潘滿昌 林曉瑩 汪虹 冷敏

摘要：目的? 研究AMD3100聯(lián)合G-CSF對糖尿病骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞的培養(yǎng)方法和生物學(xué)功能。方法? 選用6周齡健康雄鼠，將10只db/db小鼠設(shè)為db/db組，10只db/+小鼠設(shè)為db/+組。采用AMD3100與CSF聯(lián)合動員骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞的方法，每只小鼠第1天注射AMD3100，后續(xù)連續(xù)注射5 d G-CSF，在第10天心臟采血制備EPCs。采用流式細(xì)胞儀檢測CD34+/CD133+/CD309+細(xì)胞的比例進(jìn)行鑒定，鑒定成功的EPCs采用CCK-8法、Matrigel檢測細(xì)胞增殖及成管功能。采用PCR檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物：血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子（SDF-1）、趨化因子受體4（CXCR4）基因表達(dá)情況。結(jié)果? ①從處理后的第3天開始，db/+組的OD450值較db/db組增高（P=0.05）;②0和48 h db/+組EPCs遷移面積分別為（204088.100±219.200）μm、 （144724.900±199.400）μm，大于db/db組的（200985.700±232.600）μm、（155075.300±213.100）μm（P<0.05）;③db/+組管腔形成數(shù)量為（29.330±1.764）個，多于db/db組的（24.000±2.082）個（P<0.05）。結(jié)論? 采用AMD3100聯(lián)合G-CSF動員2型糖尿病骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞的方法成功從外周血中分離出EPCs，經(jīng)體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)2型糖尿病狀態(tài)下EPCs的增殖，遷移和成管等功能均受損。

關(guān)鍵詞：糖尿病;內(nèi)皮祖細(xì)胞;聯(lián)合動員;移植

中圖分類號：R587.2;R-33? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.09.018

文章編號：1006-1959（2020）09-0057-06

Cultivation of Bone Marrow EPCs in Type 2 Diabetic Mice by AMD3100 and G-CSF

PAN Man-chang，LIN Xiao-ying，WANG Hong，LENG Min

（Department of Burns，the Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University，Kunming 650000， Yunnan，China）

Abstract：Objective? To study the culture method and biological function of AMD3100 combined with G-CSF on diabetic bone marrow endothelial progenitor cells.Methods? Six-week-old healthy male rats were selected， 10 db/db mice were set as db/db group， and 10 db/+ mice were set as db/+ group. AMD3100 and CSF were used to mobilize bone marrow endothelial progenitor cells. Each mouse was injected with AMD3100 on the first day， followed by continuous injection of G-CSF for 5 d， and blood was collected on the 10th day to prepare EPCs. Flow cytometry was used to detect the ratio of CD34+/CD133+/CD309+ cells for identification. Successful EPCs were identified by CCK-8 method and Matrigel to detect cell proliferation and tube formation function. PCR was used to detect cell surface markers： vascular endothelial growth factor （VEGF）， stromal cell-derived factor （SDF-1）， and chemokine receptor 4 （CXCR4） gene expression.Results? ①From the third day after treatment， the OD450 value of the db/+ group was higher than that of the db/db group （P=0.05）; ②The migration area of EPCs in the 0 and 48 h db/+ groups was （204088.100±219.200） μm， （144724.900±199.400） μm，（200985.700±232.600） μm and （155075.300±213.100） μm （P<0.05） greater than the db/db group; ③The number of lumens formed in the db/+group was （29.330±1.764）， which was more than （24.000±2.082） in the db/db group （P<0.05）.Conclusion? In this experiment， AMD3100 and G-CSF were used to mobilize type 2 diabetic bone marrow endothelial progenitor cells. EPCs were successfully isolated from peripheral blood， and the proliferation， migration and tube formation of EPCs in type 2 diabetes were impaired by in vitro culture.

Key words：Diabetes;Endothelial progenitor cells;Joint mobilization;Transplantation

內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是一類旁分泌各種血管生成因子參與內(nèi)皮細(xì)胞功能的前體細(xì)胞。自1997年首次用磁珠法從成人外周血（PB）中分離出來，越來越多證據(jù)表明EPCs在病理生理下參與血管新生[1-3]。近年大量研究發(fā)現(xiàn)糖尿病狀態(tài)下EPCs被“拘留”于骨髓，致EPCs在外周血中數(shù)量減少、功能障礙及生物學(xué)活性降低[3，4]。因此，糖尿病EPCs的動員和體外分離培養(yǎng)成為研究的熱點。近年雖國內(nèi)外很多有關(guān)EPCs報道[5-7]。但有關(guān)糖尿病EPCs聯(lián)合動員后外周血的分離培養(yǎng)研究報道尚少。既往研究發(fā)現(xiàn)糖尿病小鼠聯(lián)合動員第10天EPCs達(dá)到峰值。本研究以期通過聯(lián)合動員獲得糖尿病狀態(tài)下峰值的EPCs進(jìn)行體外培養(yǎng)，獲得外周血EPCs分離培養(yǎng)方法，并通過細(xì)胞增殖、遷移和成管等情況，獲得EPCs體外培養(yǎng)的可靠來源，為深入研究糖尿病EPCs的功能障礙及以后臨床應(yīng)用作參考。

1材料與方法

1.1實驗動物? 選取6 周齡SPF級db/db小鼠（25～30 g）和db/+小鼠（25～30 g）各10只雄性，db/db小鼠（糖尿病狀態(tài)） 是由C57小鼠（非糖尿病狀態(tài)）近親交配株常染色體隱性純合子遺傳衍化建立的2型糖尿病模型;db/+小鼠是由C57小鼠近親交配株常染色體雜合子遺傳衍化，無糖尿病癥狀。購自常州卡文斯實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（蘇）2016-0010。飼養(yǎng)于昆明泉港生物科技有限公司實驗動物中心飼養(yǎng)。

1.2主要的試劑和器材? AMD3100（Selleck 公司），rhG-CSF（齊魯制藥有限公司），0.9%氯化鈉注射液（上海百特醫(yī)療用品有限公司），肝素鈉注射液（江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司），PE/Cy7 anti-mouse CD34（abcam公司），APC anti-mouse CD133（abcam公司），PE anti-mouse CD309（Flk-1）（abcam公司），F(xiàn)AC SCantoⅡ流式儀（BD 公司）。

1.3實驗動物的分組及給藥方法? 選取6周齡健康雄鼠，將10只db/db小鼠設(shè)為db/db組，10只db/+小鼠設(shè)為db/+組。①db/db組動員方案為AMD3100+G-CSF：取10只db/db雄鼠，每只小鼠第1天注射AMD3100，后續(xù)連續(xù)注射5 d G-CSF，在第10天心臟采血制備EPCs。②db/+組：方法同db/db組。

1.4 AMD3100、G-CSF的注射劑量及配制? AMD3100和G-CSF動員EPCs皮下注射劑量參照國內(nèi)外文獻(xiàn)：AMD3100 6 mg/（kg·d），G-CSF 100 mg/（kg·d）[8，9]。AMD3100 注射液配制方法如下：將AMD3100用PBS溶解，配制成濃度為50 mg/ml的溶液，并置于-20 ℃冰箱中貯存?zhèn)溆谩６鳪-CSF可直接進(jìn)行皮下注射，置于4 ℃冰箱中貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.5實驗方法

1.5.1小鼠外周血中EPCs的分離培養(yǎng)及收集? 采用1%的戊巴比妥將實驗小鼠麻醉，用2.5 ml含有肝素的注射器在胸前心尖搏動最明顯部位采血。然后采用密度梯度離心法提取單個核細(xì)胞，用PBS洗滌? ?2次，用含10%胎牛血清的內(nèi)皮組細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液分別接種到50 ml培養(yǎng)瓶中，37℃、5% CO2件下培養(yǎng)，每3 d換液1次，收集15 d細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.5.2流式細(xì)胞術(shù)分析鑒定? 將細(xì)胞消化后用100 μl staining buffer重懸細(xì)胞，加入適量熒光標(biāo)記表面抗體（PE/Cy7 anti-mouse CD34/APC anti-mouse CD133/PE anti-mouse CD309）染色，室溫避光染色30 min，然后洗滌細(xì)胞并使用Guava easyCyteTM流式細(xì)胞儀（Millipore，Billerica，USA）分析。

1.5.3 EPCs熒光雙染色鑒定? 取14 d的細(xì)胞在含Dil-acLDL（10 μg/ml）和FITC-UEA-1（10 μg/ml）的培養(yǎng)液中避光孵育，然后在激光共聚焦熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.5.4 CCK-8細(xì)胞增殖實驗? 將細(xì)胞傳代在96孔板中，并處于對數(shù)生長期的各細(xì)胞消化、計數(shù)，均勻的鋪在96孔板（5000個/孔）。各孔加入10 μl CCK8試劑測定第1、3、5、7 天增殖情況，用酶標(biāo)儀檢測OD450（optical density），單位：nm，繪制曲線。

1.5.5劃痕遷移實驗? 將EPCs制成單細(xì)胞懸液接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板。EPCs接種48 h后用槍頭在單細(xì)胞層上輕輕劃一道傷痕。劃痕結(jié)束后用 PBS洗去除劃下細(xì)胞，拍照記錄0 、48 h對遷移面積拍照6張照片，并放大（×40），重復(fù)實驗3次。用軟件 Image J 計算細(xì)胞遷移率（Rn）：Rn（%）=24h遷移面積（0 h的劃痕面積-24 h的劃痕面積）與0 h面積的比值。

1.5.6管腔形成實驗? 在6孔板中加入100 μl基質(zhì)膠，常溫離心20 min、 1500 r/min。在培養(yǎng)箱放置1 h，水化1 ml EPCs后將其緩慢預(yù)鋪基質(zhì)膠孔內(nèi)，8 h后在顯微鏡（×100）下拍照，每個孔隨機(jī)拍照8張，重復(fù)實驗3次，每孔平均值為管腔形成數(shù)目，統(tǒng)計分析。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理? 使用 SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件處理所有的數(shù)據(jù)，計量資料采用（x±s）表示，相同時間點不同組別之間采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法，同一組別不同時間點之間的比較采用配對樣本t檢驗。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1實驗動物的基本情況? 兩組小鼠在動員藥物皮下注射結(jié)束后，精神狀況良好，飲食、體重?zé)o明顯變化，均無意外死亡情況。

2.2細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察? 分離的單個核細(xì)胞第2天細(xì)胞密集，較小的類圓形，呈懸浮狀態(tài);第6天細(xì)胞在倒置顯微鏡觀察下活力比較旺盛，折光度好，細(xì)胞形態(tài)呈橢圓形或梭形，大小不等，可以見部分細(xì)胞已貼壁。傳至第15天細(xì)胞逐漸變大，伸出偽足樣突起，成紡錘體形細(xì)胞，形態(tài)此時較穩(wěn)定，倒置顯微鏡下貼壁細(xì)胞透亮度增強(qiáng)，成單層細(xì)胞貼壁生長，見圖1。

2.3培養(yǎng)后EPCs鑒定

2.3.1流式細(xì)胞術(shù)分析? db/+小鼠外周血培養(yǎng)第15天 EPCs表達(dá)CD34、CD133及CD309，表達(dá)率分別為（72.23±3.84）%、（75.09±17.92）%及（80.98±0.53）%。db/db小鼠培養(yǎng)的第15 天EPCs表達(dá)CD34、CD133及CD309，表達(dá)率分別為（64.49±4.64）%、（85.19±18.39）%及（88.90±0.56）%，以上培養(yǎng)的細(xì)胞都是EPCs，見圖2。

2.3.2 EPCs熒光雙染色鑒定? 熒光顯微鏡觀察可見：PBMC提取培養(yǎng)15 d的EPC，細(xì)胞吞噬FITC-UEA-1示綠色熒光;細(xì)胞吞噬Dil-acLDL示紅色熒光;Merge為前兩張照片的融合圖，即EPCs是雙陽性染色攝取Dil-acLDL并結(jié)合FITC-UEA-1，呈現(xiàn)黃色熒光的細(xì)胞認(rèn)為是分化狀態(tài)的EPCs，見圖3。

2.4 CCK-8細(xì)胞增殖實驗? 通過對db/db與db/+小鼠外周血培養(yǎng)15天的EPCs，在第1、3、5、7天的增殖情況顯示：db/+小鼠EPCs的增殖曲線較陡。比較各時間點各組OD450時發(fā)現(xiàn)，從處理后的第3天開始，db/+組的OD450值較db/db組均顯著增高（F=9.777，P=0.000），見表1。

2.5 劃痕遷移實驗? 將EPCs接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)0 h與48 h遷移距離，結(jié)果顯示：0 h 和48 h db/+組EPCs遷移面積分別為（204088.1±219.2）μm、（144724.9±199.4）μm，大于db/db組的（200985.7±232.6）μm、（155075.3±213.1）μm，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖4。

2.6管腔形成實驗? 將培養(yǎng)的EPCs 種植在 Matrigel 上8 h形成毛細(xì)血管樣網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。db/+組管腔形成數(shù)量（29.330±1.764）個，大于db/db組的（24.000±2.082）個，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖5。

3討論

目前全球有4.25億糖尿病患者，每11位成人中就有1位罹患糖尿病，此外還有3.5億多糖尿病高危人群。預(yù)計到2045年，將會有近7億糖尿病患者。流行病學(xué)研究顯示，超過1/3的慢性難愈合創(chuàng)面患者是因糖尿病造成的，已經(jīng)代替創(chuàng)傷成為造成慢性難愈合創(chuàng)面的首要原因[10]。利用EPCs趨化到受損血管部位，修復(fù)受損內(nèi)皮細(xì)胞并增殖分化新的內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)而修復(fù)血管功能，近年來成為創(chuàng)面修復(fù)領(lǐng)域成為一個新策略。

EPCs可從骨髓、臍血、胚胎肝和外周血中（15∶10∶2∶1）分離培養(yǎng)獲得，而骨髓中所占比例最大[11]。成年后主要來源于骨髓，能夠替代損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞，維持血管內(nèi)皮的完整性[12]。外周血中EPCs主要來源于骨髓[13]。而糖尿病EPCs數(shù)量稀少，功能障礙及活性降低，成功培養(yǎng)糖尿病EPCs成為學(xué)者進(jìn)一步研究的難點。而本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)通過AMD3100聯(lián)合G-CSF可增加外周血中EPCs的數(shù)量，即EPCs在db/db小鼠外周血比例約占1.88%，在db/+小鼠外周血約占2.35%[9];而正常情況下EPCs僅占骨髓和外周血的0.01%[14]。該方法已經(jīng)大幅度提高了外周血中EPCs的含量，且占比高于骨髓。但其相關(guān)功能和活性變化還未明確，因此，本研究對糖尿病小鼠動員后的EPCs進(jìn)行分析。

本研究采用db/db小鼠是由C57小鼠近親交配株常染色體隱性遺傳衍化建立的2型糖尿病模型，以胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞功能減退為特征，該模型是未經(jīng)任何有意識的人為處置，在自然條件下發(fā)生糖尿病的小鼠模型，其優(yōu)點為模型小鼠糖尿病的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程與人類2型糖尿病相似，近階段具有較高的應(yīng)用價值[15，16]。首先，動員后采集外周血提取單個核細(xì)胞，用內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測EPCs特異性的表達(dá)產(chǎn)物CD34、CD133及CD309表達(dá)率達(dá)80%～90%，以及EPCs可攝取植物凝集素（UEA-1）和結(jié)合乙酰化低密度脂蛋白（acLDL），并表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞和祖細(xì)胞的混合表型，證實絕大多數(shù)的細(xì)胞是EPCs。細(xì)胞的形態(tài)和功能檢測也表明已經(jīng)成功分離培養(yǎng)出EPCs。本實驗采用密度離心法從動員后的小鼠外周血中分離單個核細(xì)胞，經(jīng)離心制成重懸的細(xì)胞，移入含有血管內(nèi)皮生長因子等多種生長因子的特殊培養(yǎng)基，誘導(dǎo)細(xì)胞分化成EPCs。在第6天倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞成橢圓形或梭形，大小不等，細(xì)胞密集，可見有部分細(xì)胞貼壁;此時細(xì)胞形態(tài)還未穩(wěn)定。到達(dá)第15天可見細(xì)胞逐漸伸出偽足，形成紡錘體樣，細(xì)胞基本完全貼壁，細(xì)胞融合成鋪路石樣生長。經(jīng)流失細(xì)胞術(shù)和攝取UEA-1和結(jié)合acLDL雙熒光染色鑒定已經(jīng)成功分離。

EPCs具有增殖，遷移和成管的生物學(xué)特性，在一定的刺激下可募集，歸巢到血管受損處，參與血管的重建和修復(fù)。目前認(rèn)為 EPCs 促進(jìn)血管新生的機(jī)制包括兩個方面：一方面是通過自身的分化增殖而形成新生血管，無需依賴原來的血管系統(tǒng);另一方面，EPCs 本身可以分泌血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等細(xì)胞因子，通過旁分泌效應(yīng)增強(qiáng)局部血管內(nèi)皮細(xì)胞，即增強(qiáng)血管生成效應(yīng)[17]。而大量研究發(fā)現(xiàn)糖尿病狀態(tài)下的EPCs功能和活性受到抑制[3，4]。Maiorino MI等[18]發(fā)現(xiàn)循環(huán)CD34+細(xì)胞水平的降低提示日本2型糖尿病患者冠心病的發(fā)生有關(guān)，此外，與非糖尿病患者相比，2型糖尿病損害了急性心肌梗死后CD133+細(xì)胞數(shù)量的增加和趨化反應(yīng)，這可能解釋了缺血后血管延遲愈合和心肌恢復(fù)[19]。有研究將健康人和糖尿病患者的EPCs移植到裸鼠損傷的頸動脈內(nèi)，發(fā)現(xiàn)與健康人EPCs比，糖尿病患者EPCs在體內(nèi)再內(nèi)皮化和抑制內(nèi)膜增厚能力更低。

本實驗檢測了2型糖尿病EPCs的體外功能，發(fā)現(xiàn)功能較正常小鼠低，這與之前的研究一致。糖尿病狀態(tài)下EPCs的數(shù)量和功能是修復(fù)創(chuàng)面的關(guān)鍵因素。目前雖有大量有關(guān)改善糖尿病環(huán)境下EPCs功能文獻(xiàn)報道。如抑制炎癥反應(yīng)，氧化應(yīng)激，促進(jìn)動員，抑制凋亡等。但闡明糖尿病EPCs功能障礙的機(jī)制對于將其應(yīng)用于創(chuàng)面修復(fù)是至關(guān)重要。而通過體內(nèi)動員，外周血體外擴(kuò)大增殖培養(yǎng)自體移植可以避免免疫反應(yīng)及骨髓穿刺的痛苦。這有望成為治療和預(yù)防糖尿病等難治愈創(chuàng)面的新希望。

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收稿日期：2020-03-10;修回日期：2020-03-22

編輯/肖婷婷

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目（編號：81660321）。

作者簡介：潘滿昌（1990.1-），男，云南昆明人，碩士，住院醫(yī)師，主要從事慢性創(chuàng)面愈合方向的研究

通訊作者：汪虹（1963.10-），男，云南昆明人，碩士，主任醫(yī)師，主要從事創(chuàng)面修復(fù)方向的研究