天3組細胞的形態(tài)均發(fā)生改變，誘導(dǎo)分化的細胞呈多角狀，邊緣不規(guī)則，核質(zhì)比變?。ㄒ妶D1D～1F）。傳代后，分化第7天共培養(yǎng)組和細胞因子組的細胞呈長梭狀，核質(zhì)比變?。ㄒ妶D1G、圖1H）；對照組細胞則形態(tài)不一，有的呈類圓形，有的呈類梭形（見圖1I）。

2.3 人胚胎干細胞的分化效率 經(jīng)流式細胞術(shù)檢測，共培養(yǎng)組和細胞因子組誘導(dǎo)分化第8天的細胞波形蛋白表達均為陰性，部分細胞角蛋白18表達陽性，分化率分別為（55.63±10.29）%和（13.9±0.26）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（n=3，P=0.000）（見圖3A、圖3B），提示人胚胎干細胞部分向子宮內(nèi)膜上皮細胞方向分化。對照組（89.40±11.41）%的細胞波形蛋白、細胞角蛋白18表達均呈陽性，未見定向分化（見圖3C）。共培養(yǎng)組、細胞因子組及對照組（4.29±3.54）%的細胞向子宮內(nèi)膜上皮細胞方向分化率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（n=3，F(xiàn)=56.590，P=0.000）。

3 討論

人胚胎干細胞因其全能的分化潛能及強大的自我更新能力一直廣受科學(xué)界的關(guān)注[5]。自Thomson等[6]于1998年從囊胚內(nèi)細胞團中成功分離以來，其培養(yǎng)方式起初為動物細胞來源的飼養(yǎng)層培養(yǎng)。隨著學(xué)者們的進一步研究，維持人胚胎干細胞干性的相關(guān)蛋白被分離提純，以基質(zhì)膠為代表的無飼養(yǎng)層培養(yǎng)逐漸成為主流培養(yǎng)方式[7]。與飼養(yǎng)層培養(yǎng)法相比，無飼養(yǎng)層培養(yǎng)法操作簡捷，降低了在長時間培養(yǎng)過程中細胞的污染風(fēng)險。而且，此前飼養(yǎng)層培養(yǎng)法的飼養(yǎng)層細胞多為經(jīng)絲裂霉素處理的小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）[8]。飼養(yǎng)層細胞的動物源性為人胚胎干細胞異體移植帶來了一定的風(fēng)險與困難。目前，無飼養(yǎng)層培養(yǎng)法可使體外培養(yǎng)的人胚胎干細胞保持未分化狀態(tài)并實現(xiàn)有效擴增，避免了動物源性污染，已有學(xué)者將無飼養(yǎng)層培養(yǎng)的人胚胎干細胞向心肌細胞[9]和視網(wǎng)膜色素上皮細胞[10]分化。本實驗采取的無飼養(yǎng)層培養(yǎng)法既能保持胚胎干細胞的干性，也有利于細胞的后續(xù)有效分化。

關(guān)于人胚胎干細胞向子宮內(nèi)膜樣細胞誘導(dǎo)分化方案中，分化所需時間、分化后形成的細胞種類以及細胞分化率均有不同。有研究將自主建系的人胚胎干細胞系置于小鼠MEF飼養(yǎng)層細胞上培養(yǎng)，采用擬胚體懸浮法、細胞因子法及共培養(yǎng)法3種方法誘導(dǎo)分化，21 d后經(jīng)流式細胞學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)組分化效率最高，有16.9%的細胞角蛋白表達陽性，波形蛋白陰性[2]。而另一研究使用共培養(yǎng)法將其自主建系的人胚胎干細胞置于小鼠MEF飼養(yǎng)層細胞上分化5周，免疫熒光染色結(jié)果顯示約80%的細胞角蛋白表達陽性，15%的細胞波形蛋白表達陽性[1]。本研究中，在細胞因子的協(xié)同作用下，共培養(yǎng)組8 d后即有約55.63%的細胞分化為子宮內(nèi)膜上皮樣細胞，顯著地縮短了分化時間，提高了分化效率，進而為后續(xù)的研究打下良好的實驗基礎(chǔ)。分化效率的提高可能受以下兩方面因素的影響：①動物源性飼養(yǎng)層細胞的存在有利于人胚胎干細胞干性的維持，但不利于人胚胎干細胞的分化。本研究中的培養(yǎng)方法是無飼養(yǎng)層培養(yǎng)，所以更利于分化；②傳代操作可避免人胚胎干細胞在分化過程中與飼養(yǎng)層細胞或鋪底層長時間接觸，有助于人胚胎干細胞快速分化。本實驗的分化方案雖然顯著提高了分化效率，但也存在不足之處，培養(yǎng)體系中仍有動物源性成分存在（如FBS），今后的分化方案可以在本研究基礎(chǔ)上進一步改進，使用人源性血清（如人臍帶血清）代替FBS，從而避免動物源性成分的影響，使臨床應(yīng)用成為可能。

本研究證明，在與子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞共培養(yǎng)的條件下，無飼養(yǎng)層法培養(yǎng)的人胚胎干細胞向子宮內(nèi)膜上皮方向分化。細胞分化方向的不同可能受培養(yǎng)環(huán)境中添加的細胞因子種類的影響。Yu等[2]研究添加的細胞因子為β-E2、EGF、TGF-α及PDGF-BB，子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞與hESCs共培養(yǎng)21 d后，16.9%的細胞分化為子宮內(nèi)膜上皮樣細胞。本實驗添加的細胞因子種類及濃度與之相同，第8天時55.63%細胞分化為子宮內(nèi)膜上皮樣細胞。而Song等[1]研究添加的細胞因子為β-E2、EGF及PDGF-BB，共培養(yǎng)5周后，80%的細胞向子宮內(nèi)膜上皮細胞分化，15%的細胞向子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞分化。在生理狀態(tài)下，EGF、TGF-α及PDGF-BB均作用于人子宮內(nèi)膜上皮和間質(zhì)細胞，促進細胞增殖，而每種因子在分化過程中對分化方向的影響及作用目前尚未明確，應(yīng)在后續(xù)實驗中深入探討。

總之，在與子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞共培養(yǎng)及細胞因子的共同作用下，無飼養(yǎng)層培養(yǎng)的人胚胎干細胞可在較短時間內(nèi)高效向子宮內(nèi)膜上皮細胞方向分化，為后續(xù)實驗提供了較為理想的分化方案。

圖1 各組細胞培養(yǎng)形態(tài)

圖2 子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞免疫熒光染色

圖3 流式細胞學(xué)實驗檢測各組細胞分化率