顧冬雪，谷 秀，張雪云

0 引言

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種以慢性氣道炎癥為本質(zhì)的慢性氣道疾病，表現(xiàn)為不完全可逆的氣流受限，嚴(yán)重者伴有呼吸衰竭，乃至死亡。近年來(lái)COPD的發(fā)病率不斷增加，其發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，確切病因不清楚，因目前還沒有特效藥物能遏制其病情的進(jìn)行性發(fā)展，亟待尋找有效的可逆轉(zhuǎn)病情的治療藥物。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素是臨床中較為常用的抗感染藥物，但目前諸多研究闡明了該類藥物的抗感染之外的抗炎作用，尤其是作用于慢性氣道性疾病，如彌漫性泛細(xì)支氣管炎等[1]；目前亦有研究顯示了其在COPD中的抗炎作用[2]，筆者前期的研究顯示，小劑量紅霉素可通過(guò)MAPK途徑抑制煙霧誘導(dǎo)的大鼠肺氣腫的形成[3]。但目前對(duì)于紅霉素作用于肺氣腫形成及發(fā)展的機(jī)制尚未完全明確。低氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)是機(jī)體在低氧等條件下產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄因子，維持著體內(nèi)氧穩(wěn)態(tài)，可調(diào)控與血管生成、糖代謝、細(xì)胞增殖等相關(guān)的多種基因表達(dá)[4]。近年來(lái)，國(guó)外對(duì)HIF-1α的研究顯示，其與炎癥反應(yīng)有密切的聯(lián)系[5]，諸多研究顯示，HIF-1α可能參與了炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展。本文通過(guò)香煙煙霧誘導(dǎo)大鼠慢性氣道炎癥模型，給予紅霉素干預(yù)后，觀察HIF-1α的改變及其機(jī)制。

1 研究方法

1.1 動(dòng)物模型的制備 所有實(shí)驗(yàn)均按照中國(guó)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物研究倫理委員會(huì)的指導(dǎo)進(jìn)行。從中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心獲得雄性Wistar大鼠[9～10周齡，(200±18)g]，在SPF飼養(yǎng)環(huán)境中飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于實(shí)驗(yàn)前1周開始飼養(yǎng)。大鼠分籠(每籠10只)飼養(yǎng)，室溫維持在23～26 ℃左右，飼養(yǎng)期間大鼠自由攝食及飲水，室內(nèi)光線12 h規(guī)則變化。大鼠隨機(jī)分為3組,每組8只：正常對(duì)照組(C組),香煙煙霧模型組(CS組),紅霉素+香煙煙霧模型(ERY+CS組)。CS組大鼠暴露于16支香煙(萬(wàn)寶路;美國(guó)紐約州;每支香煙中含有0.9 mg尼古丁，14 mg一氧化碳和12 mg焦油)煙霧中;煙霧鏡v/V%為8%)，每天2次，每周6 d，共12周，每次30 min，然后將濾網(wǎng)移除。ERY+CS組大鼠暴露于CS 12周，每天口服1次ERY(Sigma-Aldrich；Merck，德國(guó))灌胃，劑量為100 mg/kg。從12周暴露期的第1天開始，在香煙煙霧暴露前0.5 h進(jìn)行藥物治療。對(duì)照組每天鹽水作為對(duì)照灌胃。每天觀察各組大鼠被毛、活動(dòng)性、飲食、咳嗽等一般情況。在第12周結(jié)束時(shí)，在麻醉下[40 mg/kg戊巴比妥(Sigma-Aldrich；Merck，德國(guó))]腹腔注射后放血處死大鼠，分離肺組織。取右葉保存于-80 ℃。大鼠肺的左葉(未灌洗)在含5 mM CaCl2+1 mM MgCl2的冰冷鹽水中短暫洗滌，中性甲醛固定。通過(guò)結(jié)扎右主支氣管，對(duì)大鼠進(jìn)行左側(cè)單側(cè)肺灌洗，每次2 ml生理鹽水，灌洗肺泡3次后回抽放入EP管中，再抽取生理鹽水2 ml重復(fù)上述動(dòng)作2次，每次灌洗后立即回吸，反復(fù)共3次，最終的回收量約為4.5 ml肺泡灌洗液(BALF)(回收率約75%)，將所有回吸液置于10 ml EP管中，立即進(jìn)行離心，1 000 r/min，離心10 min，留取上清液，棄去細(xì)胞沉渣。分裝保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 病理學(xué)評(píng)估 肺組織經(jīng)固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，切片厚度為4 μm。切片后經(jīng)脫蠟，梯度酒精復(fù)水，HE染色，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。計(jì)算標(biāo)本平均肺泡數(shù)(MAN)及肺平均內(nèi)襯間隔(MLI)：每組選取3只典型大鼠進(jìn)行病理切片及HE染色，每張切片隨機(jī)鏡檢3個(gè)視野，在視野中心劃十字交叉線，計(jì)算劃線總長(zhǎng)(L)、測(cè)量的視野面積(S)、計(jì)數(shù)與交叉線相交的肺泡隔數(shù)(NS)，以及計(jì)數(shù)各視野的肺泡總數(shù)(Na)，平均肺泡數(shù)MAN=Na/S；平均內(nèi)襯間隔MLI=L/NS，表示肺泡平均內(nèi)徑；二者用于測(cè)量大鼠肺氣腫的病理學(xué)嚴(yán)重程度。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測(cè)定BALF中TNF-α及IL-8含量 按照ELISA試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行操作，測(cè)定BALF中TNF-α及IL-8的含量。

1.4 免疫組化及Western檢測(cè)肺組織HIF-1α的表達(dá) 免疫組化染色按S-P試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。右肺上葉用RIPA緩沖液(CST，馬薩諸塞州，美國(guó))以100 mg組織∶1 ml裂解緩沖液的比例溶解。隨后4 ℃離心，條件為1 500×g，20 min。定蛋白后等量上樣，SDS-PAGE分離，隨后通過(guò)電印跡將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將膜在室溫下用封閉緩沖液[含0.1%Tween-20的3%脫脂牛奶在TBS(pH 7.4)]中封閉1 h，隨后在4 ℃下與抗HIF-Aα或β-actin的抗體孵育過(guò)夜，洗膜后二抗孵育2 h，使用Enhanced Chemiluminescence Plus試劑盒，并使用Las-3000發(fā)光圖像分析儀(Fujifilm，日本東京)進(jìn)行分析。使用Image J軟件對(duì)條帶強(qiáng)度進(jìn)行定量。相對(duì)于對(duì)照組中的水平計(jì)算蛋白質(zhì)表達(dá)的倍數(shù)變化。

1.5 大鼠肺功能測(cè)定 依據(jù)文獻(xiàn)描述[6]測(cè)定0.3 s用力呼氣量(FEV0.3)以及0.3 s用力呼氣量占用力肺活量比值(FEV0.3/FVC)。給予大鼠10%水合氯醛麻醉后，暴露氣管，置入Y型導(dǎo)管，描記大鼠平靜呼吸，在1次呼氣末注射6 ml空氣后，快速脫開，記錄FEV0.3及FEV0.3/FVC。

2 結(jié)果

2.1 病理形態(tài)學(xué)改變 在大體標(biāo)本中，與C組相比較，CS組大鼠肺體積明顯增大，表面蒼白，局部可見肺大皰。使用紅霉素干預(yù)后，肺部肺氣腫改變明顯好轉(zhuǎn)(圖1A～圖1C)。

對(duì)比顯微鏡下病理學(xué)改變可見，與C組相對(duì)比，CS組大鼠氣道黏膜纖毛上皮倒伏，有不同程度的脫落，氣道被膜下腺體增生、肥大，杯狀細(xì)胞增多以及黏膜上皮形態(tài)改變，由柱狀逐漸扁平化，出現(xiàn)局部鱗狀上皮化生。肺內(nèi)氣道壁及小血管周圍肺泡區(qū)周圍有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡管、肺泡囊及肺泡明顯擴(kuò)大，肺泡壁可見斷裂。ERY+CS組可見肺氣腫形態(tài)的改善(圖1D～圖1I)。各組間MLI及MAN改變?nèi)鐖D1G～圖1H所示。與C組相比，CS組MLI及MAN均明顯擴(kuò)大(P<0.05)；與CS組相比，ERY+CS組MLI及MAN均明顯好轉(zhuǎn)(P<0.05)。

圖1 紅霉素對(duì)香煙煙霧誘導(dǎo)大鼠肺氣腫改變的影響

2.2 BALF中TNF-α、IL-8蛋白的表達(dá)及大鼠肺功能結(jié)果 與C組比較，CS組大鼠BALF中炎癥介質(zhì)TNF-α及IL-8表達(dá)均明顯增高(P<0.01)；經(jīng)紅霉素干預(yù)后，炎癥介質(zhì)TNF-α及IL-8表達(dá)有所降低(P<0.01)，見圖2A～圖2B。香煙煙霧暴露后，大鼠肺功能呈現(xiàn)明顯的阻塞性通氣功能障礙，F(xiàn)EV0.3及FEV0.3/FVC均降低(P<0.01)；經(jīng)紅霉素干預(yù)治療后，大鼠肺功能明顯改善(P<0.01)，見圖2C～圖2D。

圖2 紅霉素對(duì)香煙煙霧誘導(dǎo)大鼠肺功能及BALF中炎癥介質(zhì)表達(dá)的影響

2.3 HIF-1α表達(dá)結(jié)果 免疫組化及Western blot結(jié)果表明，香煙煙霧誘導(dǎo)后；大鼠肺氣腫組織中HIF-α蛋白表達(dá)均明顯增高(P<0.01)；紅霉素干預(yù)后，香煙煙霧誘導(dǎo)的HIF-α的增高較前降低(P<0.05)。見圖3。

圖3 紅霉素對(duì)香煙煙霧誘導(dǎo)大鼠HIF-1α表達(dá)的影響

3 討論

HIF-1是細(xì)胞在缺氧條件下產(chǎn)生的一種轉(zhuǎn)錄因子，HIF-1由條件性表達(dá)的HIF-1α和結(jié)構(gòu)性表達(dá)的HIF-1β兩個(gè)亞基組成，HIF-1α是其活性亞基，對(duì)氧分壓較敏感，正常氧分壓環(huán)境中HIF-1α極不穩(wěn)定，容易降解，難以檢測(cè)[7]。低氧環(huán)境下，脯氨酸羥化酶活性被抑制，HIF-1α降解被抑制，從而轉(zhuǎn)移至胞核內(nèi)，與HIF-1β形成HIF-1分子，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子作用來(lái)調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)[7]。

近年來(lái)國(guó)外對(duì)HIF-1α的研究顯示，其與炎癥反應(yīng)有密切的聯(lián)系，機(jī)體乏氧后注射LPS，大鼠肺泡內(nèi)間隔中性粒細(xì)胞數(shù)增高，炎癥反應(yīng)更為明顯，LPS給藥6 h后，肝臟HIF-1α表達(dá)增加，3 h后血清IL-1β和CRP水平升高[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，煙熏誘導(dǎo)肺氣腫模型大鼠肺組織中HIF-1α蛋白表達(dá)呈陽(yáng)性，其表達(dá)水平與TNF-α呈正相關(guān)，與大鼠肺功能呈負(fù)相關(guān)，提示在煙霧暴露下也可使HIF-1α表達(dá)，HIF-1α可能參與了COPD慢性炎癥的發(fā)生、發(fā)展。與本研究結(jié)果相似，一項(xiàng)研究對(duì)比了COPD及非COPD患者的肺組織，COPD患者的肺組織中HIF-1α表達(dá)增加，且與VEGF及其受體的表達(dá)呈正相關(guān)[9]。另外，HIF-1α的表達(dá)增加反映了COPD的嚴(yán)重程度[9]。通過(guò)檢測(cè)患者BALF中HIF-1α、EGFR及炎癥因子的表達(dá)以及細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HIF-1α在COPD中過(guò)表達(dá)，通過(guò)激活EGFR/PI3K/AKT途徑上調(diào)了炎癥因子的表達(dá)[10]。COPD的肺部炎癥誘導(dǎo)激活的EGFR/PI3K/AKT通路進(jìn)一步上調(diào)了反饋環(huán)中的HIF-1α表達(dá)，從而加劇了COPD的病理變化[10]。

迄今為止，多項(xiàng)基于大環(huán)內(nèi)酯類藥物應(yīng)用于COPD患者的研究均顯示，大環(huán)內(nèi)酯類藥物治療可顯著減輕病情，可能有助于減輕這一群體的疾病負(fù)擔(dān)[11-13]。此外，與其他藥物共同使用時(shí)，紅霉素可以通過(guò)抑制PI3K/AKT途徑和增強(qiáng)HDAC2的活性來(lái)增強(qiáng)COPD模型大鼠中布地奈德的抗炎活性[14]。鑒于此，本研究對(duì)比分析了煙霧暴露后的大鼠肺氣腫經(jīng)紅霉素干預(yù)后的效果及潛在機(jī)制。結(jié)果表明，應(yīng)用紅霉素口服治療后，大鼠肺功能、肺部炎癥介質(zhì)以及氣腫病理改變均得到改善，由香煙煙霧所誘導(dǎo)的HIF-1α增高也得到抑制，從而對(duì)肺部的炎癥及損傷起到保護(hù)性作用，且可能通過(guò)HIF-1α調(diào)控了相應(yīng)的靶基因表達(dá)，從而發(fā)揮保護(hù)性作用。

綜上，小劑量紅霉素可通過(guò)調(diào)控抑制肺部HIF-1α的表達(dá)，從而發(fā)揮對(duì)香煙煙霧誘導(dǎo)的肺氣腫的保護(hù)性作用，進(jìn)而改善患者的肺部炎癥反應(yīng)，改善肺功能，發(fā)揮抗炎作用。