梁琰 冷慧 徐珞

【摘要】 目的：探究大鼠腹側(cè)背蓋區(qū)（VTA）微量注射nesfatin-1對(duì)正常大鼠及糖尿病大鼠攝食及葡萄糖敏感神經(jīng)元活動(dòng)的影響。方法：通過向VTA微量注射nesfdatin-1及黑皮質(zhì)素3/4受體拮抗劑SHU9119觀察對(duì)正常大鼠及糖尿病大鼠葡萄糖敏感（GS）神經(jīng)元放電活動(dòng)的影響;通過綜合實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物監(jiān)測系統(tǒng)（CLAMS，Columbus Instruments，Ohio）觀察向VTA微量注射nesfdatin-1及黑皮質(zhì)素3/4受體拮抗劑SHU9119對(duì)正常大鼠及糖尿病大鼠攝食的影響。結(jié)果：VTA微量注射nesfatin-1后，正常大鼠和糖尿病大鼠GS-E神經(jīng)元放電活動(dòng)顯著升高（P<0.05），且GS-I神經(jīng)元放電活動(dòng)顯著下降（P<0.05），但糖尿病大鼠VTA注射nesfatin-1對(duì)GS反應(yīng)性神經(jīng)元的興奮/抑制作用更加顯著（P<0.05）;VTA微量注射nesfatin-1后，正常大鼠和糖尿病大鼠攝食量均顯著下降（P<0.05），但糖尿病大鼠攝食量下降更為顯著（P<0.05）。結(jié)論：大鼠VTA nsfatin-1信號(hào)通路參與正常大鼠及糖尿病大鼠葡萄糖敏感神經(jīng)元放電活動(dòng)及攝食量的調(diào)控。

【關(guān)鍵詞】 腹側(cè)背蓋區(qū) Nesfatin-1 糖尿病大鼠 攝食 葡萄糖敏感神經(jīng)元

[Abstract] Objective： To investigate the effects of microinjection of nesfatin-1 into ventral dorsal tegmental area （VTA） on the feeding and glucose sensitive neuron activities in normal and diabetic rats. Method： The effects on the activity of glucose sensitive （GS） neurons in normal and diabetic rats were observed by microinjection of nesfatin-1 and melanocortin 3/4 receptor antagonist SHU9119 into VTA， the effects of microinjection of nesfdatin-1 and melanocortin 3/4 receptor antagonist SHU9119 into VTA on the feeding of normal and diabetic rats were observed by means of the integrated laboratory animal monitoring system （CLAMS， Columbus Instruments， Ohio）. Result： VTA neuronal firing activity increased significantly in normal and diabetic rats after microinjection nesfatin-1 （P<0.05）， and decreased significantly in GS-I neurons （P<0.05）， but the excitatory/inhibitory effect of injection nesfatin-1 on GS reactive neurons was more significant in diabetic rats （P<0.05）. After VTA microinjection of nesfatin-1， both normal and diabetic rats decreased significantly （P<0.05）， but the food intake of diabetic rats decreased more significantly （P<0.05）. Conclusion： The signal pathway of VTA nsfatin-1 is involved in the discharge activity of glucose sensitive neurons and the change of food intake in normal and diabetic rats.

2006年，研究人員發(fā)現(xiàn)一種新的腦腸肽，命名為nesfatin-1[1]。Nesfatin-1是由前體蛋白2（NUCB2）衍生而來的一種含有82個(gè)氨基酸的多肽[2-3]。Nesfatin-1起初被發(fā)現(xiàn)與攝食相關(guān)，分布于大鼠下丘腦腹側(cè)背蓋區(qū)（VTA）、室旁核（PVN）、弓狀核（ARC）和孤束核（NTS）等[1]。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，nesfatin-1具有廣泛的中樞和外周分布，且參與調(diào)節(jié)胃腸功能、糖和脂類代謝、能量代謝、情緒調(diào)節(jié)及心血管功能等[4-6]。

研究發(fā)現(xiàn)，體重的慢性改變也會(huì)影響nesfatin-1血清循環(huán)水平，在體重偏輕和厭食癥患者體內(nèi)nesfatin-1水平降低[7-8]，但在肥胖患者體內(nèi)，nesatin-1的血清循環(huán)水平升高，可能是因?yàn)閚esfatin-1在胃中表達(dá)增加有關(guān)，在胃切除等減肥手術(shù)后，患者體重下降，且nesfatin-1循環(huán)水平下降[9-10]，這表明nesfatin-1與體重存在負(fù)相關(guān)。先前研究主要集中在外周或靜脈注射nesfatin-1對(duì)大鼠攝食及能量代謝的影響，而本研究通過向大鼠下丘腦腹側(cè)背蓋區(qū)（VTA）直接微量注射nesfatin-1，觀察對(duì)正常大鼠及糖尿病大鼠攝食及葡萄糖敏感（GS）神經(jīng)元放電活動(dòng)的影響，對(duì)糖尿病的疾病進(jìn)展及臨床靶向藥物的研發(fā)具有重要意義，具體如下。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年雄性Sprague Dawley大鼠，體質(zhì)量在220～250 g，均在室溫（25±2）℃、12 h∶12 h晝夜循環(huán)光照、實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)飲食及自由進(jìn)食和飲水的環(huán)境中飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)開始前，大鼠禁食24 h，但可自由飲水。VTA內(nèi)注射藥物后，大鼠自由攝食和飲水。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均嚴(yán)格按《青島大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)和使用管理辦法》執(zhí)行。

1.2 糖尿病大鼠模型制備

隨機(jī)選取70只大鼠，體重220～250 g，禁食12 h，不禁水。模型組大鼠單次腹腔注射35 mg/kg的鏈脲佐菌素（STZ，sigma）。STZ用滅菌0.1 mmol/L、pH 4.4的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配成2%的溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。72 h后取尾靜脈血測空腹血糖高于7.0 mmol/L和餐后血糖均高于11.1 mmol/L為糖尿病大鼠建模成功。未成模者或成模后緩解者淘汰。

1.3 大鼠腦核團(tuán)置管

大鼠腹腔注射10%水合氯醛 （0.3 ml/100 g）麻醉，固定于腦立體定位儀，根據(jù)Paxinos&Watson大鼠腦圖譜用微量注射儀定位，以前囟為零點(diǎn)，定位大鼠下丘腦腹側(cè)被蓋區(qū)（VTA，前囟后5.2 mm，旁開1.0 mm，深8.0 mm）。用牙科鉆鉆孔，將一不銹鋼套管置于VTA，用牙科粘固劑固定，不銹鋼管探針封閉導(dǎo)管，縫合頭皮切口。大鼠分籠飼養(yǎng)，自由飲食飲水。手術(shù)結(jié)束后大鼠連續(xù)3 d給予腹腔注射8萬U青霉素以防止術(shù)后感染。大鼠恢復(fù)1周后開始實(shí)驗(yàn)。

為了檢測核團(tuán)或側(cè)腦室定位是否準(zhǔn)確，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后經(jīng)套管向大鼠VTA內(nèi)緩慢注射滂胺天藍(lán)溶液，隨后麻醉大鼠，經(jīng)心臟灌注固定，斷頭取腦，50 μm冠狀冰凍切片，顯微鏡下觀察藥物注射的位置是否準(zhǔn)確。

1.4 葡萄糖敏感神經(jīng)元放電

為了檢測nesfatin-1對(duì)正常大鼠和糖尿病大鼠葡萄糖敏感神經(jīng)元放電的影響，隨機(jī)選取正常大鼠和糖尿病大鼠各30只。大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.3 ml/100g）麻醉，并固定于腦立體定位儀，暴露顱骨，參照大鼠腦圖譜定位VTA（前囟后5.2 mm，旁開1.0 mm，深8.0 mm）。牙科鉆顱骨鉆孔，剝除腦膜暴露腦實(shí)質(zhì)，使用 30～40 g/L 的瓊脂生理鹽水覆蓋腦表面。將五管玻璃微電極（電極尖端直徑 15～20 μm，電極阻抗 5～15 MΩ）用液壓推進(jìn)器送至VTA。在五管玻璃微電極中：記錄電極充以20 g/L的滂胺天藍(lán)和0.5 mmol/L乙酸鈉，另外四管分別充以5 mmol/L葡萄糖（pH 7.4）、0.9%生理鹽水（NS），10 nmol/L nesfatin-1和1 nmol/L SHU9119，與四通液壓推進(jìn)泵相連。注射葡萄糖（GS）后，其中部分神經(jīng)元對(duì)GS有反應(yīng)，被鑒定為GS反應(yīng)神經(jīng)元。因此，將GS反應(yīng)神經(jīng)元作為后續(xù)電生理實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。通過短脈沖氣壓（1 500 ms， 5.0～15.0 psi）向GS反應(yīng)神經(jīng)元表面先后噴灑0.9%生理鹽水（NS），10 nmol/L nesfatin-1、1 nmol/L SHU9119和10 nmol/L nesfatin-1+1 nmol/L SHU9119，待前一藥物作用消失后，再噴灑后一藥物，觀察不同藥物對(duì)大鼠GS反應(yīng)神經(jīng)元放電活動(dòng)的影響。

當(dāng)玻璃微電極尖端進(jìn)入空氣與瓊脂界面時(shí)，監(jiān)聽器的聲音會(huì)發(fā)生明顯的變化。當(dāng)玻璃微電極進(jìn)入VTA，搜尋VTA內(nèi)神經(jīng)元，并開始記錄細(xì)胞外的放電活動(dòng)。待放電頻率穩(wěn)定后（至少記錄120 s），注入5 mmol/L葡萄糖（pH 7.4），觀察神經(jīng)元放電頻率的變化，鑒別GS神經(jīng)元，以神經(jīng)元放電頻率的變化率超過20%作為神經(jīng)元興奮或抑制指標(biāo)，神經(jīng)元表現(xiàn)興奮的定為葡萄糖興奮性（GE）神經(jīng)元，表現(xiàn)為抑制的定為葡萄糖抑制性（GI）神經(jīng)元。之后注射藥物，觀察藥物對(duì)GS神經(jīng)元放電頻率的影響。

1.5 攝食量測定

為了檢測nesfatin-1對(duì)正常大鼠和糖尿病大鼠攝食量的影響，另隨機(jī)選取正常大鼠和糖尿病大鼠各20只，各分為4組，每組5只，分別為NS組（0.5 μl NS）、Nesfatin-1組（0.5 μl 0.5 μg nesfatin-1）、SHU9119組（0.5 μl 0.25 μg SHU9119）、nesfatin-1+SHU9119組（0.5 μl 0.5 μg nesfatin-1+ 0.5 μl 0.25 μg SHU9119）。

大鼠被安置[平均體重（205±3）g]，并使其適應(yīng)環(huán)境。實(shí)驗(yàn)開始前，大鼠禁食12 h，不禁水。在核團(tuán)給藥之前記錄大鼠的體重。將大鼠轉(zhuǎn)移至綜合實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物監(jiān)測系統(tǒng)（CLAMS;Columbus Instruments，Ohio）籠中以適應(yīng)環(huán)境，并在第一次研究之前監(jiān)測飼養(yǎng)和代謝參數(shù)4 d。分別記錄大鼠0～4 h每小時(shí)攝食量。使用與第一組大鼠體重匹配的第二組大鼠重復(fù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，獲得相似的結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18.0和PPMS 1.5軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料均以（x±s）表示，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩組間樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VTA注射nesfatin-1對(duì)正常大鼠GS敏感神經(jīng)元放電活動(dòng)的影響

在30只正常大鼠VTA共記錄到88個(gè)放電神經(jīng)元，其中64個(gè)（72.73%，64/88）神經(jīng)元對(duì)GS有反應(yīng)，被鑒定為GS反應(yīng)神經(jīng)元。在64個(gè)GS反應(yīng)神經(jīng)元中，35個(gè)（54.69%，35/64）神經(jīng)元放電頻率顯著增加，鑒定為GS-E神經(jīng)元;而29個(gè)（45.31%，29/64）神經(jīng)元放電頻率下降，鑒定為GS-I神經(jīng)元。

在35個(gè)GS-E神經(jīng)元中，nesfatin-1組中神經(jīng)元（65.71%，23/35）放電頻率高于NS組（P<0.05），平均升高（84.95±7.59）%，見表1、圖1B;若VTA微量注射黑皮質(zhì)素3/4受體拮抗劑SHU9119可部分阻斷nesfatin-1誘導(dǎo)的興奮效應(yīng)（P<0.05），見表1、圖1A;單獨(dú)注射SHU9119，正常大鼠VTA GS-E反應(yīng)神經(jīng)元放電活動(dòng)無顯著改變（P>0.05），見表1、圖1A。

在29個(gè)GS-I神經(jīng)元中，nesfatin-1組中神經(jīng)元放電頻率低于NS組（P<0.05），平均降低（48.74±2.19）%，見表1、圖1B。Nesfatin-1對(duì)正常大鼠GS-I神經(jīng)元的抑制作用可被預(yù)先VTA注射SHU9119部分阻斷（P<0.05），見表1、圖1B。提示，nesfatin-1可能通過黑皮質(zhì)素3/4受體通路參與調(diào)控正常大鼠VTA GS-E或GS-I神經(jīng)元的興奮性，單獨(dú)注射SHU9119，正常大鼠VTA GS-E反應(yīng)神經(jīng)元的放電活動(dòng)無顯著改變（P>0.05），見表1、圖1B。

2.2 VTA注射nesfatin-1對(duì)糖尿病大鼠GS敏感神經(jīng)元放電活動(dòng)的影響

在30只糖尿病大鼠VTA共記錄到94個(gè)放電神經(jīng)元，其中67個(gè)（71.28 %，67/94）神經(jīng)元對(duì)葡萄糖有反應(yīng)，被鑒定為GS反應(yīng)神經(jīng)元。在67個(gè)GS反應(yīng)神經(jīng)元中（GS組），39個(gè)（58.21%，39/67）神經(jīng)元放電頻率顯著增加，鑒定為GS-E神經(jīng)元;而28個(gè)（41.79%，28/67）神經(jīng)元放電頻率下降，鑒定為GS-I神經(jīng)元。

在39個(gè)GS-E神經(jīng)元中，nesfatin-1組中神經(jīng)元（66.67 %，26/39）放電頻率高于NS組（P<0.05），平均升高（98.10±9.14）%，見表2、圖2A;若VTA微量注射黑皮質(zhì)素3/4受體拮抗劑SHU9119可部分阻斷nesfatin-1誘導(dǎo)的興奮效應(yīng)（P<0.05），見表2、圖2A，單獨(dú)注射SHU9119，糖尿病大鼠VTA GS-E反應(yīng)神經(jīng)元的放電活動(dòng)無顯著改變（P>0.05），見表2、圖2A。

在28個(gè)GS-I神經(jīng)元中，nesfatin-1組中神經(jīng)元放電頻率低于NS組（P<0.05），平均降低（59.90±3.09）%，見表2、圖2B。Nesfatin-1對(duì)糖尿病大鼠GS-I神經(jīng)元的抑制作用可被預(yù)先VTA注射SHU9119部分阻斷（P<0.05），見表2、圖2B。提示，nesfatin-1可能通過黑皮質(zhì)素3/4受體通路參與調(diào)控糖尿病大鼠VTA GS-E或GS-I神經(jīng)元的興奮性，單獨(dú)注射SHU9119，糖尿病大鼠VTA GS-E反應(yīng)神經(jīng)元的放電活動(dòng)無顯著改變（P>0.05），見表2、圖2B。

2.3 VTA注射nesfatin-1對(duì)正常和糖尿病大鼠GS敏感神經(jīng)元放電頻率變化率比較

為進(jìn)一步比較正常及糖尿病大鼠VTA注射nesfatin-1對(duì)大鼠GS反應(yīng)神經(jīng)元放電活動(dòng)的影響，本研究以放電頻率變化率對(duì)放電頻率的變化進(jìn)行量化[放電頻率變化率（%）=（放電頻率nesfatin-1-放電頻率NS）/放電頻率NS×100%]。結(jié)果顯示，與正常大鼠nesfatin-1組相比，nesfatin-1對(duì)糖尿病大鼠GS-E神經(jīng)元的興奮效應(yīng)顯著增加（P<0.05），見圖1C、圖2C、表3;且nesfatin-1對(duì)糖尿病大鼠GS-I神經(jīng)元的抑制作用明顯強(qiáng)于正常大鼠（P<0.05），見圖1C、圖2C、表3。

2.4 VTA注射nesfatin-1對(duì)正常和糖尿病大鼠攝食量的影響

在正常大鼠，與NS組相比，VTA微量注射nesfatin-1，大鼠0～4 h每小時(shí)攝食量顯著降低（P<0.05），見表4。若VTA預(yù)注射SHU9119，nesfatin-1的抑?jǐn)z食效應(yīng)部分消失（P<0.05），見表4，即nesfatin-1對(duì)攝食的抑制作用可能是通過黑皮質(zhì)素3/4受體信號(hào)通路而實(shí)現(xiàn)的。而單獨(dú)注射SHU9119對(duì)大鼠攝食無顯著影響（P>0.05），見表4。

在糖尿病大鼠，與NS組相比，VTA微量注射nesfatin-1，大鼠0～4 h每小時(shí)攝食量顯著降低（P<0.05），見表4。若VTA預(yù)注射SHU9119，nesfatin-1抑?jǐn)z食效應(yīng)部分消失（P<0.05），見表4，即nesfatin-1對(duì)攝食的抑制作用可能是通過黑皮質(zhì)素3/4受體信號(hào)通路而實(shí)現(xiàn)的。而單獨(dú)注射SHU9119對(duì)糖尿病大鼠攝食無顯著影響（P>0.05），見表4。

對(duì)兩組大鼠攝食量改變量進(jìn)行比較，正常大鼠攝食改變量=（攝食量正常大鼠nesfatin-1組-攝食量正常大鼠NS組）/攝食量正常大鼠NS組;糖尿病大鼠攝食改變量=（攝食量糖尿病大鼠nesfatin-1組-攝食量糖尿病大鼠NS組）/攝食量糖尿病大鼠NS組。結(jié)果顯示，與正常大鼠相比，VTA微量注射nesfatin-1，糖尿病大鼠攝食量降低更顯著（P<0.05），見表5。

3 討論

先前研究報(bào)道，nesfatin-1在葡萄糖穩(wěn)態(tài)中也發(fā)揮重要作用，nesfatin-1除了在胃中大量表達(dá)外，還在嚙齒動(dòng)物、狗、豬和人類中也檢測到nesfatin-1在胰腺內(nèi)分泌小島中與胰島素存在共定位[11-19]，表明nesfatin-1與糖尿病的發(fā)生發(fā)展過程存在密切關(guān)系。因此，本研究探究了大鼠VTA nesfatin-1信號(hào)通路對(duì)正常大鼠及糖尿病大鼠攝食及葡萄糖敏感（GS）神經(jīng)元放電活動(dòng)的影響。

本研究結(jié)果顯示，大鼠VTA微量注射nesfatin-1可使正常大鼠及糖尿病大鼠GS-E神經(jīng)元放電頻率顯著升高，而使GS-I神經(jīng)元放電頻率顯著降低;若VTA微量注射黑皮質(zhì)素3/4受體拮抗劑SHU9119可部分阻斷nesfatin-1誘導(dǎo)的興奮/抑制效應(yīng)，單獨(dú)注射SHU9119，對(duì)正常及糖尿病大鼠VTA GS反應(yīng)神經(jīng)元的放電活動(dòng)無顯著改變。提示，nesfatin-1可能是通過SHU9119受體信號(hào)通路參與對(duì)正常大鼠及糖尿病大鼠GS反應(yīng)性神經(jīng)元放電活動(dòng)的調(diào)控。更重要的是，與正常大鼠相比，向糖尿病大鼠VTA微量注射nesfatin-1，對(duì)糖尿病大鼠GS反應(yīng)性神經(jīng)元放電活動(dòng)的興奮/抑制效應(yīng)更加顯著。先前研究已知，糖尿病與肥胖等相關(guān)疾病關(guān)系密切[20]，而本研究結(jié)果提示，正常大鼠及糖尿病大鼠體重?cái)z食或體重差異可能與大鼠下丘腦VTA中GS反應(yīng)性神經(jīng)元激活有關(guān)。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，向大鼠VTA微量注射nesfatin-1，正常及糖尿病大鼠0～4 h每小時(shí)攝食量顯著降低。若VTA預(yù)注射SHU9119，nesfatin-1的抑?jǐn)z食效應(yīng)部分消失，即nesfatin-1對(duì)攝食的抑制作用可能是通過黑皮質(zhì)素3/4受體信號(hào)通路而實(shí)現(xiàn)的。而單獨(dú)注射SHU9119對(duì)正常及糖尿病大鼠攝食無顯著影響。此外，對(duì)兩組大鼠攝食量改變結(jié)果組間比較可見，與正常大鼠相比，VTA微量注射nesfatin-1，糖尿病大鼠的攝食量降低更為顯著。提示，nesfatin-1可能是通過SHU9119受體信號(hào)通路參與對(duì)正常大鼠及糖尿病大鼠攝食量的調(diào)控。

已知nesfatin-1具有廣泛的中樞及外周調(diào)控，因此探究nesfatin-1在中樞對(duì)糖、脂及能量代謝相關(guān)障礙疾病的調(diào)控具有重要的臨床意義。本研究中觀察到nesfatin-1可通過SHU9119受體信號(hào)通路參與對(duì)糖尿病大鼠葡萄糖敏感神經(jīng)元放電及攝食的調(diào)控，這可能為未來代謝相關(guān)疾病的臨床治療提供新的思路。

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（收稿日期：2019-12-05） （本文編輯：馬竹君）