陳祥娃，霍婷婷，董發(fā)勤，劉靳波，鄧建軍,3

(1.西南醫(yī)科大學(xué) 附屬醫(yī)院，四川 瀘州 646000； 2. 西南科技大學(xué) 固體廢物處理與資源化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 綿陽 621010； 3. 四川綿陽四O四醫(yī)院，四川 綿陽 621000)

近年來頻發(fā)的區(qū)域性霧霾天氣主要與高濃度的細(xì)顆粒物2.5(PM2.5)相關(guān)。有研究表明礦物粉塵是大氣顆粒物的主要成分之一，如硅質(zhì)礦物石英、硫酸鹽礦物石膏及芒硝等(徐宗澤等, 2019)。楊潔等(2017)利用X射線衍射光譜儀檢測到可吸入細(xì)顆粒物PM2.5中主要礦物成分為石英，并證實(shí)其能抑制細(xì)胞增殖，使細(xì)胞周期G2/M期阻滯。有研究報(bào)道，空氣污染物與心血管疾病的發(fā)病率和死亡率有關(guān)(Newbyetal., 2015; Caietal., 2016)。鼻咽喉、氣道和肺是大氣中石英粉塵攻擊人體的直接靶器官，流行病學(xué)研究已經(jīng)表明，大氣污染與呼吸道炎癥發(fā)病率的增加和肺功能下降密切相關(guān)(Zhaoetal., 2019)。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，大氣顆粒物的急性暴露可誘導(dǎo)支氣管高反應(yīng)性(bronchial hyper reactivity, BHR)、氣道炎癥的發(fā)生，釋放IL-6與IL-8等炎癥因子，發(fā)揮其促進(jìn)細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)發(fā)熱反應(yīng)等生理學(xué)功能(Guoetal., 2017; Oginoetal., 2018)。 目前，大氣顆粒物的細(xì)胞毒理效應(yīng)所涉及的機(jī)制主要有氧化應(yīng)激、炎癥信號傳導(dǎo)途徑活化、DNA損傷和表觀遺傳學(xué)改變等(Liuetal., 2018; Yangetal., 2018; Wangetal., 2019; Lietal., 2019)，其中炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的活化會誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生高水平的炎癥因子，使組織發(fā)生滲出、增生、變質(zhì)、肉芽腫等病理變化，進(jìn)而發(fā)展為肺部纖維化、自發(fā)性氣胸、慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)。Toll樣受體4(toll like receptor,TLR4)信號途徑在調(diào)控炎癥反應(yīng)、先天性免疫應(yīng)答上起關(guān)鍵作用，其可被各種病原/危險(xiǎn)相關(guān)分子模式激活，參與了各種炎癥因子的產(chǎn)生過程。TLR4受體多分布在巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞膜表面，但其在石英粉塵致人支氣管上皮細(xì)胞(16 human bronchial epithelial cells, 16HBE)炎癥反應(yīng)中的作用少有報(bào)道，故本研究采用16HBE細(xì)胞作為石英粉塵染毒對象，探討石英粉塵對16HBE細(xì)胞炎癥反應(yīng)的機(jī)制，以期在分子生物學(xué)層面對其致氣道炎癥機(jī)制進(jìn)行更深入的研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

主要試劑有Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培養(yǎng)基 (DMEM, 含4mM L-谷氨酰胺)(Hyclone)、胰酶消化液、青鏈霉素雙抗溶液(碧云天)、胎牛血清(Gibco)、CCK-8(cell counting kit-WST8)、Human IL-6 ELISA Kit、Human IL-8 ELISA Kit(BOSTER)、TAK-242(MCE)、全蛋白抽提試劑盒(凱基)和抗TLR4抗體(CST)。

主要儀器有X射線衍射光譜儀(X’pert PRO, PANalytical)、倒置相差熒光顯微鏡( Axio ObserverA1, Zeiss) 、全波長酶標(biāo)儀 ( PowerWave XS2, BioTek)、蛋白電泳儀(Power Supplies Basic, Bio-rad)、凝膠成像系統(tǒng)(BOXChemiXR5, SYNGENE G)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 石英粉塵物相分析

石英粉塵由西南科技大學(xué)固體廢物處理與資源化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，經(jīng)臥式行星球磨機(jī)研磨、烘干后得到粒徑≤2.5 μm的石英粉塵樣本。采用X射線衍射光譜儀，利用Cu Ka輻射(k=1.541 78 ?)對樣本進(jìn)行物相鑒別。

石英粉塵樣本經(jīng)高壓蒸汽滅菌處理后，溶解于DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，超聲震蕩30 min配制為1 000 μg/mL的母液，并依次稀釋至實(shí)驗(yàn)所需濃度。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人支氣管上皮細(xì)胞來源于廣州呼吸系統(tǒng)疾病研究所，細(xì)胞所用完全培養(yǎng)基含有90% DMEM，并添加10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)和1%青鏈霉素雙抗溶液(含100 U/mL的青霉素、0.1 mg/mL的鏈霉素)。將細(xì)胞培養(yǎng)于37℃、5%CO2的飽和濕度環(huán)境中。待細(xì)胞貼壁密度達(dá)80%～90%，消化細(xì)胞以1∶2的比例傳代于T25 cm2培養(yǎng)瓶中。每次實(shí)驗(yàn)之前，要求細(xì)胞的貼壁密度達(dá)80%左右。

1.2.3 細(xì)胞相對存活率檢測

使用DMEM完全培養(yǎng)基調(diào)整16HBE細(xì)胞懸液濃度為1.0×105/mL，以100 μL/孔的體積接種于96微孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁密度為80%左右，依次加入終濃度為0(對照)、25、50、75、100、125、150、175、200和250 μg/mL的石英粉塵懸液，每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔。為消除顆粒物背景對于光密度(OD值)的影響，每個濃度都設(shè)置其對應(yīng)的背景孔(僅含相應(yīng)濃度的石英粉塵懸液)。染毒24 h后，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，避光孵育1.5 h后于450 nm處測定每個孔的OD值，并按以下公式計(jì)算細(xì)胞相對存活率： 細(xì)胞相對存活率(%)=(OD實(shí)驗(yàn)孔-OD對應(yīng)背景孔)/(OD對照孔-OD對應(yīng)背景孔)×100%。

1.2.4 ELISA法檢測染毒后細(xì)胞上清液中IL-6、IL-8濃度

調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為1.0×105/mL，接種于6孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁密度為80%左右。依次加入終濃度為0(對照)、25、50、75、100 μg/mL的石英粉塵懸液，每個濃度做3個復(fù)孔。染毒24 h后取上清液，3 000 r/min、4℃離心5 min后收集上清液，1∶2稀釋。按照試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 Western Blot檢測染毒后細(xì)胞裂解液中TLR4的表達(dá)情況

使用全蛋白抽提試劑盒提取各濃度石英粉塵懸液處理后的16HBE細(xì)胞裂解液中的總蛋白質(zhì)，以15 μL/孔的上樣量加入10%的分離膠上進(jìn)行蛋白質(zhì)分離，然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜(NC膜)上。將膜在5%脫脂奶粉中封閉1.5 h，爾后把膜置于含抗TLR4抗體(1∶1 000稀釋)的平皿中，4℃搖床振蕩孵育過夜。之后吸取一抗，TBST緩沖液洗膜3次，用5%脫脂奶粉封閉液稀釋二抗，室溫?fù)u床振蕩反應(yīng)1.5 h，滴加ECL發(fā)光工作液，并使用G:BOX chemiXR5系統(tǒng)獲得蛋白條帶圖像，Gel-Pro32軟件測量條帶灰度值。

1.2.6 TLR4抑制劑預(yù)處理后細(xì)胞上清液中IL-6、IL-8的濃度檢測

為了驗(yàn)證TLR4在氣道炎癥中的作用，將TAK 242(1 μg/mL，每孔2 mL)對細(xì)胞進(jìn)行1 h的預(yù)處理，再依次加入終濃度為0、25、50、75、100 μg/mL的石英粉塵懸液，后續(xù)操作同1.2.4。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

定量數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示，聯(lián)合Excel和SPSS17.0對其進(jìn)行計(jì)算和差異性比較，在數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布且方差齊的前提下，兩組間樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析，否則采用校正t檢驗(yàn)(t’檢驗(yàn))。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；P<0.01表示差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有圖形使用GraphPad Prism 8.0和Origin 8.2.0進(jìn)行繪制。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與數(shù)據(jù)分析

2.1 石英粉塵的XRD圖譜

由石英粉塵的X射線衍射圖譜(圖1)可知，本次研究的大氣顆粒物中主要物相為石英，并含有少量方解石。

圖 1 石英粉塵的XRD衍射圖Fig.1 XRD diffraction diagram of quartz dust

2.2 石英粉塵染毒后16HBE細(xì)胞存活率

不同濃度的石英粉塵懸液染毒16HBE細(xì)胞24 h后，細(xì)胞相對存活率的變化如圖2所示。圖中，*表示與對照組相比，P<0.05;**表示與對照組相比，P<0.01。與對照組相比,各個濃度的石英粉塵懸液都降低了細(xì)胞存活率。當(dāng)濃度介于0～100 μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率維持在60%以上。濃度為200與250 μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率顯著降低，分別為(52.43±3.99)%和(48.81±7.87)%。

2.3 石英粉塵及抑制劑處理后細(xì)胞IL-6與IL-8表達(dá)水平

與對照組相比，使用1 μg/mL的TAK 242處理16HBE細(xì)胞24 h未對細(xì)胞存活率造成影響(圖3)。

圖 2 石英粉塵對16HBE細(xì)胞相對存活率的影響Fig. 2 Effects of quartz dust on 16HBE cell relative survival ratio

圖 3 抑制劑對16HBE細(xì)胞相對存活率的影響Fig. 3 Effects of inhibitor on 16HBE cell relative survival ratio

如圖4所示，隨著石英粉塵懸液濃度增加，細(xì)胞因子IL-6與IL-8的表達(dá)呈現(xiàn)遞增趨勢，當(dāng)石英粉塵懸液濃度為100 μg/mL時(shí)，與對照組相比，IL-6濃度顯著增加，為348.47±20.49 pg/mL(表1)。當(dāng)懸液濃度為50、75、100 μg/mL時(shí)，IL-8濃度顯著增加，分別為667.81±69.56、677.17±31.85 和844.63±37.32 pg/mL。 此外，用抑制劑TAK 242預(yù)處理1 h后，50、75、100 μg/mL濃度組的細(xì)胞因子IL-6與IL-8表達(dá)降低。 圖4中，TAK 242(-)表示未使用該物質(zhì)預(yù)處理細(xì)胞，僅使用了石英粉塵處理；TAK 242(+)表示使用1 μg/mL的TAK 242預(yù)處理細(xì)胞1 h再進(jìn)行染毒實(shí)驗(yàn)；*表示與對照組相比，P<0.05；**表示與對照組相比，P<0.01；#表示與未使用抑制劑的相同石英粉塵濃度組相比，P<0.05；##表示與未使用抑制劑的相同石英粉塵濃度組相比，P<0.01。

圖 4 石英粉塵及抑制劑處理后16HBE細(xì)胞IL-6與IL-8的相對表達(dá)Fig. 4 Relative expression of IL-6 and IL-8 in 16HBE cells treated with quartz dust and inhibitor

表 1 石英粉塵和抑制劑對16 HBE細(xì)胞IL-6和IL-8表達(dá)的影響

Table 1 Effects of quartz dust and inhibitor on the expression of IL-6 and IL-8 in 16HBE cells

石英粉塵濃度/(μg·mL-1)IL-6濃度/(pg·mL-1)IL-8濃度/(pg·mL-1)TAK 242(-)TAK 242(+)TAK 242(-)TAK 242(+)對照215.69±25.99200.14±13.50387.65±60.60355.75±10.1825266.25±8.21241.25±49.08570.98±42.86?259.56±19.3150274.86±11.31?185.97±0.96##667.81±69.56??477.97±7.76#75300.69±41.97?189.58±3.63#677.17±31.85??470.67±28.46##100348.47±20.49??226.53±30.69##844.63±37.32??597.81±42.72##

2.4 石英粉塵處理后細(xì)胞TLR4表達(dá)水平

如圖5所示，TLR4的表達(dá)量隨石英粉塵懸液濃度增加而上調(diào)。相同濃度的石英粉塵染毒條件下，使用TAK 242預(yù)處理組較未使用組的TLR4表達(dá)量降低。經(jīng)內(nèi)參蛋白GAPDH校正后，與對照組相比，50～100 μg/mL濃度組的TLR4表達(dá)明顯增加(P<0.01)，100 μg/mL組的TLR4表達(dá)為對照組的11.45倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖 5 石英粉塵和TAK 242對16HBE細(xì)胞TLR4表達(dá)的影響Fig. 5 Effects of quartz dust and TAK 242 on the expression of TLR4 in 16HBE cells

3 討論

大氣細(xì)顆粒物污染除造成霧霾天氣、降低空氣能見度外，已成為我國的一個重大公共衛(wèi)生問題。經(jīng)濟(jì)發(fā)展過程中，建筑施工、渣土運(yùn)輸、工業(yè)化采礦、水泥(粉煤灰)制磚等都會造成大氣細(xì)顆粒物濃度上升，當(dāng)這些固體物質(zhì)分散并懸浮在氣體介質(zhì)中便形成氣溶膠，并可通過呼吸系統(tǒng)進(jìn)入機(jī)體。大氣細(xì)顆粒物因直徑極小，吸入后易沉積在肺組織，甚至可以通過氣-血屏障擴(kuò)散進(jìn)入血液，導(dǎo)致氣道炎癥和系統(tǒng)性炎癥的發(fā)生。Huang等人搜集的流行病學(xué)數(shù)據(jù)表明，當(dāng)大氣顆粒物濃度大于38.98 μg/m3時(shí)，非吸煙健康人群對COPD的易感性增加(Huangetal.,2019)。大量體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，暴露于高濃度的大氣顆粒物環(huán)境下，會導(dǎo)致肺功能下降以及誘導(dǎo)變應(yīng)性氣道疾病、急性氣道炎癥、哮喘等疾病的發(fā)生(Zhouetal., 2016; Shenetal., 2018)。

炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是大氣細(xì)顆粒物引發(fā)肺部損傷的基本病理過程。暴露于霧霾環(huán)境下可能導(dǎo)致健康人發(fā)生鼻腔炎癥和超敏反應(yīng)，鼻腔分泌物中NO、IL-5、IL-8、P物質(zhì)、神經(jīng)生長因子和血管活性腸肽的水平顯著增加(Xianetal., 2019)。礦物是大氣顆粒物的主要成分之一，本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，微米級石英粉塵顆粒染毒后會引起16HBE細(xì)胞上清液中IL-6與IL-8水平顯著增加。IL-6已被確定為關(guān)鍵的免疫調(diào)節(jié)多肽類細(xì)胞因子，有促進(jìn)細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)發(fā)熱反應(yīng)的作用，是COPD患者的預(yù)后生物標(biāo)志物(Wuetal., 2017)，其還被證明為上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的觸發(fā)因素(Browningetal., 2018)。IL-8屬于趨化因子家族的一員，主要功能為募集白細(xì)胞到炎癥發(fā)生部位，并誘導(dǎo)其釋放一系列生物活性產(chǎn)物引起組織損傷。研究發(fā)現(xiàn)，大氣顆粒物染毒后的肺組織中有豐富的巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(Oginoetal., 2017； Xuetal., 2019)，本次研究檢測到的高IL-8表達(dá)與此實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符合。

高濃度炎癥因子的表達(dá)與分泌由TLR4信號途徑進(jìn)行調(diào)控。TLR4屬于Ⅰ型跨膜蛋白受體，當(dāng)配體與髓樣分化蛋白-2(myeloid differentiation-2,MD-2)結(jié)合，會導(dǎo)致TLR4二聚化，胞內(nèi)區(qū)形成Toll白介1受體 (toll interleukin 1 receptor,TIR)結(jié)構(gòu)域(Gayetal., 2007)。TAK 242可特異性地與TIR結(jié)構(gòu)域結(jié)合，阻止其活化下游的銜接蛋白。本次研究表明，1 μg/mL的TAK 242處理16HBE細(xì)胞24 h后不會影響細(xì)胞的存活率，故可采用其作為研究TLR4信號通路的抑制劑。本研究證實(shí)TAK 242可以有效降低細(xì)胞上清液中IL-6與IL-8的濃度，推測TLR4轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的活化可能是石英粉塵致支氣管炎癥反應(yīng)的潛在分子機(jī)制。Xu等(2018)使用TAK 242預(yù)處理小鼠巨噬細(xì)胞(RAW264.7)后，大氣細(xì)顆粒物刺激產(chǎn)生的高濃度IL-1β現(xiàn)象被抑制，此外，免疫調(diào)節(jié)關(guān)鍵核因子-κB(nuclear factor kappa-B, NF-κB)的表達(dá)也在TAK 242預(yù)處理后明顯下調(diào)，證明TLR4信號通路與NF-κB信號通路間存在交叉，形成信號調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)以維持機(jī)體響應(yīng)大氣細(xì)顆粒物刺激的免疫反應(yīng)發(fā)生。

NF-κB是一種轉(zhuǎn)錄因子，可與炎癥因子基因的啟動子區(qū)結(jié)合從而上調(diào)其表達(dá)，如圖6所示，除NF-κB 外，TLR4通路還包含了很多信號分子。在本次研究中，僅對細(xì)胞膜上的“信號開關(guān)”TLR4蛋白進(jìn)行了檢測，觀察到TLR4的表達(dá)隨石英粉塵懸液濃度增加而上調(diào)，然而卻未對TLR4信號軸下游的蛋白，如髓樣分化蛋白88(myeloid differentiation factor 88, MyD88)、β-干擾素TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白(TIR domain containing adaptor inducing interferon-β, TRIF)與石英粉塵之間的關(guān)系進(jìn)行探索。此外，XRD分析顯示本次實(shí)驗(yàn)所用的大氣顆粒物主要物相為石英，研究表明(Rathinametal., 2013)TLR4的主要配體為細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)，本實(shí)驗(yàn)將顆粒物置于103.4 kPa、121.3°C的條件下進(jìn)行30 min的滅菌處理，不會造成LPS的丟失，因此需要進(jìn)一步研究TLR4的激活是與LPS還是石英有關(guān)。深入了解TLR4及其上下游分子對炎癥介質(zhì)釋放的影響，可以針對性地研制出大氣中石英粉塵所致肺部疾病的治療干預(yù)措施，這將是我們下一步的研究內(nèi)容。

圖 6 TLR4信號通路活化模式圖Fig. 6 Activation pattern diagram of TLR4 signal pathway

4 結(jié)論

(1) 石英粉塵作用于16HBE細(xì)胞后，會刺激其分泌高濃度的IL-6與IL-8。

(2) TLR4特異性抑制劑TAK 242可以拮抗石英粉塵引發(fā)的高水平炎癥因子和TLR4。

(3) 石英粉塵可激活 16HBE細(xì)胞的TLR4信號通路，誘導(dǎo)氣道炎癥反應(yīng)的發(fā)生。