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低溫馴化下斑馬魚LINE1的表達(dá)檢測(cè)*

2020-06-09 09:28:46陶筱帆謝婷婷李小霞羅軍濤白雅靜韓兵社張俊芳
漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展 2020年3期
關(guān)鍵詞:成魚生物體斑馬魚

陶筱帆 謝婷婷 李小霞 羅軍濤 白雅靜,2 韓兵社,2,3 張俊芳,2,3

低溫馴化下斑馬魚的表達(dá)檢測(cè)*

陶筱帆1謝婷婷1李小霞1羅軍濤1白雅靜1,2韓兵社1,2,3張俊芳1,2,3①

(1. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海 201306;2. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)科學(xué)國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心 上海 201306;3. 上海海洋大學(xué) 中國科學(xué)技術(shù)部海洋生物科學(xué)國際聯(lián)合研究中心 上海 201306)

長(zhǎng)散布核元件-1(Long spread nuclear element-1,)是跳躍基因。前期比較基因組研究發(fā)現(xiàn),南極魚經(jīng)歷漫長(zhǎng)的低溫適應(yīng)進(jìn)化后,與南極圈外的同亞目魚類相比較,在基因水平上的擴(kuò)增效率高達(dá)8~300倍,但的擴(kuò)增與魚類抵御寒冷之間的關(guān)系尚未明了。本實(shí)驗(yàn)對(duì)斑馬魚()胚胎成纖維細(xì)胞ZF4進(jìn)行了不同時(shí)間梯度的低溫處理(18℃、5 d和18℃、30 d),同時(shí)對(duì)斑馬魚成魚也進(jìn)行了不同時(shí)間的低溫處理(10℃, 3 h、6 h、1 d、3 d、5 d)。采用RT-qPCR檢測(cè)了的mRNA水平,并克隆了斑馬魚基因啟動(dòng)子區(qū),利用Luciferase雙熒光報(bào)告系統(tǒng),在ZF4細(xì)胞中驗(yàn)證5¢UTR在低溫壓力下的生物活性。結(jié)果顯示,短時(shí)間低溫處理下,ZF4細(xì)胞中mRNA水平有所降低,而在長(zhǎng)時(shí)間低溫處理中,的mRNA水平顯著升高。在成魚中,短時(shí)間低溫處理下,mRNA水平降低;長(zhǎng)期低溫處理下,mRNA水平顯著升高。在ZF4細(xì)胞中發(fā)現(xiàn),5¢UTR具有生物活性。在低溫處理(18℃,3 d)下,報(bào)告基因信號(hào)減弱,間接表明啟動(dòng)子活性減弱。研究結(jié)果表明,低溫壓力會(huì)影響在魚類中的表達(dá)。本研究為進(jìn)一步探究在魚類適應(yīng)低溫環(huán)境中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

;低溫;斑馬魚;ZF4細(xì)胞;啟動(dòng)子

真核生物基因組中存在大量的轉(zhuǎn)座子元件,包含、和。迄今為止,3種逆轉(zhuǎn)座子依舊具有活性:、和元素。逆轉(zhuǎn)座子包含5¢UTR、2個(gè)開放閱讀框及具有PolyA尾的3¢UTR (Dombroski, 1991)。屬跳躍基因,占人類基因組約17%,為自主轉(zhuǎn)座,通過RNA中間體自我傳播;而和為非自主轉(zhuǎn)座(Lander, 2001)。它們利用“復(fù)制–粘貼”機(jī)制,通過RNA中間體在整個(gè)基因組中繁殖,這一過程稱為逆轉(zhuǎn)錄(Lu, 2016)。逆轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座導(dǎo)致基因組改變,多數(shù)時(shí)候給基因組帶來負(fù)面影響,如:改變基因組結(jié)構(gòu)、影響基因表達(dá)、改變基因調(diào)控方式等(Gilbert, 2005; Tubio, 2014)。因此,宿主基因會(huì)通過啟動(dòng)子區(qū)域甲基化或者小RNA干擾等機(jī)制來抑制轉(zhuǎn)座(Kinomoto, 2007; Levin, 2011)。但研究表明,轉(zhuǎn)座元件與基因組是互益的(Faulkner, 2009),逆轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座可導(dǎo)致新基因產(chǎn)生,這對(duì)于物種多樣性和物種進(jìn)化具有積極意義(Hamon, 2011; Volff, 2000)。

魚類作為變溫動(dòng)物,水溫變化在很大程度上影響其生理及行為(Perry, 2005)。南極大陸經(jīng)歷了漫長(zhǎng)降溫,水溫常年處于0℃以下(Gordon, 2003),南極圈內(nèi)與南極圈外同亞目魚類相比較逆轉(zhuǎn)座子的擴(kuò)增倍率在8倍以上,有些甚至高達(dá)300倍(Chen, 2008)。這些基因可能參與了魚類適應(yīng)寒冷的過程,在漫長(zhǎng)的歷史進(jìn)化中變化。同時(shí),研究發(fā)現(xiàn),在面對(duì)環(huán)境壓力時(shí),逆轉(zhuǎn)座子的逆轉(zhuǎn)座活性會(huì)受到環(huán)境因素影響(Butelli, 2012)。因此,推測(cè)寒冷可能會(huì)導(dǎo)致魚類逆轉(zhuǎn)座子擴(kuò)增,并且可能與魚類適應(yīng)寒冷環(huán)境相關(guān)。

斑馬魚()體型纖細(xì),成體長(zhǎng)為3~4 cm,對(duì)水質(zhì)要求不高。孵出后約4個(gè)月達(dá)到性成熟,成熟魚每隔幾天可產(chǎn)卵一次,卵子體外受精,體外發(fā)育,胚胎發(fā)育速度快,胚體透明、子代多、遺傳背景清楚,容易進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作,易于在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)繁殖飼養(yǎng),與人類基因87%相似(Watanabe, 2016),作為一種模式生物應(yīng)用于生物學(xué)中(Howe, 2013; Sollars,2003)。斑馬魚ZF4細(xì)胞來自孵化后1 d的斑馬魚胚胎(Driever, 1993),被廣泛用于生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中(Hu, 2015)。為研究低溫對(duì)的影響,本研究檢測(cè)了斑馬魚ZF4細(xì)胞18℃培養(yǎng)5 d和30 d、10℃培養(yǎng)3 h、6 h、1 d、3 d、5 dmRNA水平以及通過報(bào)告基因監(jiān)測(cè)基因5¢UTR在18℃ 3 d的活性變化,為研究寒冷環(huán)境下魚類基因組中的表達(dá)變化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 ZF4細(xì)胞和斑馬魚

斑馬魚胚胎成纖維細(xì)胞ZF4購買于ATCC (American Type Culture Collection)。斑馬魚由實(shí)驗(yàn)室斑馬魚魚房飼養(yǎng),恒溫循環(huán)水系統(tǒng),水溫為27℃~ 28℃,pH為6.8~7.8,用豐年蟲()飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑和儀器

胎牛血清和胰蛋白酶、DMEM︰F12液體培養(yǎng)基購于Gibco公司;T4連接酶和限制性內(nèi)切酶購于NewEngland;SYBR Green購于羅氏公司;Lipofectamine3000購于英濰捷基貿(mào)易有限公司;RT-qPCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于寶生物工程(大連)有限公司;雙熒光報(bào)告系統(tǒng)試劑盒購于Promega公司,引物由上海生工生物工程有限公司合成(表1)。

表1 PCR擴(kuò)增引物

主要儀器:細(xì)胞低溫培養(yǎng)箱(Galaxy170R, eppendorf)、LightCycler 480Ⅱ(羅氏);酶標(biāo)儀(Bio-Rad公司);NanoDrop2000賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

應(yīng)用IDT引物設(shè)計(jì)軟件(http://sg.idtdna.com/ sessionTimeout.aspx)設(shè)計(jì)RT-qPCR引物(,, 表1)。采用Trizol方法提取斑馬魚細(xì)胞和肌肉組織的RNA,使用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào): RR047A)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn),以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板,進(jìn)行SYBR Green熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。PCR條件:95℃預(yù)變性3 min;95℃變性30 s,58℃退火30 s,72℃延伸30 s,共35個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min。每個(gè)樣品3個(gè)生物學(xué)重復(fù),相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算方法用2–ΔΔCt計(jì)算,β-actin作為內(nèi)參。

1.4 載體構(gòu)建及報(bào)告基因檢測(cè)

提取斑馬魚細(xì)胞基因組DNA,以基因組DNA為模板,上下游引物(,, 表1)分別引入酶切位點(diǎn)Ⅰ和Ⅰ,利用PCR擴(kuò)增基因5¢UTR,Ⅰ、Ⅰ酶切后用T4連接酶連接至載體PGL4.10中,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌內(nèi)。

選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的ZF4細(xì)胞接種于6孔板中,次日細(xì)胞完全貼壁后棄除培養(yǎng)基,按Lipofectamine3000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

采用Dual-Luciferase Reporter Assay System進(jìn)行雙熒光報(bào)告基因活性檢測(cè),按說明書進(jìn)行測(cè)定。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析方法

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用GraphPad Prism 5 (GraphPad software, 美國)軟件分析。的表達(dá)數(shù)據(jù)和雙熒光檢測(cè)數(shù)據(jù)均來自3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn),采用Student’s-test方法分析統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,<0.05表示具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 斑馬魚胚胎成纖維細(xì)胞(ZF4)和斑馬魚成魚在低溫處理下LINE1的表達(dá)變化

有研究表明,長(zhǎng)期生活在低溫環(huán)境的南極魚基因組與南極圈外同亞目魚類的基因組相比較,轉(zhuǎn)座家族發(fā)生了8~300倍的擴(kuò)增(Chen, 2008)。本研究選取的2個(gè)基因和進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。在斑馬魚成魚中,10℃為斑馬魚低溫生存的臨界溫度,因此,選取10℃作為魚類低溫處理溫度。與在常溫(28℃)飼養(yǎng)的成魚相比,在10℃低溫處理3 h和6 h的成魚肌肉組織中的mRNA水平(圖1A)有所下調(diào),而在10℃低溫處理1 d、3 d、5 d的成魚肌肉組織中mRNA水平顯著上調(diào),在成魚中的mRNA水平(圖1B)與的mRNA有相同趨勢(shì);在ZF4細(xì)胞中,選取18℃作為低溫環(huán)境(Han, 2016),與常溫(28℃)細(xì)胞對(duì)比,在18℃低溫處理5 d的細(xì)胞中的mRNA水平有所下調(diào),而在18℃低溫處理30 d的細(xì)胞的mRNA水平顯著上調(diào)(圖1C)。

2.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建與檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn),低溫環(huán)境會(huì)引起CpG位點(diǎn)甲基化的改變(Han, 2016)。猜測(cè)低溫環(huán)境會(huì)影響5¢UTR區(qū)域啟動(dòng)子的活性,以斑馬魚基因組DNA為模板,將2個(gè)基因的5¢UTR區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增(圖2)。

圖1 斑馬魚低溫處理下LINE1表達(dá)的變化(*: P<0.05.下同)

圖2 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

1:-promoter; 2:-promoter

載體PGL4.10-basic與PCR擴(kuò)增片段經(jīng)過Ⅰ和Ⅰ雙酶切后,在T4 DNA連接酶的作用下,將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物插入PGL4.10-basic載體中(圖3),將重組質(zhì)粒送上海生工生物工程有限公司測(cè)序,測(cè)序結(jié)果與PCR擴(kuò)增的基因序列相同,重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.3 雙熒光報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果

通過檢測(cè)相對(duì)熒光素酶活性,間接檢測(cè)5¢UTR區(qū)域啟動(dòng)子活性,5¢UTR區(qū)域啟動(dòng)子活性越高,熒光素酶活性發(fā)光值越高。海腎熒光素作為檢測(cè)系統(tǒng)內(nèi)參,當(dāng)5¢UTR區(qū)域啟動(dòng)子沒有生物學(xué)活性時(shí),不能檢測(cè)到熒光素酶活性發(fā)光值。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)常溫(28℃)培養(yǎng)ZF4細(xì)胞中,結(jié)果顯示,與陰性對(duì)照PGL4.10-basic相比,重組質(zhì)粒均能檢測(cè)到熒光素酶活性發(fā)光值,而PGL4.10-basic不能檢測(cè)到熒光素酶發(fā)光值,表明5¢UTR具有啟動(dòng)子活性(圖4A)。將重組質(zhì)粒與PGL4.10-basic和PGL3- promoter轉(zhuǎn)染到18℃低溫處理3 d的ZF4細(xì)胞中,PGL4.10-basic為陰性對(duì)照,PGL3-promoter為陽性對(duì)照,結(jié)果顯示,與常溫(28℃)細(xì)胞相比,重組質(zhì)粒在低溫處理下熒光素酶活性發(fā)光值均有不同程度的下降,表明短期低溫處理會(huì)影響基因5¢UTR區(qū)域啟動(dòng)子活性(圖4B)。

圖3 PGL4.10-LINE1 5¢UTR質(zhì)粒構(gòu)建

圖4 重組質(zhì)粒PGL4.10-LINE1-promoter轉(zhuǎn)染斑馬魚細(xì)胞后雙熒光素酶相對(duì)活性分析

3 討論

屬于最豐富的一類自主轉(zhuǎn)座因子。盡管多數(shù)被抑制活性,但依舊有很少一部分的具有活性,的插入雖與疾病相關(guān),但同樣影響基因組的進(jìn)化(Beck, 2011)。當(dāng)面對(duì)環(huán)境因素刺激時(shí),基因組進(jìn)行自身進(jìn)化誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座(McClintock, 1984),使生物對(duì)環(huán)境變化做出適應(yīng)性改變。在之前研究中發(fā)現(xiàn),南極圈內(nèi)物種與南極圈外物種轉(zhuǎn)座子擴(kuò)增效率存在巨大差異。在西西里血橙中,寒冷誘導(dǎo)逆轉(zhuǎn)座子的擴(kuò)增(Butelli, 2012)。這提示的擴(kuò)增可能與生物體對(duì)長(zhǎng)期寒冷環(huán)境的適應(yīng)相關(guān)。為了研究逆轉(zhuǎn)座子在長(zhǎng)期低溫環(huán)境下的大量擴(kuò)增是否與生物體對(duì)寒冷環(huán)境的適應(yīng)相關(guān),將ZF4細(xì)胞培養(yǎng)在18℃5 d,發(fā)現(xiàn)ZF4細(xì)胞生長(zhǎng)明顯停滯,而后20 d左右逐漸恢復(fù)生長(zhǎng)狀態(tài),盡管相比28℃依舊緩慢。本研究發(fā)現(xiàn),短期低溫處理誘導(dǎo)斑馬魚成魚及斑馬魚ZF4細(xì)胞的mRNA水平下調(diào),長(zhǎng)期低溫處理誘導(dǎo)斑馬魚成魚及斑馬魚ZF4細(xì)胞的mRNA水平顯著上調(diào),推測(cè)對(duì)生物體適應(yīng)外界低溫環(huán)境壓力可能有積極作用。生物體在寒冷環(huán)境下轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座水平升高,可能增加生物體基因型的多樣性,使其對(duì)環(huán)境壓力產(chǎn)生適應(yīng)性進(jìn)化。

在自然界中遵循著優(yōu)勝劣汰的法則,從生物的進(jìn)化開始,生物體內(nèi)有益于適應(yīng)環(huán)境、使生物體更好生存下去的基因會(huì)保留,垃圾基因會(huì)逐漸被淘汰,那么在長(zhǎng)期寒冷環(huán)境中,L1的顯著擴(kuò)增是否是生物體為了適應(yīng)寒冷環(huán)境而選擇的一種生物途徑?在之前研究中發(fā)現(xiàn),啟動(dòng)子甲基化水平在低溫環(huán)境下有所改變:18℃低溫處理ZF4細(xì)胞5 d,啟動(dòng)子甲基化水平升高,而低溫處理30 d時(shí),甲基化水平降低(Han, 2016)。生物體會(huì)通過甲基化水平來調(diào)節(jié)表達(dá)水平,與甲基化水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(Hata,1997),因此,甲基化水平升高時(shí),被抑制,mRNA水平呈下降趨勢(shì);當(dāng)甲基化水平降低時(shí),激活,mRNA水平呈上升趨勢(shì)。據(jù)此推測(cè),低溫環(huán)境會(huì)通過影響5¢UTR區(qū)域啟動(dòng)子活性,進(jìn)而影響的擴(kuò)增。構(gòu)建重組質(zhì)粒發(fā)現(xiàn),低溫確實(shí)能引起5¢UTR區(qū)域啟動(dòng)子活性改變,推測(cè)這種調(diào)節(jié)可能是生物體應(yīng)對(duì)外界低溫環(huán)境壓力的方式之一,L1對(duì)生物體適應(yīng)外界低溫環(huán)境壓力可能有積極作用。生物體在寒冷環(huán)境下轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座水平升高,可能增加生物體基因型的多樣性,使其對(duì)環(huán)境壓力產(chǎn)生適應(yīng)性進(jìn)化。

總之,本研究通過對(duì)斑馬魚細(xì)胞以及斑馬魚成魚不同時(shí)間的低溫處理,研究的表達(dá)變化,為更好了解在魚類寒冷適應(yīng)中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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Expression of) During Cold Acclimation

TAO Xiaofan1, XIE Tingting1, LI Xiaoxia1, LUO Juntao1, BAI Yajing1,2, HAN Bingshe1,2,3, ZHANG Junfang1,2,3①

(1. Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources, Ministry of Education, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306; 2. National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education, Ministry of Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306; 3. International Research Center for Marine Biosciences, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306)

The long-spread nuclear element-1 () retrotransposon is a mobile element in genome. Previous comparative genomic studies found that Antarctic Notothenioid fish underwent a long low-temperature adaptation evolution, and compared with Notothenioid fish outside the Antarctic circle,genes were duplicated by 8~300 fold.The link between this augmentation and the resistance of fish to cold is not known. In this study, zebrafish () embryonic fibroblasts ZF4 were exposed to a low temperature (18℃) for 5 days and 30 days, and adult zebrafish were exposed to a low temperature (10℃) for 3 h, 6 h, 1 d, 3 d, and 5 d. The mRNA expression ofwas examined using RT-qPCR. The promoter regions of zebrafishgene were cloned and the biological activity of5'UTR at low temperature were verified in ZF4 cells by using the dual-luciferase reporter system. The following results were obtained: (1) In ZF4 cells,mRNA expression was decreased by short-term low temperature treatment, but was significantly increased by long-term low temperature treatment. (2) In adult fish,mRNA expression was decreased by short-term low temperature treatment, but was significantly increased in long-term low temperature treatment. (3) The5'UTR was found to be biologically active in ZF4 cells. (4) It was found that during low temperature treatment (18℃, 3 d), the reporter gene signal was weakened, which indirectly indicated that thepromoter activity was weakened. The results showed that low temperature stress affectedexpression in fish, which presents a foundation for further study on the mechanism of action of

; Low temperature;; ZF4 cells; Promoter

Q74

A

2095-9869(2020)03-0088-06

10.19663/j.issn2095-9869.20190226001

張俊芳,教授,E-mail: jfzhang@shou.edu.cn

2019-02-26,

2019-03-14

* 國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31372516; 81770165)、上海市教育委員會(huì)“東方學(xué)者”計(jì)劃和上海市人才發(fā)展資金項(xiàng)目(201457)共同資助 [This work was supported by National Natural Science Foundation of China (31372516; 81770165), and Project of Shanghai Education Commission “Oriental Scholars” Program, and Shanghai Talent Development Fund Project (201457)]. 陶筱帆,E-mail: 512099587@qq.com

http://www.yykxjz.cn/

陶筱帆, 謝婷婷, 李小霞, 羅軍濤, 白雅靜, 韓兵社, 張俊芳. 低溫馴化下斑馬魚的表達(dá)檢測(cè). 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2020, 41(3): 88–93

Tao XF, Xie TT, Li XX, Luo JT, Bai YJ, Han BS, Zhang JF. Expression ofin zebrafish () during cold acclimation. Progress in Fishery Sciences, 2020, 41(3): 88–93

ZHANG Junfang, E-mail: jfzhang@shou.edu.cn

(編輯 馮小花)

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