趙登超 王成忠 賈明* 孫銳*

(1齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）食品科學(xué)與工程學(xué)院，濟(jì)南 250353；2山東省林業(yè)科學(xué)研究院經(jīng)濟(jì)林研究所，濟(jì)南250014)

樹莓(Raspberry)，是享有“黃金水果”之稱的第3代保健水果，薔薇科(Rosaceae)薔薇亞科(Rosoideae Focke)懸鉤子屬(Rubus L.)，多年生落葉灌木果樹，廣泛分布于北溫帶、亞熱帶，我國(guó)黑龍江、遼寧、河南、江蘇、山東等多個(gè)省份均有栽培。

樹莓果口感獨(dú)特，富含花青素、鞣花酸和黃酮類物質(zhì)、水楊酸、抗壞血酸和樹莓苷等多種功能性成分[1]，具有抗菌、抗癌、抗炎、抗氧化、增強(qiáng)免疫力、預(yù)防疾病和保持人體健康等多種生物學(xué)作用[2-5]，但不耐儲(chǔ)運(yùn)。將新鮮樹莓發(fā)酵制成樹莓酒，可保留其營(yíng)養(yǎng)成分和生物活性物質(zhì)，適當(dāng)延長(zhǎng)保存時(shí)間。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，樹莓酒有一定的輔助降血脂功效[6]。此外，發(fā)酵制成的樹莓酒中還保留有鉀、鈣、鈉、鎂等大量元素及鋅、鐵、錫、銅等微量元素[7]。隨著人民生活水平的提高，口感更佳、具有營(yíng)養(yǎng)保健功能的發(fā)酵型果酒，在我國(guó)將具有廣闊的消費(fèi)市場(chǎng)和發(fā)展前景[8-9]。

目前市售樹莓果酒酸度略高，口感體驗(yàn)受到一定影響。為進(jìn)一步優(yōu)化樹莓酒品質(zhì)，本試驗(yàn)研究了酵母菌種、接種量、環(huán)境溫度、發(fā)酵時(shí)間、pH值等多個(gè)發(fā)酵過(guò)程的關(guān)鍵因素，以發(fā)酵液的酒精度、還原糖、總酸為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分析探究樹莓果酒發(fā)酵的最佳工藝條件，旨在得到最優(yōu)的樹莓果酒釀造條件，為樹莓酒的大規(guī)模生產(chǎn)提供一定的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與試劑

樹莓果采自河南新鄉(xiāng)樹莓種植基地。菌種：葡萄酒酵母（D254、EC1118、FX10、KD、71B、K1、ST），購(gòu)于煙臺(tái)帝伯仕、樂(lè)晗商貿(mào)公司。試劑：葡萄糖、3,5-二硝基水楊酸、氯化氫、氫氧化鈉、酚酞（德州曼巴）；碘、碘化鉀（山東德彥），以上試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

JYL-Y8PLUS打漿機(jī)（山東九陽(yáng)）；JW—1032離心機(jī)（安徽嘉文）；DSX-280KB30高壓滅菌鍋（上海申安）；722s分光光度計(jì)（上海儀電）；SPX-250B-Z恒溫培養(yǎng)箱（上海博田）；LCD-A500分析天平（福州華志）；YP10002電子天平（上海光正）；PHS-3C pH計(jì)（上海儀電）；酒精計(jì)（武強(qiáng)縣勝啟儀表廠）。

1.2 研究方法

1.2.1 樹莓酒發(fā)酵工藝優(yōu)化方法

1.2.1.1 適宜酵母的篩選 分別取7種不同葡萄酒酵母1 g接入100 mL純凈水中，30℃活化30 min，取4 mL活化后的酵母液分別接入pH值4.0、糖度20°Brix的200 g樹莓汁中，38℃下發(fā)酵6 d。測(cè)定發(fā)酵液酒精度、殘?zhí)橇?、總酸，篩選最適酵母菌種。

1.2.1.2 適宜接種量的篩選 取71B酵母活化液接入pH值4.0、糖度20°Brix的200 g樹莓汁中，接種量分別為0.10 mg/mL、0.20 mg/mL、0.30 mg/mL、0.40 mg/mL 和 0.50 mg/mL，38 ℃下發(fā)酵6 d。測(cè)定發(fā)酵液的酒精度、酸度和殘?zhí)橇浚_定最適接種量。

1.2.1.3 發(fā)酵溫度對(duì)酒精發(fā)酵的影響 取0.20 mg/mL的71B酵母活化接入pH值 4.0、糖度20°Brix的200 g樹莓汁中，不同溫度條件下發(fā)酵6 d，溫度分別設(shè)為27℃、30℃、33℃、36℃和39℃。測(cè)定發(fā)酵液的酒精度、酸度和殘?zhí)橇?，確定最適發(fā)酵溫度。

1.2.1.4 發(fā)酵pH值對(duì)酒精發(fā)酵的影響 取0.20 mg/mL的71B酵母活化液接入不同pH值、糖度20°Brix的200 g樹莓汁中，pH值分別設(shè)為 3.0、4.0、5.0、6.0 和 7.0，38 ℃下發(fā)酵 6 d。測(cè)定發(fā)酵液的酒精度、酸度及殘?zhí)橇?，確定最適pH值。

1.2.1.5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)酒精發(fā)酵的影響 取0.20 mg/mL的71B酵母活化液接入pH值4.00、糖度 20°Brix的 200 g樹莓汁中，38℃下分別培養(yǎng) 2 d、4 d、6 d、8 d 和 10 d。發(fā)酵結(jié)束時(shí)測(cè)定發(fā)酵液的酒精度、酸度和殘?zhí)橇?，確定適宜的發(fā)酵時(shí)間。

1.2.1.6 發(fā)酵期間酒精度與還原糖的變化 取0.20 mg/mL的71B酵母活化液接入pH值4.0、糖度20°Brix的200 g樹莓汁中，在38℃下發(fā)酵6 d。每1 d取樣檢測(cè)，記錄1～6 d的酒精含量及還原糖的變化。

1.2.2 理化分析檢測(cè)方法

還原糖(以葡萄糖計(jì))測(cè)定：3,5-二硝基水楊酸比色法[10]；酒精度測(cè)定：GB/T15038-2006酒精計(jì)法[11]；總酸(以乙酸計(jì))的測(cè)定：電位滴定法[12]；pH值測(cè)定：pH計(jì)法。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)分析

單個(gè)因素3次平行試驗(yàn)，計(jì)算試驗(yàn)結(jié)果平均值與標(biāo)準(zhǔn)差，利用SPSS 23統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用單因素方差分析，顯著性水平P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 最適酵母菌種篩選

添加不同酵母菌種發(fā)酵后總酸、酒精度、殘?zhí)橇康膶?duì)比結(jié)果見(jiàn)表1。酵母菌種是影響果酒發(fā)酵過(guò)程的重要因素之一，不同酵母菌種對(duì)還原糖的利用率不同導(dǎo)致其發(fā)酵能力、發(fā)酵速率及產(chǎn)香能力有較大的差異，從而影響果酒品質(zhì)[13]。由表1可看出，酵母菌種71B發(fā)酵所得酒精度（9.73%）、還原糖含量（0.35 mg/mL）居中，總酸最低，僅為8.11 g/L，為獲得最終酸度較低的樹莓酒，71B作為下一步試驗(yàn)的菌種。

表1 不同酵母菌酒精發(fā)酵的成分比較

2.2 最適接種量選擇

酵母菌接種量對(duì)樹莓酒發(fā)酵成分含量的影響見(jiàn)圖1。接種量不足會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，過(guò)高會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵液中氧含量不足[14]，適宜接種量可縮短發(fā)酵時(shí)間、降低樣品污染幾率。

由圖1可知，隨著酵母接種量的變化，總酸含量曲線波動(dòng)不大，酵母接種量對(duì)總酸含量的影響不明顯。酒精度隨接種量的增加呈先升高后降低的趨勢(shì)，原因在于接種量較低時(shí)，酵母菌生長(zhǎng)代謝速度較慢，酒精發(fā)酵速度低；接種量過(guò)高會(huì)導(dǎo)致酵母菌生長(zhǎng)速度過(guò)快、競(jìng)爭(zhēng)激烈，產(chǎn)生代謝廢物破壞酵母菌生存環(huán)境，不利于酒精的產(chǎn)生；與高辰哲等[15]研究紅樹莓酒發(fā)酵工藝的發(fā)現(xiàn)相似。還原糖含量隨著接種量增加而逐漸降低，這是由于接種量增加、酵母菌的生長(zhǎng)代謝速率隨之升高，還原糖消耗速度增加。綜合考慮還原糖含量和酒精度轉(zhuǎn)化率，選擇0.2 mg/mL為最適接種量。

2.3 適宜發(fā)酵溫度的選擇

適宜溫度范圍內(nèi)溫度越高發(fā)酵時(shí)間越短，溫度過(guò)高不利于酵母活性[16-17]。本次試驗(yàn)選取27～39℃，3℃為梯度，探究溫度對(duì)樹莓酒發(fā)酵的影響。發(fā)酵后樹莓酒各成分含量變化見(jiàn)圖2。

由圖2可知，隨溫度升高，酵母菌活力提升、生長(zhǎng)繁殖速度加快，產(chǎn)酸能力增強(qiáng)[18]，導(dǎo)致總酸含量隨之升高；以30℃為臨界值，還原糖最低(0.25 mg/mL)，酒精含量最高(10.17%，V/V)。低于30℃時(shí)，酒精含量隨溫度上升而升高，高于30℃時(shí)，酒精度隨溫度的上升而下降，發(fā)酵溫度39℃時(shí)酒精度僅為7.82%，V/V，其原因是酵母菌在較低溫度條件下生長(zhǎng)速度慢，酒精轉(zhuǎn)化效率低，溫度過(guò)高時(shí)，酵母菌衰老速度快、代謝能力不足，不利于還原糖轉(zhuǎn)化為酒精[19]。因此選擇總酸含量偏低、酒精轉(zhuǎn)化率高的30℃為樹莓酒的最適發(fā)酵溫度。

2.4 適宜發(fā)酵時(shí)間的選擇

發(fā)酵過(guò)程中總酸、還原糖、酒精度等成分含量變化見(jiàn)圖3。由圖3可知，隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，還原糖含量呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，6 d后趨于平緩，說(shuō)明還原糖不斷被消耗轉(zhuǎn)化為酒精，酒精度先升高后降低，發(fā)酵第6 d酒精含量最高(10.1%，V/V)，總酸含量較低(8.18 g/L)，之后酒精度逐漸降低。這是由于發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，酵母數(shù)量達(dá)到一定程度，代謝廢物積累，不利于酵母生長(zhǎng)，酵母菌衰老死亡，雜菌滋生，消耗酒精而使酒精度下降[20-21]。為確保酵母產(chǎn)生足夠量酒精，避免發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致醋酸發(fā)酵使酒精含量下降[22]，選擇6 d為樹莓酒發(fā)酵最佳時(shí)間。

2.5 不同pH值對(duì)酒精發(fā)酵的影響

不同pH值對(duì)發(fā)酵過(guò)程中總酸、還原糖、酒精成分含量的影響見(jiàn)圖4。

由圖4可知，pH值＜4.0時(shí)，酸度過(guò)高，影響酵母活性，抑制發(fā)酵過(guò)程，發(fā)酵效果差；pH值為4.0時(shí)，酒精含量最高，達(dá)10.23%，V/V，還原糖最低(0.27 mg/mL)，酵母發(fā)酵效率最高。隨pH值升高，發(fā)酵液易感染雜菌，且酸度抑制發(fā)酵過(guò)程，還原糖不降反升，酒精度、酸度均呈降低趨勢(shì)[23]，故最適宜pH值為4.0。

2.6 最佳條件發(fā)酵酒精度及時(shí)間的變化

依據(jù)之前試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)確定最佳發(fā)酵條件進(jìn)行發(fā)酵。每1 d取樣檢測(cè)，記錄酒精含量與還原糖變化，結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知，前2 d酒精發(fā)酵速度較快，第2 d時(shí)酒精度為6.93%，V/V，從第3 d起酒精度上升速度、還原糖消耗速度均有所減緩，第6 d時(shí)酒精含量達(dá)10.31%，V/V，還原糖降至0.24 mg/mL，總酸度平穩(wěn)，約為8.12 g/L。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)優(yōu)化樹莓酒的發(fā)酵條件，得出樹莓酒酒精發(fā)酵的最佳工藝條件為：酵母菌種71B、接種量0.2 mg/mL、溫度30℃、初始pH值為4.0、發(fā)酵時(shí)間6 d。該條件下所得樹莓酒酒精含量可達(dá)10.31%，V/V，酸度約8.12 g/L，產(chǎn)品酸度較低，口感溫和，品質(zhì)優(yōu)良。