蒲思思 周朝輝 賈能勤

摘 要： 癌癥死亡患者中有90%由癌癥轉(zhuǎn)移引起，研究表明：患者的外周血、胸腔液等體液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）與癌癥轉(zhuǎn)移及腫瘤結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移（TNM）分期密切相關(guān).因此，CTC檢測在實(shí)體腫瘤前期診斷、預(yù)后及療效評估等方面扮演著舉足輕重的角色.該綜述基于CTC區(qū)別于正常細(xì)胞的物理學(xué)、電學(xué)、生物學(xué)特征，總結(jié)了目前CTC分離富集及分析檢測技術(shù)的研究進(jìn)展，并就國內(nèi)外CTC檢測面臨的挑戰(zhàn)進(jìn)行了討論，對其未來發(fā)展趨勢進(jìn)行了展望.

關(guān)鍵詞： 循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）; CTC檢測; 分離富集

中圖分類號： O 6-1; R 730.4? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號： 1000-5137（2020）02-0219-15

Research progress on isolation，enrichment and detection of circulating tumor cells

PU Sisi， ZHOU Chaohui， JIA Nengqin^*

（College of Chemistry and Materials Science，Shanghai Normal University，Shanghai 200234，China）

Abstract： Lots of studies showed that cancer metastasis is the main cause of 90% cancer mortality，and the number of circulating tumor cells （CTC） in body fluids such as peripheral blood and pleural fluid and so forth is closely related to the cancer metastasis and tumor node metastasis （TNM） staging.Therefore，CTC detection plays a pivotal role in preclinical diagnosis，prognosis，efficacy evaluation，and so on.This review summarizes the separation，enrichment and identification techniques for CTC detection based on the physical，dielectric and biological properties of CTC that are different from normal cells，and discusses the current progress and clinical application of CTC detection at home and abroad.In addition，the challenges and future prospect of CTC detection are discussed.

Key words： circulating tumor cells（CTC）; CTC detection; isolation and enrichment

0 引 言

在1869年，ASHWORTH^[1]首次報(bào)道了血液中存在與其患者腫瘤具有相同大小、形狀和外觀的上皮腫瘤細(xì)胞，即循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）.在實(shí)體腫瘤部位，腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮至間充質(zhì)的轉(zhuǎn)換 （EMT），E-鈣黏連蛋白表達(dá)降低，腫瘤細(xì)胞脫離，隨后內(nèi)滲進(jìn)入血管.多數(shù)CTC發(fā)生凋亡或被吞噬，只有不足0.01%的CTC可逃過人體自身免疫的捕殺，而腫瘤微栓子（CTM）的集體遷移及更高的存活率，使其更具有轉(zhuǎn)移和侵襲的潛力^[2].CTC隨著循環(huán)系統(tǒng)到達(dá)遠(yuǎn)端器官，再外滲出血管，找到合適的“土壤”，并發(fā)生黏附，進(jìn)行間充質(zhì)至上皮的轉(zhuǎn)換（MET），開始血管的生成及腫瘤細(xì)胞的增殖與生長，繼而發(fā)展成實(shí)體腫瘤，形成致死性轉(zhuǎn)移^[3].擴(kuò)散的腫瘤細(xì)胞甚至可以循環(huán)到骨髓中，并休眠于此，數(shù)年后，重新進(jìn)入血液形成繼發(fā)性轉(zhuǎn)移^[4].

目前，腫瘤診斷嚴(yán)重依賴于影像學(xué)檢測和組織切片，腫瘤細(xì)胞的脫落、侵襲并進(jìn)入血液循環(huán)是實(shí)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移的最初階段，為最終形成腫瘤轉(zhuǎn)移病灶提供了可能.由此可見，CTC檢測對于癌癥的早期診斷，以及檢測患者的術(shù)后復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移、評估療效與預(yù)后、選擇合適的個(gè)體化治療等方面具有重要的臨床意義，且能幫助理解CTC在外周血中的存活、吸附、侵襲等生物學(xué)行為，破譯腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制.通過綜述CTC富集技術(shù)及分析檢測技術(shù)，深入探討了CTC檢測的研究進(jìn)展及其面臨的挑戰(zhàn)，并對未來發(fā)展趨勢做出展望.

1 CTC分離富集技術(shù)

1.1 物理特性富集法

1.1.1 基于尺寸差異分離富集

“不死”腫瘤細(xì)胞的異常增殖，使其區(qū)別于正常細(xì)胞，具有較大的核質(zhì)比及細(xì)胞尺寸，且不同腫瘤細(xì)胞系的細(xì)胞平均直徑與白細(xì)胞直徑的比率不同^[5].而白細(xì)胞和紅細(xì)胞等正常血液細(xì)胞的尺寸較腫瘤細(xì)胞小，紅細(xì)胞直徑約為4～8 μm，白細(xì)胞尺寸約為6～19 μm.該差異為基于細(xì)胞尺寸差異的無生物標(biāo)記的分離富集提供可能.

基于尺寸的分離富集常采用8 μm孔徑的臨界尺寸（D），有效截留CTC，過濾除去尺寸較小的紅細(xì)胞、白細(xì)胞.2011年，TIBBE等^[6]在上皮腫瘤細(xì)胞過濾技術(shù) （ISET）平臺，采用氫氧化鈉刻蝕法制備具有8 μm孔徑的聚碳酸酯膜分選CTC，在4 h內(nèi)成功分離肺癌患者外周血中的CTC和CTM.為避免ISET技術(shù)中孔不均勻密度分布的缺點(diǎn)^[7]，具有體積小、易加工、無毒及易自動(dòng)化優(yōu)勢的微小型裝置被廣泛研究，如新月形隔離微結(jié)構(gòu)的微裝置^[8]、柔性微彈簧陣列裝置^[9]、蛇紋通道的微裝置^[10]等，實(shí)現(xiàn)了對CTC的高通量、高靈敏檢測.ZHENG等^[11]采用濕法刻蝕設(shè)計(jì)了圓形孔（D=11 μm）的聚對二甲苯膜微過濾器裝置，用于捕獲和電解人血液CTC，同時(shí)利用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）進(jìn)行基因組分析.除膜過濾，基于細(xì)胞尺寸差異捕獲的微流控芯片分離富集技術(shù)也廣受關(guān)注^[12-14].如圖1所示，KIM等^[15]通過離心處理血樣后，利用CAV1-EpCAM偶聯(lián)的微球，增大CTC與白細(xì)胞的尺寸差異，結(jié)合具有狹縫陣列的微流控芯片，自動(dòng)化分離富集CTC.

基于細(xì)胞尺寸差異進(jìn)行過濾富集CTC的技術(shù)避開了依賴于腫瘤細(xì)胞表面特異性抗原EpCAM的分離富集技術(shù)的局限，但在臨床應(yīng)用中也有缺陷.COUMANS等^[16]研究發(fā)現(xiàn)，從轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者、直腸癌患者、前列腺癌患者的全血中捕獲的CTC平均直徑為13.1，11.0，10.7 μm，比相應(yīng)腫瘤細(xì)胞系的細(xì)胞直徑小.PARK等^[17]研究發(fā)現(xiàn)，相比于實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的前列腺癌（prostate）細(xì)胞（13.38±2.54 μm），從前列腺癌患者外周血中分離出來的CTC具有更小的尺寸（7.97±1.81 μm），并且形狀更細(xì)長，核質(zhì)比也更高.因此，腫瘤細(xì)胞尺寸及其形變能力的異質(zhì)性，使得基于細(xì)胞尺寸差異的分選方法具有較低的特異性及靈敏性，且過濾高濃度的顆粒物容易導(dǎo)致堵塞.

1.1.2 密度梯度分離（DGC）

對于復(fù)雜的人類外周血，在每毫升約10⁷～10⁹個(gè)血液細(xì)胞中，除了極少量的CTC以外，還有大量的紅細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞，其密度各有不同.紅細(xì)胞密度為1.10～1.15 g·mL^-1，白細(xì)胞密度為1.07～1.09 g·mL^-1，而腫瘤細(xì)胞的密度相對白細(xì)胞較低.基于Stokes-Einstein公式，采用一定密度的等滲溶液，如Ficoll或Percoll細(xì)胞分離液，進(jìn)行密度梯度離心，將目標(biāo)細(xì)胞分離開來.

作為標(biāo)準(zhǔn)化的血液細(xì)胞分離方法，密度梯度離心雖操作簡單、成本低廉，但回收率低，且CTC純度低.GERTLER等^[18]將新型密度梯度離心系統(tǒng)OncoQuick^TM與標(biāo)準(zhǔn)密度梯度離心系統(tǒng)Ficoll進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)改良的OncoQuick^TM密度梯度離心系統(tǒng)，結(jié)合基于CTC尺寸差異分離方法，于離心管中放入多孔的過濾膜，從10 mL血液中分離出9.5×10⁴個(gè)單核細(xì)胞，只需轉(zhuǎn)移到1～2個(gè)載玻片上進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)評估，極大地減少了工作量，且提高了CTC檢出率.2004年，LARA等^[19]研究者結(jié)合密度梯度離心、陰性磁分選及過濾法富集CTC.先密度梯度離心除去大量的紅細(xì)胞，再用免疫磁分選除去大量的白細(xì)胞，最后通過過濾法過濾得到目標(biāo)細(xì)胞CTC，如圖2所示.該方法有效避免了腫瘤細(xì)胞的密度異質(zhì)性，將白細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞成功地區(qū)分開來.

1.1.3 介電泳場流分級分離（depFFF）

腫瘤細(xì)胞的特殊組成、形態(tài)及表型使其介電特性異于紅細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等血液細(xì)胞的介電性質(zhì).當(dāng)腫瘤細(xì)胞與血液細(xì)胞暴露在交變電場中，會(huì)發(fā)生不同的極化現(xiàn)象，從而具有不同的電動(dòng)效應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)區(qū)域分布，此時(shí)若再施加適當(dāng)?shù)耐獠苛ΓǔＭㄟ^流體流動(dòng)，洗除陰性細(xì)胞，便可截留下目標(biāo)細(xì)胞，這樣的方法即是基于CTC介電異質(zhì)性分離富集CTC的介電泳場流分級分離.

1995年，BECKER等^[20]采用17.6 mm×55.0 mm電極陣列的depFFF腔室，如圖3所示，利用介電親和力成功分離MDA-231乳腺癌細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)了95%以上的回收率.通過斷開電壓釋放被電泳力（DEP）截留的CTC，釋放的CTC細(xì)胞活性大于98%，并且對CTC的生長能力幾乎沒有影響.1997年，GASCOYNE等^[21]細(xì)化并擴(kuò)展了通過介電親和力進(jìn)行細(xì)胞分選的原理，并得出了可以評估最佳細(xì)胞分選條件和效率的表達(dá)式.2009年，GASCOYNE等^[22]設(shè)計(jì)了帶有3 000個(gè)相互交錯(cuò)的銅金電極元件的depFFF腔室（0.6 mm×25 mm×300 mm），實(shí)現(xiàn)了模擬小樣本的90%以上的腫瘤細(xì)胞回收率，并且能在15 min內(nèi)完成細(xì)胞分離.

基于腫瘤細(xì)胞介電特性，可以實(shí)現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞不同亞型的分離，且不需要對細(xì)胞進(jìn)行任何的修飾或處理，對CTC下游分析來說，這是關(guān)鍵且重要的.depFFF相比于磁分選，其分選效率、回收率都較高.通過該方法分離富集的未經(jīng)標(biāo)記的活腫瘤細(xì)胞可用于培養(yǎng)，并進(jìn)行所有分子類型的分析檢測.depFFF也可作為常規(guī)方法的輔助手段，以提高診斷和細(xì)胞分離應(yīng)用的總體分辨率、速度和效率.

1.2 親和性富集法

1.2.1 磁分選富集技術(shù)

區(qū)別于正常細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞表面會(huì)上調(diào)或下調(diào)相關(guān)抗原、蛋白質(zhì)表達(dá)量，如上皮腫瘤細(xì)胞表面的上皮細(xì)胞黏附分子（EpCAM）、乳腺癌細(xì)胞表面人類表皮生長因子受體2（HER2）、非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞表面表皮生長因子受體（EGFR）等，而正常細(xì)胞表面低表達(dá)，甚至不表達(dá).再如白細(xì)胞表面特異性表達(dá)白細(xì)胞共同抗原（如CD45抗原），則在腫瘤細(xì)胞中不表達(dá).磁分選富集技術(shù)，即基于這樣的生物學(xué)特征，在具有超順磁性的顆粒表面偶聯(lián)特異性抗體，如抗-上皮細(xì)胞黏附分子（EpCAM抗體/anti-EpCAM）、靶向腫瘤細(xì)胞，在外加磁場的作用下，腫瘤細(xì)胞被吸引而滯留在磁場中，從而分離出目標(biāo)細(xì)胞（陽性分選），或是通過抗白細(xì)胞共同抗原的CD45抗體移除血液中的白細(xì)胞、巨核細(xì)胞及血小板（陰性分選）.基于免疫學(xué)方法對CTC進(jìn)行富集，具有極高的特異性.

唯一被美國食品藥品管理局（FDA）批準(zhǔn)的CellSearch^TM（Veridex）半自動(dòng)檢測系統(tǒng)，通過免疫鐵磁流體靶向CTC表面的EpCAM抗原，從全血中分選CTC，然后對CTC進(jìn)行腫瘤標(biāo)記染色并使用熒光顯微鏡計(jì)數(shù)，能可靠地檢測出血液中的CTC，適用于臨床實(shí)驗(yàn)室對轉(zhuǎn)移性乳腺癌、結(jié)直腸癌和前列腺癌患者的常規(guī)評估^[23-24].且聯(lián)合抗-細(xì)胞角蛋白（CK抗體）、EpCAM抗體捕獲，能顯著提升CellSearch系統(tǒng)的靈敏度^[24].此外，亦有多種技術(shù)平臺基于免疫磁分選技術(shù)富集CTC，如MagSweeper^[25]、磁激活細(xì)胞分選技術(shù)（MACS）^[26].除了anti-EpCAM特異性識別分子，周朝輝等^[27]設(shè)計(jì)了anti-EGFR抗體偶聯(lián)的免疫磁珠，結(jié)合磁分選技術(shù)與免疫熒光技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對非小型肺癌細(xì)胞A549的檢測.

以上方法均在體外捕獲CTC，2008年哈佛醫(yī)學(xué)院的VERMESH等^[28]開發(fā)了柔性磁力“魚線”（MagWIRE），希望能直接在患者靜脈血管中富集CTC，如圖4所示.他們選擇在活豬的耳靜脈血管中模擬“磁釣”癌細(xì)胞，MagWIRE成功捕獲了循環(huán)腫瘤細(xì)胞，并且回收了34%的免疫磁珠，該“磁釣”CTC的回收率是體外磁分選CTC的10～80倍.

中國科學(xué)院國家納米科學(xué)中心研究院PENG等^[29-31]開發(fā)了擁有獨(dú)立知識產(chǎn)權(quán)的新技術(shù)“腫瘤捕手”.通過篩選特異性多肽，并巧妙地組裝到納米磁珠表面，克服了抗體磁珠的位點(diǎn)少、方向性差、靶向性差的缺點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了在模擬血液中大于80%的CTC捕獲率，而傳統(tǒng)的抗體磁珠捕獲率僅在30%左右.2015年，中國科學(xué)院HUANG等^[32]以免疫活細(xì)胞為生物模板，并結(jié)合表面化學(xué)，仿生制備了“Smart”免疫磁珠，實(shí)現(xiàn)對CTC的高靶向效率，比商業(yè)化的磁珠（Dynabeads M280，Invitrogen）具有更高的捕獲率，并通過可切割的二硫鍵，按需釋放捕獲的活腫瘤細(xì)胞.

綜上所述，基于抗體-抗原識別的免疫磁分選技術(shù)具有極高的特異性，但也較為耗時(shí)耗財(cái).由于其依賴于腫瘤細(xì)胞表面特異性抗原的表達(dá)，CTC的異質(zhì)性也影響了該技術(shù)對CTC的分選效率.

1.2.2 微流控芯片技術(shù)

近年來，基于CTC物理特性和生化特性的免疫微流控芯片受到廣泛重視.2007年，NAGRATH等^[33]構(gòu)筑了微柱“CTC-chip”芯片，通過化學(xué)方法將anti-EpCAM抗體修飾到微柱陣列表面，在116個(gè)癌癥患者中成功檢測出115個(gè)癌癥轉(zhuǎn)移患者，并在7例早期癌癥患者的外周血中均檢測到CTC，每毫升外周血中CTC數(shù)量在5～1 281個(gè)變化（純度為50%）.STOTT等^[34]設(shè)計(jì)的人骨形免疫（anti-EpCAM）芯片“HB-Chip”，從15位轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者中檢測出14位的外周血中有CTC（檢出率為93%）.麻省理工學(xué)院的PARK等^[35]將金納米顆粒應(yīng)用到HB-Chip芯片中（NP-^HBCTC-Chip），采用谷胱甘肽（GSH）通過化學(xué)配體交換實(shí)現(xiàn)競爭反應(yīng)，釋放高活性的CTC，為后續(xù)的RNA基因測序等研究提供便利.改良的人骨形芯片的微通道使流體產(chǎn)生微渦流，以增加腫瘤細(xì)胞與芯片表面抗體的接觸機(jī)會(huì)，從而實(shí)現(xiàn)了高通量、高靈敏及高特異性的捕獲CTC，且能檢出之前不被重視的細(xì)胞團(tuán)簇.2014年，KARABACAK等^[36]設(shè)計(jì)的CTC-iChip芯片利用確定性側(cè)向位移（DLD）原理及慣性聚焦，在一個(gè)平臺上實(shí)現(xiàn)兩步法分選CTC，如圖5所示.在模組1利用確定性側(cè)向位移（DLD）原理，將血液紅細(xì)胞進(jìn)行分離棄除;在模組2使用磁泳法分離出CD45功能化磁珠標(biāo)記的白細(xì)胞，分選CTC.CTC-iChip可處理8 mL·h^-1全血，回收（97±2.7）%的癌細(xì)胞.

此外，捕獲界面的納米結(jié)構(gòu)在微流控芯片中也被廣泛研究.如利用混沌混合器使流體產(chǎn)生垂直流向，結(jié)合二氧化硅（SiO₂）三維納米結(jié)構(gòu)高效捕獲CTC^[37].2018年CUI等^[38]通過正硅酸四乙酯原位水解法，在生物芯片表面生長SiO₂納米陣列，以促進(jìn)生物芯片與CTC微絨毛及絲狀偽足之間的地形相互作用，協(xié)同特異性靶向作用捕獲CTC.實(shí)驗(yàn)證明，相比光滑的表面，納米線修飾的具有納米結(jié)構(gòu)的表面對CTC具有更高的捕獲率（85.4±8.3）%.如圖6所示，人體前列腺癌細(xì)胞PC-3與光滑表面的接觸面積很小，而在納米三維結(jié)構(gòu)的界面上，PC-3伸出更多偽足與界面相互作用，并鋪展開來.

相比于傳統(tǒng)方法，微流控芯片結(jié)合親和分選方法，利用流體動(dòng)力學(xué)分離細(xì)胞，具有更高的分辨率和靈敏度，易實(shí)現(xiàn)單個(gè)CTC分選及檢測工作，操作簡單高效，且盡可能地避免了人為誤差.但該方法與免疫磁分選類似，篩選靶向目標(biāo)細(xì)胞的特異性抗體是該技術(shù)難點(diǎn)及瓶頸.

2 CTC的分析檢測技術(shù)

2.1 免疫熒光染色檢測

免疫熒光檢測法作為傳統(tǒng)CTC鑒定方法，即將熒光素偶聯(lián)的熒光抗體與腫瘤細(xì)胞進(jìn)行抗體抗原特異性反應(yīng)，在熒光顯微鏡下觀察，借此對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行鑒定及定位.在CellSearch系統(tǒng)中，通過結(jié)合CD45綠色熒光抗體（靶向白細(xì)胞）、CK8/18/19紅色熒光抗體（靶向腫瘤細(xì)胞）與細(xì)胞核DAPI藍(lán)色熒光染色劑對CTC進(jìn)行熒光識別鑒定^[23-24].具有紅色和藍(lán)色熒光，無綠色熒光（CK⁺/CD45^-/DAPI⁺）的細(xì)胞鑒定為CTC，具有綠色和藍(lán)色熒光，無紅色熒光（CK^-/CD45⁺/DAPI⁺）的細(xì)胞則是白細(xì)胞，如圖7所示^[39].該方法是大部分實(shí)驗(yàn)室采用的CTC鑒定方法，通過免疫熒光鑒定CTC表面相關(guān)特異性蛋白的表達(dá).該檢測方法具有耐污染的優(yōu)勢，但易產(chǎn)生假陽性結(jié)果，且操作復(fù)雜、耗時(shí)耗力，因此不宜大規(guī)模使用.

2.2 核酸分析檢測

近年來，基于CTC中核酸的分子分析方法被不斷開發(fā)用于CTC鑒定.定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）作為一種被廣泛使用的檢測手段，可在10⁶個(gè)白細(xì)胞的復(fù)雜背景下檢測到一個(gè)CTC，并定量CTC相關(guān)基因的表達(dá)情況.CK-19-mRNA作為CTC的特異性核酸序列，是RT-qPCR定量檢測的普遍目標(biāo)^[40].STATHOPOULOU等^[41-42]采用LightCycler^TM（Roche）系統(tǒng)，通過優(yōu)化擴(kuò)增引物，實(shí)時(shí)地定量檢測外周血中CK-19-mRNA，極大提高了檢測的特異性和靈敏性.Multiplex-RT-qPCR可以在一個(gè)樣本中同時(shí)評估多個(gè)目標(biāo)分子（如：EpCAM，MUC-1，HER2等），這有利于對有限的CTC進(jìn)行更高靈敏度的檢測^[43]，如圖8所示.甲基化特異性基因聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（MSP）的出現(xiàn)也證明了CTC多參數(shù)檢測的重要性^[44].

通過熒光素標(biāo)記的DNA探針與CTC細(xì)胞核內(nèi)的DNA靶序列雜交，從而獲得核內(nèi)染色體或基因拷貝狀態(tài)的相關(guān)信息的熒光原位雜交（FISH）法，可用于評估乳腺癌、前列腺癌患者CTC中的HER2的表達(dá)情況^[45-46]，及ALK基因的復(fù)制數(shù)量^[47].相比于PCR，F(xiàn)ISH具有較高的抗污染能力，且重復(fù)性好.

總之，相比于免疫熒光成像，核酸分析更客觀、可量化、成本低，不需要專門的檢驗(yàn)師評估，易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化及標(biāo)準(zhǔn)化.核酸檢測可以確定與治療相關(guān)的分子靶標(biāo)，如：基因突變、染色體易位等，從而指導(dǎo)患者的個(gè)性化治療.但是，由于CTC的異質(zhì)性，分子分析法無法對CTC個(gè)數(shù)進(jìn)行絕對定量.

2.3 光學(xué)分析檢測

稀土發(fā)光材料的熒光信號亦被應(yīng)用于CTC檢測.2015年，WANG等^[37]結(jié)合上轉(zhuǎn)換磁性復(fù)合免疫材料（NaYF₄-Fe₃O₄-Ab）及硅納米線整合的芯片，進(jìn)行CTC捕獲，實(shí)現(xiàn)近紅外（980 nm）上轉(zhuǎn)換熒光（UCL）成像.2019年，GUO等^[48]結(jié)合時(shí)間分辨光致發(fā)光技術(shù)（TRPL技術(shù)）和稀土納米材料（NaEuF₄-Ab）溶解增強(qiáng)熒光放大技術(shù)，通過100 ?s的延遲，大大消除了短周期背景信號，提高了信噪比，首次實(shí)現(xiàn)了全血中CTC的高靈敏直接檢測，如圖9所示.

基于材料的熒光信號檢測，極大簡化了操作過程，精準(zhǔn)靈敏，且較為客觀.但由于該方法需要對細(xì)胞進(jìn)行特異性熒光材料的孵育，易造成樣品污染，細(xì)胞存活率也低.

2.4 拉曼檢測

拉曼檢測多用于分子層面的檢測，近年來，由于拉曼檢測具有信號穩(wěn)定、檢測限低、靈敏度高的優(yōu)勢，其在CTC檢測領(lǐng)域被廣泛關(guān)注.利用特異性靶向磁珠及表面增強(qiáng)拉曼（SERS）探針與CTC形成三明治夾結(jié)構(gòu)是研究者普遍選擇的方法，實(shí)現(xiàn)對CTC的拉曼檢測^[49-50].XUE等^[51]則合成金納米粒子（Au NPs）包裹的超順磁性納米球（SPION-PEI），并采用巰基苯甲酸（MBA）、還原性牛血清蛋白（r-BSA）與葉酸（FA）進(jìn)行層層修飾，巧妙設(shè)計(jì)了SPION-PEI @ Au NPs-MBA-r-BSA-FA復(fù)合SERS探針，實(shí)現(xiàn)了對宮頸癌患者的CTC（檢測限為1個(gè)·mL^-1）的捕獲檢測及釋放，如圖10所示.

研究表明，該方法有效避開了免疫熒光檢測的光降解及光漂白劣勢，靈敏度可以與RT-qPCR相媲美，制樣簡單，測量高效準(zhǔn)確.但由于CTC在外周血中極少，這對SERS探針的設(shè)計(jì)提出了更高的要求，且設(shè)備昂貴.

2.5 其他分析檢測方法

除上述CTC檢測方法，研究者亦將電化學(xué)傳感器應(yīng)用于CTC檢測.如圖11所示，HU等^[52]將通過生物模板法合成的牛血清蛋白包裹的銀納米微球（Ag@BSA）負(fù)載于金電極上，構(gòu)筑了新型的細(xì)胞傳感器，靈敏檢測了人口腔表皮樣癌細(xì)胞（KB瘤細(xì)胞），實(shí)現(xiàn)了電化學(xué)方法檢測CTC（檢測限：20個(gè)·mL^-1KB細(xì)胞）.為提高電化學(xué)檢測靈敏度，QU等^[53]構(gòu)建了一個(gè)兩種特異性適配體修飾（ss-TLS1c，ds-TLS11a）的超靈敏電化學(xué)傳感器.電化學(xué)檢測具有檢測方便、靈敏度高的優(yōu)勢，且易實(shí)現(xiàn)便攜式儀器檢測，在CTC檢測的臨床應(yīng)用中具有廣闊的應(yīng)用前景.此外，其他檢測方法如酶聯(lián)免疫檢測（ELISA）也被應(yīng)用于CTC檢測^[54].KIM等^[55]利用四氧化三鐵（Fe₃O₄）納米顆粒及鉑（Pt）納米顆粒的協(xié)同催化效應(yīng)，將兩者負(fù)載在氧化石墨烯（GO）上，制備特異性抗體修飾的納米復(fù)合材料，通過3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）催化顯色，實(shí)現(xiàn)比色檢測CTC.但該方法靈敏度有限，且對樣品純度要求高，其捕獲效率還有待提高.總的來說，以上檢測方法為CTC檢測開拓了新思路.

3 CTC檢測面臨的挑戰(zhàn)及展望

目前，基于腫瘤細(xì)胞的物理電學(xué)特性進(jìn)行分離的技術(shù)缺乏特異性，因此聯(lián)合利用CTC的物理及生物特性，結(jié)合蛋白及核酸分析，可實(shí)現(xiàn)對CTC的高效精準(zhǔn)捕獲及檢測.

然而，CTC檢測面臨的挑戰(zhàn)也不容忽視.首先，CTC在復(fù)雜的血液背景下，含量極少.且CTC具有異質(zhì)性，沒有一種抗體能特異性100%靶向某種腫瘤細(xì)胞，只有約60%的CTC攜帶著生源實(shí)體腫瘤的生物信息.由于CellSearch僅適用于少數(shù)類型的癌癥，且檢測靈敏度不高，無法分離活的CTC，因而較大程度地限制了其在臨床檢測中的有效應(yīng)用.為應(yīng)對該挑戰(zhàn)，有研究聯(lián)合使用多種抗體，對腫瘤細(xì)胞表面抗原進(jìn)行表達(dá)分型，實(shí)現(xiàn)更高靈敏性檢測.或是尋找新的蛋白，如肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白（plastin-danbai）^[56].最后，抗體定向偶聯(lián)亦是CTC檢測面臨的一項(xiàng)技術(shù)挑戰(zhàn).抗體取向決定著抗原結(jié)合位點(diǎn)的活性，也就決定著材料或設(shè)備對腫瘤細(xì)胞的靶向能力^[57-58]，抑或是用分子更小的特異性靶向多肽替換抗體，實(shí)現(xiàn)更高靈敏度的檢測^[29-30].此外，尋找具有腫瘤特異性的其他生物標(biāo)志物也是研究的熱點(diǎn).腫瘤來源外泌體相比于CTC，是具有脂質(zhì)雙分子層膜結(jié)構(gòu)的小囊泡，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，尺寸小（30～150 nm），且量多.外泌體參與細(xì)胞通信、遷移，促血管新生和抗腫瘤免疫等生理過程，與多種疾病的發(fā)生和進(jìn)程密切相關(guān)^[59].2016年，在液體活檢領(lǐng)域，基于一種新的生物標(biāo)志物，外泌體的腫瘤診斷產(chǎn)品首次在美國上市^[60].因此，作為CTC的替代與補(bǔ)充，腫瘤來源的外泌體的檢測對于腫瘤早期預(yù)警具有很大的臨床應(yīng)用前景.

總的來說，CTC檢測具有很大潛力，基于理論技術(shù)和深入探索，仍有望實(shí)現(xiàn)對CTC的高靈敏度、高特異性、高通量及高活性的分選，達(dá)到精準(zhǔn)檢測.

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（責(zé)任編輯：郁 慧，包震宇）

收稿日期： 2019-12-12

基金項(xiàng)目： 上海市地方院校能力建設(shè)專項(xiàng)（17070503000）

作者簡介： 蒲思思（1993—），女，碩士研究生，主要從事納米生物技術(shù)方面的研究.E-mail：Pss_Anita@163.com

通信作者： 賈能勤（1970—），男，教授，主要從事生物電化學(xué)、生物傳感器和納米生物技術(shù)方面的研究.E-mail： nqjia@shnu.edu.cn

引用格式： 蒲思思，周朝輝，賈能勤.循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離富集與分析檢測技術(shù)的研究進(jìn)展 [J].上海師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2020，49（2）：219-233.

Citation format：?PU S S，ZHOU C H，JIA N Q.Research progress on isolation，enrichment and detection of circulating tumor cells [J].Journal of Shanghai Normal University（Natural Sciences），2020，49（2）：219-233.