王睿 王艷華 柴麗芬 吳琪瑞 吳凱 楊勇 楊曉玲 姜怡鄧?yán)罟鹬?/p>

寧夏醫(yī)科大學(xué)1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，2臨床醫(yī)學(xué)院，3國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)代謝性心血管疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（銀川750004）；4寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院（銀川750004）

衰老是一個(gè)多步驟的細(xì)胞程序，具有穩(wěn)定的細(xì)胞周期[1]，其已成為心血管疾病，糖尿病，癌癥等疾病的危險(xiǎn)性因素[2-3]。細(xì)胞衰老則為與年齡相關(guān)的細(xì)胞固有功能的喪失，其亦為許多疾病的重要危險(xiǎn)因子[4]，特別是心血管疾病。已有文獻(xiàn)[5]報(bào)道，心肌細(xì)胞衰老能夠引起心肌細(xì)胞水平的功能下降，導(dǎo)致心臟中能夠發(fā)揮正常功能的心肌細(xì)胞數(shù)目減少，對(duì)心臟功能產(chǎn)生消極影響。且相關(guān)研究[6]已證實(shí)，心肌細(xì)胞的衰老同時(shí)伴隨著細(xì)胞自噬水平的抑制。自噬是一種高度保守的真核降解過(guò)程，可將受損或不必要的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器輸送到溶酶體中進(jìn)行降解，其在心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用[7-8]。自噬的調(diào)節(jié)可能成為預(yù)防和控制心血管疾病的潛在靶標(biāo)。然而，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)自噬的因素和控制自噬的方法目前尚不清楚[9]。組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDACs）是一類蛋白酶，能夠轉(zhuǎn)移組蛋白上的乙?；瘓F(tuán)，對(duì)染色體的結(jié)構(gòu)修飾和基因表達(dá)調(diào)控發(fā)揮著重要作用。研究表明，高劑量硅酸鹽引起細(xì)胞自噬功能障礙，但是顯著降低和抑制HDACs 家族中的HDAC6 可以恢復(fù)自噬流量[10]。另外，HDACs家族中的另一成員HDAC2 被發(fā)現(xiàn)在心肌梗死小鼠模型中表達(dá)升高，進(jìn)而導(dǎo)致心肌肥厚[11]，但其在衰老心肌細(xì)胞中的作用還未見(jiàn)報(bào)道。因此，本文擬從D-galactose 誘導(dǎo)的衰老心肌細(xì)胞角度出發(fā)，探討HDAC2是否參與了衰老心肌細(xì)胞自噬水平的降低。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑大鼠心肌細(xì)胞H9c2 購(gòu)于中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞中心；超凈工作臺(tái)購(gòu)于中國(guó)香港Heal Force公司；熒光定量基因擴(kuò)增儀FTC-3000p 購(gòu)于加拿大Funglyn Biotech公司；-80℃低溫冰箱購(gòu)于美國(guó)Thermo Scientific公司；DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；D-galactose 購(gòu)于中國(guó)博奧拓達(dá)科技有限公司；小鼠來(lái)源抗p62抗體，兔來(lái)源抗LC3B抗體均購(gòu)于美國(guó)Abcam公司；Cy3 偶聯(lián)的山羊來(lái)源抗兔抗體

購(gòu)于美國(guó)Proteintech公司；兔來(lái)源抗HDAC2抗體購(gòu)于美國(guó)CST（Cell Signaling Technology）公司；β-半乳糖苷酶染色試劑盒購(gòu)于上海碧云天公司；總RNA 提取試劑盒購(gòu)于北京天根生化科技有限公司；cDNA 第一鏈合成試劑盒、qRT-PCR檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于北京Takara公司；HDAC2 引物、內(nèi)參（GAPDH）引物均購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 正常心肌細(xì)胞的培養(yǎng)及衰老心肌細(xì)胞模型的復(fù)制在DMEM 純高糖培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清及1%雙抗進(jìn)行H9c2 正常心肌細(xì)胞的培養(yǎng)，細(xì)胞放置于含有5%CO2的37℃培養(yǎng)箱里，每2 天換液1次。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%左右時(shí)，使用含有EDTA的胰酶消化后傳代，添加培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)。使用含有8 mg/mL D-galactose的衰老培養(yǎng)液刺激H9c2 細(xì)胞9 d 之后（課題組前期已篩出D-半乳糖刺激的濃度及時(shí)間[12]），β-半乳糖苷酶染色驗(yàn)證衰老心肌細(xì)胞模型是否復(fù)制成功。將正常H9c2 細(xì)胞組命名為control，將衰老心肌細(xì)胞組命名為D-galactose。

1.3 β-半乳糖苷酶染色鑒定細(xì)胞衰老情況Dgalactose 刺激H9c2 細(xì)胞衰老9 d 后，取出細(xì)胞，棄掉培養(yǎng)液，用PBS 緩沖液沖洗細(xì)胞1遍后，加入1×半乳糖苷酶染色固定液，室溫下孵育10～15 min，隨即用PBS 緩沖液清洗2遍，每遍3 min。再加入1 mL 半乳糖苷酶染色液，37℃培養(yǎng)箱中過(guò)夜，第2 天于普通光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 透射電鏡觀察心肌細(xì)胞的自噬結(jié)構(gòu)前固定：心肌細(xì)胞從培養(yǎng)箱中取出后，吸凈培養(yǎng)液并用緩沖液清洗細(xì)胞兩遍，隨后加1.5 mL 固定液平放靜置15 min。用細(xì)胞刮小心輕柔的將細(xì)胞收集到1.5 mL 離心管中，1 000 轉(zhuǎn)離心10 min。棄上清，加入固定液后輕輕彈勻。4℃放置50 min后，1 000轉(zhuǎn)離心10 min 并棄上清，再加入固定液。重復(fù)3次上述過(guò)程，最終放入4℃保存。后固定：1%鋨酸浸泡1 h，0.1 M 二甲砷酸鈉緩沖液沖洗兩次。脫水：梯度酒精脫水后，環(huán)氧丙烷滲透。包埋：完全包埋液浸泡，制作超薄切片，透射電鏡下觀察。

1.5 Western Blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)改變分別取正常心肌細(xì)胞及D-galactose 誘導(dǎo)的衰老心肌細(xì)胞，胰酶消化后接種于25 cm2的透氣培養(yǎng)瓶中，每組各3 瓶。待細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)，使用全蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞蛋白，12 000 轉(zhuǎn)離心15 min 后，收集上清即為全蛋白。采用BCA 法進(jìn)行蛋白定量，經(jīng)SDS-PAGE 電泳后，以恒流0.3 A，2 h為濕轉(zhuǎn)條件，轉(zhuǎn)至PVDF 膜上。5%脫脂牛奶封閉2 h，PBST 洗膜后一抗4℃孵育過(guò)夜。二抗室溫孵育2 h，加入顯色底物進(jìn)行曝光，最終結(jié)果為目的條帶與β-actin的灰度值之比。

1.6 qRT-PCR檢測(cè)HDAC2的mRNA表達(dá)在6孔板中接種正常心肌細(xì)胞及衰老心肌細(xì)胞，每組3孔。按照總RNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA，使用Takara的cDNA 第一鏈合成試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用Primer5.0 設(shè)計(jì)HDAC2 及GAPDH 引物（HDAC2 Forward：5′-GGGCTGCTTCAACCTAACTG-3′，Reverse：5′-TTCACAATCAAGGGCAACTG-3′；GAPDH Forward：5′-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3′，Reverse：5′-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3′），以cDNA為模版，采用Takara qRT-PCR檢測(cè)試劑盒擴(kuò)增HDAC2 基因。目的基因的相對(duì)量=2-△△Ct，△△Ct=[Ct（待測(cè)樣品）-Ct GAPDH（待測(cè)樣品）]-[Ct（校正樣品）-Ct GAPDH（校正樣品）]。

1.7 免疫熒光染色觀察自噬相關(guān)基因LC3B的表達(dá)細(xì)胞爬片用PBS 洗滌，用4%多聚甲醛固定30 min 后，PBS 沖洗干凈。H2O2處理10 min，PBS 洗凈。山羊血清封閉1 h，LC3B抗體（兔來(lái)源，1∶200稀釋液）4℃過(guò)夜，PBS 洗凈后將樣品與Cy3 偶聯(lián)的山羊抗兔IgG（1∶200 稀釋液）在37℃溫育1 h，隨后用PBS 洗滌3次。最后將細(xì)胞核用4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）復(fù)染5 min，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)熒光信號(hào)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用Prism 7.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以表示，計(jì)量資料兩組對(duì)比采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 衰老心肌細(xì)胞模型的建立H9c2 心肌細(xì)胞是貼壁細(xì)胞，細(xì)胞基本呈長(zhǎng)梭形且包膜完整。心肌細(xì)胞經(jīng)過(guò)D-半乳糖誘導(dǎo)9 d 后，通過(guò)β-半乳糖苷酶染色觀察衰老心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變。未經(jīng)衰老誘導(dǎo)的細(xì)胞染色結(jié)果呈陰性，而衰老誘導(dǎo)9 d的心肌細(xì)胞明顯呈現(xiàn)陽(yáng)性（藍(lán)色），由此，衰老心肌細(xì)胞模型建立成功。見(jiàn)圖1。

圖1 衰老心肌細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定Fig.1 Culture and identification of aging cardiomyocytes

2.2 透射電鏡觀察衰老心肌細(xì)胞中的自噬結(jié)構(gòu)透射電鏡結(jié)果顯示，正常心肌細(xì)胞中可見(jiàn)細(xì)胞器膜結(jié)構(gòu)完整，多個(gè)自噬小泡包裹待降解底物形成自噬小體結(jié)構(gòu)。而衰老誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中，線粒體數(shù)量明顯增多，少有自噬結(jié)構(gòu)形成，自噬水平降低。見(jiàn)圖2。

圖2 電鏡觀察control與D-galactose組中自噬水平的改變Fig.2 The changes of autophagy levels in the control and Dgalactose groups was observed by electron microscopy

2.3 自噬相關(guān)基因在衰老心肌細(xì)胞中的表達(dá)采用Western Blot檢測(cè)control及D-galactose組中，LC3BⅡ與LC3BⅠ的比值，及p62的表達(dá)。衰老心肌細(xì)胞與正常心肌細(xì)胞相比，LC3BⅡ/Ⅰ明顯降低，p62表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），表明心肌細(xì)胞衰老后自噬水平降低。見(jiàn)圖3。

2.4 HDAC2的mRNA及蛋白表達(dá)采用qRTPCR及Western Blot 分別檢測(cè)control與D-galactose組中HDAC2的mRNA及蛋白表達(dá)情況，當(dāng)正常心肌細(xì)胞給予衰老刺激后，HDAC2的mRNA 呈降低趨勢(shì)，蛋白表達(dá)也明顯降低，由此證實(shí)心肌細(xì)胞的衰老降低了HDAC2的表達(dá)情況。見(jiàn)圖4。

2.5 干擾HDAC2后檢測(cè)心肌細(xì)胞自噬水平的改變?yōu)檫M(jìn)一步明確HDAC2在衰老心肌細(xì)胞自噬水平降低中的作用，將HDAC2 干擾病毒及對(duì)照病毒感染衰老心肌細(xì)胞后，Western Blot 首先驗(yàn)證了病毒感染效率，隨后檢測(cè)了LC3B及p62的蛋白表達(dá)，最后通過(guò)免疫熒光染色觀察LC3B的表達(dá)情況。D-galactose組中的Ad-shHDAC2與Ad-shNC 相比，HDAC2 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），證實(shí)病毒感染成功。同時(shí)，干擾HDAC2 后LC3BⅡ/Ⅰ明顯降低，p62表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），與上述得出的HDAC2與自噬水平之間關(guān)系一致。LC3B 熒光強(qiáng)度更低，進(jìn)一步證實(shí)了HDAC2的低表達(dá)能夠促進(jìn)衰老心肌細(xì)胞自噬水平的降低。見(jiàn)圖5。

圖3 Control與D-galactose組中自噬相關(guān)基因的表達(dá)Fig.3 The expression of autophagy-related genes in control and D-galactose groups

圖4 control組與D-galactose組中HDAC2的mRNA及蛋白表達(dá)Fig.4 The mRNA and protein expressions of HDAC2 in control and D-galactose groups

2.6 H3K14ac的蛋白表達(dá)為探尋HDAC2在衰老心肌細(xì)胞自噬水平降低中的機(jī)制，采用Western Blot 檢測(cè)control 及D-galactose組中，H3K14ac的表達(dá)。如圖6A所示，衰老心肌細(xì)胞與正常心肌細(xì)胞相比，H3K14ac表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），表明心肌細(xì)胞衰老后H3K14的組蛋白乙?；皆黾印檫M(jìn)一步證實(shí)HDAC2在其中發(fā)揮的作用，將HDAC2 干擾病毒及對(duì)照病毒感染衰老心肌細(xì)胞后，Western Blot 檢測(cè)了H3K14ac的蛋白表達(dá)。如圖6B所示，干擾HDAC2 后H3K14ac蛋白表達(dá)進(jìn)一步增加，證實(shí)HDAC2在衰老心肌細(xì)胞中表達(dá)降低介導(dǎo)H3K14 高乙?；?。

3 討論

衰老通常以機(jī)體各項(xiàng)功能衰退為特征。在哺乳動(dòng)物中，衰老發(fā)生于多個(gè)器官系統(tǒng)并導(dǎo)致其逐漸惡化，最終引起組織細(xì)胞功能障礙[13]。隨著老齡化社會(huì)的來(lái)臨，人民生存質(zhì)量的提高及心血管疾病危險(xiǎn)因素的廣泛流行，我國(guó)心血管疾病的發(fā)病率及病死率逐年增長(zhǎng)，在年齡＞80歲的受試者中，心力衰竭發(fā)病率高達(dá)20%[14]，提示80歲以上的老年人是心血管疾病的高危人群。同時(shí)，心肌細(xì)胞隨著年齡增長(zhǎng)受到越來(lái)越多的損傷，發(fā)展成為衰老心肌細(xì)胞后最終可能導(dǎo)致心肌細(xì)胞出現(xiàn)結(jié)構(gòu)和功能的變化，因此深入探討老年心肌損傷成為亟待解決的重要課題。

圖5 感染HDAC2 干擾腺病毒后觀察自噬水平的改變。Fig.5 Changes in autophagy were observed after infection with Ad-shHDAC2

自噬是生物體內(nèi)持續(xù)存在的一個(gè)動(dòng)態(tài)的生物過(guò)程，衰老心肌細(xì)胞的自噬也參與了心血管疾病的發(fā)生發(fā)展[6]。臨床研究表明，心肌細(xì)胞的衰老與自噬水平改變之間存在密不可分的關(guān)系[15]，激活自噬可延緩心肌組織及細(xì)胞的衰老[16]。有文獻(xiàn)報(bào)道，自噬激動(dòng)劑雷帕霉素可改善衰老引起的心肌細(xì)胞收縮功能障礙和線粒體吞噬功能的喪失[17]。但心肌細(xì)胞衰老與自噬之間究竟存在何種調(diào)控機(jī)制目前尚不清楚。本課題培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞H9c2，并給予D-半乳糖誘導(dǎo)為衰老心肌細(xì)胞，進(jìn)而比較正常與衰老心肌細(xì)胞中自噬水平的差異。透射電鏡可以清晰的看到，正常心肌細(xì)胞中線粒體結(jié)構(gòu)完整，可見(jiàn)典型自噬結(jié)構(gòu)存在，衰老心肌細(xì)胞中細(xì)胞膜及細(xì)胞器膜結(jié)構(gòu)不完整。蛋白結(jié)果顯示，衰老心肌組比正常心肌組的LC3Ⅱ/Ⅰ水平明顯降低，p62水平明顯升高。已知LC3是自噬體膜上的標(biāo)記蛋白，在細(xì)胞內(nèi)以LC3Ⅰ和LC3Ⅱ兩種形式存在，伴隨著自噬的激活，LC3Ⅰ轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)C3Ⅱ并定位于自噬體膜，因此二者之比可以反映自噬水平的變化[18]。p62是選擇性自噬最重要的貨車蛋白，也被稱之為選擇性自噬受體，p62 結(jié)合泛素化蛋白進(jìn)入到自噬體后最終與溶酶體融合形成自噬溶酶體從而得到清除[19]。因此，本研究結(jié)果提示心肌細(xì)胞衰老同時(shí)伴隨著自噬水平的降低，這與已知文獻(xiàn)[18]報(bào)道一致。有關(guān)心肌細(xì)胞衰老引起自噬水平降低的可能解釋為，當(dāng)心肌細(xì)胞衰老后，AMP 依賴性蛋白激酶（AMPK）活性被抑制，以及Ⅰ類磷脂酰肌醇3-激酶（PI-3K）/Akt 信號(hào)傳導(dǎo)通路被激活，導(dǎo)致雷帕霉素（mTOR）信號(hào)傳導(dǎo)的過(guò)度激活，自噬水平被抑制[20]，但其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

圖6 H3K14ac的蛋白表達(dá)Fig.6 The protein expression of H3K14ac

HDAC2 屬于HDACs 家族中的一員，其與組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶（HAT）共同作用使得組蛋白的去乙酰化與乙?；教幱趧?dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。HDACs家族各成員主要定位于細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中，另有少部分定位于胞質(zhì)細(xì)胞器中，其在細(xì)胞的增殖，分化，凋亡中發(fā)揮重要的作用。在心血管系統(tǒng)疾病中，已證實(shí)HDACs 發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。研究[21]表明，HDAC3是在破裂的動(dòng)脈粥樣硬化病變中唯一上調(diào)的HDACs，HDAC3 敲除的巨噬細(xì)胞具有更強(qiáng)的脂質(zhì)流出能力，因此，HDAC3 能夠促進(jìn)脂質(zhì)沉積進(jìn)而增加斑塊的不穩(wěn)定性。另有研究[22]報(bào)道，抑制HDAC2的活性能夠改善心臟肥大反應(yīng)。以上證據(jù)為進(jìn)一步探討HDAC2在衰老心肌細(xì)胞自噬改變中的作用提供了可能。在本研究中，8 mg/mL D-半乳糖刺激心肌細(xì)胞后，Western Blot 及qRT-PCR檢測(cè)HDAC2的蛋白及mRNA表達(dá)，均發(fā)現(xiàn)HDAC2的表達(dá)明顯降低，提示HDAC2可能在衰老心肌細(xì)胞自噬水平降低中發(fā)揮了重要的作用，但目前尚無(wú)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。為進(jìn)一步明確HDAC2的作用效果，本研究構(gòu)建了HDAC2的干擾腺病毒，轉(zhuǎn)染衰老心肌細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，干擾HDAC2后的衰老心肌細(xì)胞自噬水平進(jìn)一步降低，證實(shí)HDAC2 確實(shí)在衰老心肌細(xì)胞自噬水平降低中發(fā)揮了重要的作用，同時(shí)提示HDAC2 能夠促進(jìn)衰老心肌細(xì)胞發(fā)生自噬。究竟有何種機(jī)制介導(dǎo)HDAC2促進(jìn)心肌細(xì)胞衰老后自噬水平的升高呢？通過(guò)查閱有關(guān)文獻(xiàn)得知，香煙煙霧能夠降低小鼠肺細(xì)胞中的HDAC2的水平及活性，進(jìn)而導(dǎo)致COPD患者肺部的持續(xù)炎癥，DNA 損傷和隨后的細(xì)胞衰老[23]，證實(shí)了HDAC2 參與調(diào)控了衰老細(xì)胞行為學(xué)的改變。另外，印苦楝內(nèi)酯（Nimbolide）通過(guò)調(diào)控HDAC2介導(dǎo)的表觀遺傳學(xué)修飾進(jìn)而影響乳腺癌中自噬水平的變化[24]。有趣的是，本研究也同樣發(fā)現(xiàn)在衰老心肌細(xì)胞中干擾HDAC2 后H3K14 乙?；缴摺Ｓ纱斯P者推測(cè)，HDAC2在衰老心肌細(xì)胞中表達(dá)降低介導(dǎo)H3K14 高乙?；?，使得乙?；瘎?dòng)態(tài)平衡被破壞，引起自噬相關(guān)基因表達(dá)降低，最終導(dǎo)致自噬水平的降低。

綜上所述，D-半乳糖能夠誘導(dǎo)H9c2 心肌細(xì)胞衰老，進(jìn)而引起自噬水平的降低，與此同時(shí)，HDAC2 參與調(diào)控衰老心肌細(xì)胞自噬水平降低這一現(xiàn)象推斷并證實(shí)了組蛋白乙?；赡茉谄渲邪l(fā)揮重要作用，這一發(fā)現(xiàn)暫無(wú)其它文獻(xiàn)報(bào)道。并且有臨床證據(jù)表明[25]，與青年人相比，健康長(zhǎng)壽老人中自噬相關(guān)蛋白Beclin1的水平較高，這也為本研究結(jié)果的準(zhǔn)確性提供了臨床支持。但是，本研究目前僅局限于細(xì)胞水平，未來(lái)還需要獲取更多的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)證明其在動(dòng)物水平中的作用，探尋其他引起衰老心肌細(xì)胞自噬水平降低的機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供更好的方案。