王慶哲，張恩崇，鞠培新，宋永勝

0 引言

目前，前列腺癌是男性健康中面臨的重大問題，在男性癌癥死亡原因中排名第2位[1-2]。治療手段主要有主動(dòng)監(jiān)測、手術(shù)治療、局部放射治療、內(nèi)分泌治療、化療等。藥物治療是癌癥治療環(huán)節(jié)中不可或缺的部分，因此，研究出有效的藥物治療方案是亟須解決的問題。天然化合物具有安全有效、毒性低、抗氧化等優(yōu)勢，因此，從自然化合物出發(fā)探索藥物治療方案具有重要的意義[3]。

月桂酸是富含在椰子油中的中鏈飽和脂肪酸，具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的抗癌效應(yīng)[4]。姜黃二酮是姜黃中提取的化合物，在乳腺癌的治療中已得到有效應(yīng)用[5]。介于腫瘤發(fā)病因素復(fù)雜等原因，目前聯(lián)合用藥優(yōu)于單藥效果基本已成為共識(shí)。

本研究聯(lián)合分析月桂酸和姜黃二酮，探索前列腺癌中新型有效的治療靶點(diǎn)。應(yīng)用BATMAN-TCM(a Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechANism of Traditional Chinese Medicine)數(shù)據(jù)庫分別預(yù)測月桂酸和姜黃二酮作用的靶蛋白，然后使用一系列生物信息學(xué)分析方法和工具(見圖1)，最終發(fā)現(xiàn)BDKRB2基因與前列腺癌發(fā)生與發(fā)展的關(guān)系。

圖1 流程圖

1 材料和方法

1.1 預(yù)測月桂酸和姜黃二酮靶蛋白基因 應(yīng)用BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫[6]預(yù)測月桂酸和姜黃二酮的靶蛋白基因。在預(yù)測靶蛋白基因的過程中，該數(shù)據(jù)庫利用化合物的結(jié)構(gòu)，確定各個(gè)官能團(tuán)，再通過對(duì)靶蛋白結(jié)構(gòu)中的各個(gè)官能團(tuán)進(jìn)行比對(duì)，確定化合物以及其對(duì)應(yīng)靶蛋白之間的作用關(guān)系。圖2中展示了月桂酸和姜黃二酮的2D和3D結(jié)構(gòu)。在BATMAN-TCM的化合物分析模塊中，依次輸入月桂酸和姜黃二酮的英文名稱，分別獲取各自的靶向蛋白基因。然后對(duì)月桂酸和姜黃二酮的靶蛋白基因取交集，得到共同靶蛋白基因。

圖2 月桂酸和姜黃二酮結(jié)構(gòu)

1.2 在metascape中對(duì)共同靶蛋白基因進(jìn)行功能富集分析 采用metascape(http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)數(shù)據(jù)庫[6-7]。將上述步驟獲取的月桂酸以及姜黃二酮的共同靶蛋白基因作為基因集，輸入到metascape數(shù)據(jù)庫中，識(shí)別出所有具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的富集選項(xiàng)。然后根據(jù)每個(gè)富集選項(xiàng)中基因的Kappa相似性，將各個(gè)富集選項(xiàng)整理為網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。選擇Kappa相似性大于0.3作為閾值來連接各個(gè)富集選項(xiàng)。

1.3 選擇關(guān)鍵基因 在“1.2”項(xiàng)中得到了共同靶蛋白基因的富集分析結(jié)果，根據(jù)富集分析得分，對(duì)結(jié)果進(jìn)行降序排列，然后選擇排名前20位的結(jié)果。然后在這20個(gè)富集選項(xiàng)中選擇與前列腺癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的結(jié)果，并進(jìn)行取交集操作，最終獲得本研究中的關(guān)鍵基因。

1.4 檢驗(yàn)關(guān)鍵基因在前列腺癌腫瘤組織與正常組織之間表達(dá)量差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 采用Gene Expression Profiling Interactive Analysis(GEPIA)(http://gepia.cancer-pku.cn/)數(shù)據(jù)庫[6-8]。將關(guān)鍵基因輸入到GEPIA數(shù)據(jù)庫中，設(shè)定|Log2FC|>1以及P>0.01為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的條件。最終獲取在前列腺癌腫瘤組織以及正常組織之間表達(dá)量具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的基因。

1.5 探究BDKRB2基因在前列腺癌中的生物學(xué)意義BDKRB2基因可能作為前列腺癌的治療靶點(diǎn)，為了探索其在前列腺癌中的生物學(xué)意義，本研究對(duì)BDKRB2基因進(jìn)行了生存分析、時(shí)間依賴性接受者操作特征曲線(Tme-dependent receiver operating characteristic curve,tdROC)分析。在生存分析中，確定無病生存時(shí)間(Disease-free survival,DFS)表示患者預(yù)后，使用Log-rank檢驗(yàn)以及COX回歸分析進(jìn)行生存分析，選取BDKRB2基因的中位表達(dá)值為分割點(diǎn)，劃分患者表達(dá)量為高表達(dá)量或者低表達(dá)量。tdROC曲線中，選擇3年、5年、7年為時(shí)間節(jié)點(diǎn)，使用曲線下面積(Area under curve,AUC)評(píng)估BDKRB2基因?qū)颊哳A(yù)后的判斷能力。生存分析和tdROC曲線分析均使用R 3.5.2進(jìn)行分析，其中生存分析的計(jì)算使用survival軟件包，繪圖使用survminer軟件包。tdROC的計(jì)算及繪圖均使用timeROC軟件包實(shí)現(xiàn)。

1.6 對(duì)BDKRB2基因進(jìn)行單基因GSEA分析 采用TCGA(The Cancer Genome Atlas Program)數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)[6,9-10]中540例前列腺癌以及正常組織樣本，對(duì)BDKRB2基因進(jìn)行單基因GSEA分析。采用R 3.5.2 的DESeq2 軟件包獲取每個(gè)基因在前列腺癌組織和正常前列腺組織間的差異倍數(shù)的對(duì)數(shù)(Logarithmic fold change,LFC)，并以每個(gè)基因的LFC作為GSEA分析過程中的排序依據(jù)。從Molecular Signatures Database v7.0(http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb/index.jsp)中選擇C2(curated gene sets)作為本次分析用的參考基因集[11-12]。GSEA分析基于R 3.5.2 中的 clusterProfiler 軟件包實(shí)現(xiàn)[13]。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 所有計(jì)算均在R 3.5.2 中實(shí)現(xiàn)。在功能富集分析過程中，設(shè)定校正后P<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。差異基因獲取時(shí)，設(shè)定|Log2FC|>1以及P>0.01為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。生存分析和tdROC曲線分析過程中，選擇P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫中月桂酸和姜黃二酮靶蛋白基因預(yù)測結(jié)果 按照BATMAN-TCM網(wǎng)站的說明文件，將月桂酸和姜黃二酮的英文名依次輸入到數(shù)據(jù)庫中，發(fā)現(xiàn)月桂酸具有238個(gè)靶蛋白基因，姜黃二酮具有264個(gè)靶蛋白基因。在這兩種化合物的靶蛋白基因中，有24個(gè)基因?yàn)閮烧叩墓餐械鞍谆颉Ｒ妶D3A。

圖3 對(duì)共同靶蛋白基因進(jìn)行功能富集分析

2.2 功能富集分析結(jié)果 將上述過程中獲得的24個(gè)靶蛋白基因輸入到metascape中，得到排名前20位的富集分析結(jié)果為：GO∶0061196，真菌乳頭發(fā)育；GO∶0045347，MHC Ⅱ類生物合成過程的負(fù)調(diào)控；GO∶0071407，細(xì)胞對(duì)有機(jī)環(huán)化合物的反應(yīng)；GO∶0042692，肌細(xì)胞分化；GO∶0002573，骨髓白細(xì)胞分化；GO∶1905114，參與細(xì)胞-細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞表面受體信號(hào)通路；GO∶0016570，組蛋白修飾；GO∶0001664，G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合；hsa05031，安非他命成癮；GO∶0051480，胞質(zhì)鈣離子濃度的調(diào)節(jié)；GO∶2001234，凋亡信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控；hsa04916，殺菌作用；GO∶0051090，調(diào)節(jié)DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的活性；GO∶0051147，調(diào)節(jié)肌肉細(xì)胞的分化；GO∶0004842，泛素-蛋白轉(zhuǎn)移蛋白活性；GO∶0042058，調(diào)控表皮生長因子受體信號(hào)通路；hsa05142，南美錐蟲?。籊O∶0043271，離子遷移的負(fù)調(diào)節(jié)(圖3B)。在這些結(jié)果中，我們發(fā)現(xiàn)GO∶2001234、GO∶0051480、GO∶0051090與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，在24個(gè)共同靶蛋白基因中選擇均富集在上述3個(gè)功能富集選項(xiàng)中的基因。如圖4A所示，共有8個(gè)基因成為本研究中的關(guān)鍵基因(ADDRA1,BDKRB2,CDC42,CTNMB1,HAP1,HDAC2,NEDD4,SIRT1)。

圖4 從關(guān)鍵基因中篩選研究靶點(diǎn)

2.3 關(guān)鍵基因在前列腺癌組織及正常組織之間表達(dá)量 在GEPIA數(shù)據(jù)庫中獲得了上述8個(gè)關(guān)鍵基因的表達(dá)量情況，見圖4B。在這8個(gè)基因中，只有BDKRB2基因在前列腺腫瘤組織和正常組織之間表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，確定BDKRB2基因?yàn)楸狙芯康闹委煱悬c(diǎn)。

2.4BDKRB2基因生存分析和tdROC曲線分析結(jié)果 在“2.3”項(xiàng)中，我們發(fā)現(xiàn)BDKRB2基因在前列腺癌組織中顯著低表達(dá)，因此，為了明確該基因?qū)颊哳A(yù)后生存的影響，我們對(duì)該基因進(jìn)行了生存分析。如圖5A所示，當(dāng)BDKRB2基因表達(dá)量降低時(shí)，患者預(yù)后生存時(shí)間顯著下降。Log-rank檢驗(yàn)顯示，P<0.05；cox單因素分析顯示，P<0.05,HR=0.61。結(jié)果表明，BDKRB2基因?qū)η傲邢侔┗颊哳A(yù)后生存為保護(hù)因素。圖5B顯示了tdROC的結(jié)果，其中，3年、5年、7年曲線下面積分別為0.507、0.522、0.606。

2.5BDKRB2基因單基因GSEA分析結(jié)果 根據(jù)富集分?jǐn)?shù)對(duì)結(jié)果進(jìn)行降序排名，選擇前10名結(jié)果。由圖5可見，當(dāng)BDKRB2基因表達(dá)量升高時(shí)，堿基切除修復(fù)以及錯(cuò)配修復(fù)兩個(gè)通路激活。當(dāng)BDKRB2基因表達(dá)量降低時(shí)，鈣離子信號(hào)通路、細(xì)胞黏附分子CAMS、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、局部黏著、JAK_STAT信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、癌癥中信號(hào)通路被激活。當(dāng)BDKRB2基因表達(dá)量升高時(shí)，患者體內(nèi)激活的通路參與抑制腫瘤形成的過程BDKRB2基因表達(dá)量降低時(shí)，患者體內(nèi)一些促進(jìn)腫瘤形成的經(jīng)典信號(hào)通路激活。

圖5 對(duì)BDKRB2基因進(jìn)行GSEA分析

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，月桂酸和姜黃二酮對(duì)腫瘤的治療有顯著的意義。通過化合物結(jié)構(gòu)中的官能團(tuán)比對(duì)，預(yù)測出兩者共同的靶蛋白基因。本研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫前列腺癌患者的測序數(shù)據(jù)，確定了BDKRB2基因?qū)η傲邢侔┗颊哳A(yù)后生存為保護(hù)因素。當(dāng)BDKRB2基因表達(dá)量升高時(shí)，人體內(nèi)抑制腫瘤形成的相關(guān)通路激活；當(dāng)BDKRB2基因表達(dá)量降低時(shí)，人體內(nèi)促進(jìn)腫瘤形成的相關(guān)通路激活。

本研究顯示，BDKRB2基因在前列腺癌中通過堿基切除修復(fù)以及錯(cuò)配修復(fù)兩個(gè)通路發(fā)揮抑癌作用。致癌物可導(dǎo)致DNA的損壞，這些損壞可被堿基切除修復(fù)信號(hào)通路修復(fù)，從而抑制腫瘤的形成[14]。當(dāng)前列腺癌的錯(cuò)配修復(fù)基因發(fā)生突變時(shí)，疾病將呈現(xiàn)出侵襲性的臨床病理特征[15]。同時(shí)，BDKRB2基因表達(dá)量降低時(shí)，體內(nèi)一些促癌信號(hào)通路被激活，如鈣離子信號(hào)通路、細(xì)胞黏附分子CAMS、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、局部黏著、JAK_STAT信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、癌癥中信號(hào)通路。鈣離子信號(hào)通路通過促進(jìn)細(xì)胞增殖及抑制細(xì)胞死亡來發(fā)揮其促癌作用[16]。細(xì)胞黏附分子CAMS對(duì)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展具有促進(jìn)作用[17]。有報(bào)道，細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用與腫瘤微環(huán)境相關(guān)，并可作為癌癥治療與監(jiān)測的研究方向[18]。JAK_STAT信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活、增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移，是癌癥藥物治療的有效靶點(diǎn)[19]。MAPK信號(hào)通路在胃賁門細(xì)胞癌中發(fā)揮促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖以及抑制腫瘤細(xì)胞凋亡的作用[20]。

綜上所述，本研究首先基于月桂酸和姜黃二酮具有抗腫瘤性質(zhì)，探索兩者共同靶蛋白基因，然后發(fā)現(xiàn)BDKRB2基因作為月桂酸和姜黃二酮的共同靶點(diǎn)，是前列腺癌患者預(yù)后的保護(hù)因素。最后，通過GSEA分析，確定了BDKRB2基因在前列腺癌中相關(guān)的信號(hào)通路，為后續(xù)研究提供方向。綜上所述，月桂酸和姜黃二酮可共同作用于BDKRB2基因，從而在前列腺癌中發(fā)揮治療作用。但是本研究內(nèi)容尚不夠深入，需要在后續(xù)研究中進(jìn)行功能學(xué)驗(yàn)證，以及信號(hào)通路驗(yàn)證。