郝婷 商麗紅 哈春芳

1寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院（銀川750001）；2寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院婦科（銀川750004）

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EMs，簡稱內(nèi)異癥）是指子宮內(nèi)膜（間質(zhì)或腺體）出現(xiàn)在宮腔以外的部位導(dǎo)致以慢性盆腔疼痛、痛經(jīng)和不孕癥為主要癥狀的育齡婦女常見的婦科良性疾病[1]。雖然是良性疾病，但其浸潤周圍組織，甚至可以通過淋巴轉(zhuǎn)移至盆腔以外的組織，有很多腫瘤才有的遺傳學(xué)改變，高復(fù)發(fā)性，嚴(yán)重影響女性身心健康。目前該病發(fā)病機(jī)制仍不明確，研究顯示[2]EMs是一種子宮內(nèi)膜細(xì)胞活性增高所致的內(nèi)膜異常性基因病，與內(nèi)膜細(xì)胞的異地粘附、增殖及侵襲性增強(qiáng)有關(guān)。ERK1/2是MAPK 信息傳導(dǎo)通路中一個重要的因子，目前是MAPK 信號通路中研究最廣泛的，在細(xì)胞外活性因子調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)各種酶促反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用，與細(xì)胞增殖與凋亡關(guān)系密切[3]。研究顯示[4]ERK1/2與正常子宮內(nèi)膜比較，在內(nèi)異癥中的在位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞過度表達(dá)，并且磷酸化的水平也明顯增高，孕激素通過ERK1/2 刺激內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡，ERK1/2 能夠在子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機(jī)制中起著一定的作用，但其確切機(jī)制尚不十分清楚。腫瘤學(xué)研究顯示ERK通過Ras/Raf/MEK/ERK 通路介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移，內(nèi)異癥中研究甚少。脂聯(lián)素分子受體3（progestin and adipoQ receptor，PAQR3）是脂連素受體家族的成員之一，最近被定性為負(fù)性調(diào)節(jié)Ras/Raf/MEK/ERK 信號傳導(dǎo)的空間調(diào)節(jié)因子級聯(lián)。近年來研究顯示[5]PAQR3在多種惡性腫瘤疾病中抑制ERK表達(dá)影響細(xì)胞增殖、侵襲及凋亡，進(jìn)而促進(jìn)疾病發(fā)生發(fā)展。但PAQR3在內(nèi)異癥中對于ERK的表達(dá)及細(xì)胞侵襲性的影響仍未有報道。本研究通過構(gòu)建重組過表達(dá)PAQR3 慢病毒，探討其對于子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中ERK1/2表達(dá)及細(xì)胞侵襲性變化，為從機(jī)制上探尋EMs 新的治療靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料研究標(biāo)本（子宮內(nèi)膜組織）均來源于2018年9月至2019年6月寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院在婦科行“腹腔鏡下卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫剝除術(shù)”，術(shù)中“刮宮術(shù)”獲取子宮在位內(nèi)膜組織，術(shù)后經(jīng)病理科診斷為“卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫”的子宮內(nèi)膜異位癥育齡期婦女患者10例（術(shù)前月經(jīng)周期規(guī)律，均處于分泌期子宮內(nèi)膜，半年內(nèi)無其他器官器質(zhì)性病變無內(nèi)科疾病，術(shù)前未接受激素藥物治療，宮腔無占位等病變），年齡20～40歲，平均（30.860±5.216）歲。該研究已通過“寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院倫理委員會”的批準(zhǔn)授權(quán)，參加實驗及研究人員均已簽定知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 原代細(xì)胞培養(yǎng)術(shù)中獲取新鮮在位子宮內(nèi)膜組織放于液氮罐，快速轉(zhuǎn)運至細(xì)胞間，用PBS（磷酸鹽緩沖液）清洗3次，剪成約1 mm3大小的細(xì)小組織，加入含0.25%膠原酶IV（Gibio 17104-019）受熱消化吹打8 min，取上清液移入新離心管，含10%血清培養(yǎng)基終止消化，800 r/min 離心1 min，棄去上清，重新懸浮后加入培養(yǎng)皿中，37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，隔日換液1次，細(xì)胞達(dá)到90%左右的融合進(jìn)行細(xì)胞傳代及凍存。

1.2.2 細(xì)胞鑒定按照2 × 104/mL的細(xì)胞密度接種于6孔培養(yǎng)板，6 h后觀察待細(xì)胞貼壁50%后，PBS清洗標(biāo)本3次各1 min，4%多聚甲醛固定15 min；室溫干燥5 min；PBS 清洗3次各1 min，加入過氧化酶阻斷劑，置于37℃30 min；PBS清洗3次各1 min；加山羊血清，置于37℃30 min；一抗孵育（PBS配兔單克隆波形蛋白抗體1∶500；兔單克隆角蛋白1∶50；抗體均購自上海abcam公司；陰性對照用PBS），置于濕盒內(nèi)4℃過夜；PBS 清洗3次，各1 min；二抗（山羊抗兔單克隆抗體）濕盒37℃30 min 孵育；PBS 清洗3次，各1 min；加入鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化酶，置于37℃30 min；PBS 清洗3次各1 min；DAB 顯色避光約3～10 min ；蒸餾水清洗2次，各1 min；蘇木素復(fù)染30 s；自來水清洗10 min；95%乙醇脫水1～2 s，樹膠封片顯微鏡下觀察。

1.2.3 重組慢病毒PAQR3轉(zhuǎn)染細(xì)胞病毒由北京合生生物科技公司設(shè)計構(gòu)建合成，測定在位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞MOI=50（72 h 轉(zhuǎn)染效率80%以上）為最佳轉(zhuǎn)染；以每皿3×105個細(xì)胞接種于6 cm2培養(yǎng)皿，晃動細(xì)胞皿使其均勻分布，置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中過夜，待細(xì)胞貼壁30%～50%，無血清培養(yǎng)基換液，取MOI=50 作為最佳MOI 進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染，3組細(xì)胞吹散均勻混合，置37℃5%CO2培養(yǎng)箱8～12 h 后，繼續(xù)添加2 mL 含血清培養(yǎng)基后置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱，觀察細(xì)胞狀態(tài)必要時進(jìn)行細(xì)胞換液，培養(yǎng)72 h 后觀察細(xì)胞熒光進(jìn)行細(xì)胞傳代，以2 μg/mL 嘌呤霉素進(jìn)行篩選陽性穩(wěn)定克隆株。

1.2.4 Western blot當(dāng)子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)融合達(dá)70%以上時，用預(yù)冷PBS液沖洗3次，凱基蛋白提取試劑盒說明進(jìn)行蛋白提取，用BCA 蛋白檢測試劑盒檢測蛋白濃度后，置于沸水中10 min 使其蛋白變性。用8% SDS-PAGE 分離蛋白，然后轉(zhuǎn)移至醋酸纖維膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1.5 h，一抗孵育4℃過夜，次日TBST 沖洗3遍各5 min，二抗室溫下晃蕩1 h，TBST 沖洗5遍各5 min，最后，置于BIO-RAD 成像儀，加入ECL 增強(qiáng)液反應(yīng)1 min（1 mL A液+1 mL B液，混勻，覆蓋膜表面），最后根據(jù)曝光結(jié)果，運用Image J 計算光密度比值。

1.2.5 Transwell將Matrigel與無血清培養(yǎng)基按照1∶8 比例混合均勻，取Transwell 小室移入24 孔板中，每個小室上室內(nèi)加入100 μL 配置好Matrigel，避免底部接觸，37℃孵育過夜；取對數(shù)期生長間質(zhì)細(xì)胞，用0.25%的EDTA 胰酶將消化，加入無血清培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，計數(shù)1.5×104/mL，小室中加入細(xì)胞懸液200 μL（3 000個/孔）。下室中加入配置含20%血清的培養(yǎng)液500 μL，在37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后，取出小室吸出培養(yǎng)液，PBS 沖洗3遍，4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色30 min，PBS 沖洗3遍，棉簽蘸取多余水分，顯微鏡下每個小室選5個視野進(jìn)行計數(shù)拍照，計算平均值，最后比較各組干預(yù)前后細(xì)胞穿膜數(shù)的變化。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法每組實驗均重復(fù)3次以上，采用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料結(jié)果以（）表示，計量資料兩組間比較采用兩樣本t檢驗，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 原代子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞鑒定原代培養(yǎng)、分離、純化在位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞。以波形蛋白陽性，角蛋白陰性作為間質(zhì)細(xì)胞鑒定標(biāo)準(zhǔn)。通過免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定細(xì)胞，顯微鏡下觀察：波形蛋白組細(xì)胞大多呈梭形，染色呈棕黃色，細(xì)胞核明顯，提示波形蛋白染色陽性，而角蛋白組細(xì)胞也呈梭形表現(xiàn)，胞核明顯，但未見細(xì)胞染色，提示角蛋白染色陰性，PBS組細(xì)胞同角蛋白組，陰性表現(xiàn)，依據(jù)以上結(jié)果判定其為間質(zhì)細(xì)胞。每張細(xì)胞片取10個不同視野進(jìn)行間質(zhì)細(xì)胞計數(shù)，細(xì)胞純度可達(dá)（93.00±0.17）%。見圖1。

圖1 子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定（×100）Fig.1 Immunocytochemical identification of endometrial stromal cells

2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染效果帶有綠色熒光蛋白（green fluorescent protien，GFP）的慢病毒Lv-PAQR3 及空載慢病毒，兩者均轉(zhuǎn)染內(nèi)異癥在位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞，倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果，病毒組和空載組72 h 后GFP 下觀察陽性細(xì)胞布滿視野，表明轉(zhuǎn)染成功。見圖2。

圖2 倒置熒光顯微鏡下觀察72 h 子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的慢病毒轉(zhuǎn)染效果（×200）Fig.2 Effect of Lentiviral Transfection of Endometrial Stromal Cells in 72 h under an Inverted Fluorescence Microscope（×200）

2.3 3組細(xì)胞中PAQR3蛋白表達(dá)情況Western blot 檢測在位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后PAQR3 蛋白表達(dá)情況，Lv-hPAQR3 干預(yù)后病毒組PAQR3 蛋白表達(dá)情況較空載組明顯上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而空載組與空白組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3、4 及表1。

表1 3組細(xì)胞中PAQR3 蛋白表達(dá)相對量Tab.1 The relative amount of PAQR3 protein expression in three groups of cells ±s

表1 3組細(xì)胞中PAQR3 蛋白表達(dá)相對量Tab.1 The relative amount of PAQR3 protein expression in three groups of cells ±s

注：*與空載組比較，P＜0.05

組別病毒組空載組空白組PAQR3表達(dá)量0.954±0.317*0.268±0.130 0.293±0.154 F 值9.668 P 值0.013

圖3 慢病毒轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞中PAQR3 蛋白表達(dá)結(jié)果Fig.3 PAQR3 protein expression in cells of each group after lentivirus transfection

2.4 3組細(xì)胞中ERK1/2 蛋白表達(dá)情況Western blot 檢測在位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后ERK1/2 蛋白表達(dá)情況，Lv-hPAQR3 干預(yù)后病毒組ERK1/2 蛋白表達(dá)情況較空載組明顯下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而空載組與空白組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖5、6 及表2。

圖4 慢病毒轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞中PAQR3 蛋白表達(dá)影響Fig.4 Effect of PAQR3 protein expression in cells of various groups after lentivirus transfection

表2 3組細(xì)胞中ERK1/2 蛋白表達(dá)相對量Tab.2 The relative amount of ERK1/2 protein expression in three groups of cells±s

表2 3組細(xì)胞中ERK1/2 蛋白表達(dá)相對量Tab.2 The relative amount of ERK1/2 protein expression in three groups of cells±s

注：*與空載組比較，P＜0.05

組別病毒組空載組空白組ERK1/2表達(dá)量0.254±0.166*1.105±0.313 1.199±0.312 F 值10.926 P 值0.01

圖5 慢病毒轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞中ERK1/2 蛋白表達(dá)結(jié)果Fig.5 Expression of ERK1/2 protein in cells of each group after lentivirus transfection

2.5 3組細(xì)胞侵襲性變化情況Transwell 侵襲實驗檢測各個組細(xì)胞侵襲性變化結(jié)果，Lv-hPAQR3干預(yù)后病毒組細(xì)胞48 h 穿膜細(xì)胞數(shù)與空載組穿膜細(xì)胞數(shù)比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；空載組與空白組兩者比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖7 及表3。

圖6 慢病毒轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞中ERK1/2 蛋白表達(dá)影響Fig.6 Effect of ERK1/2 protein Expression in cells of various group after lentivirus transfection

表3 過表達(dá)PAQR3 對3組在位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞侵襲性的影響Tab.3 Effects of PAQR3 overexpression on invasiveness of eutopic endometrial stromal cells in three groups±s

表3 過表達(dá)PAQR3 對3組在位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞侵襲性的影響Tab.3 Effects of PAQR3 overexpression on invasiveness of eutopic endometrial stromal cells in three groups±s

注：**與空載組比較，P＜0.01

組別病毒組空載組空白組細(xì)胞穿膜數(shù)（個）65.8±4.438**97.8±3.271 99.6±4.700 F 值103.92 P 值＜0.001

圖7 各組在位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞48 h 侵襲效果（×400）Fig.7 48-hour invasion effect of eutopic endometrial stromal cells in each group（×400）

3 討論

子宮內(nèi)膜異位癥具有類似惡性腫瘤侵襲、遷移、血管生成以及凋亡等生物學(xué)特性，多條信號通路可能促進(jìn)其發(fā)生發(fā)展。目前治療方式仍以手術(shù)及藥物治療為主[6]。病理特點包括局部浸潤生長、遠(yuǎn)端移植、新生血管形成和術(shù)后高度復(fù)發(fā)[7]。目前EMs 發(fā)病機(jī)制仍然是妨礙疾病治療及預(yù)防的難點之一，研究顯示[8]解剖學(xué)因素、遺傳因素、內(nèi)環(huán)境、激素調(diào)節(jié)、免疫反應(yīng)和氧化應(yīng)激因子等都與EMs的發(fā)病機(jī)制相關(guān)。目前研究顯示[9]子宮內(nèi)膜異位癥中ERK1/2和MEK1/2表達(dá)上調(diào)，提示MAPK通路在子宮內(nèi)膜異位癥中過度活化。細(xì)胞從受到刺激至其出現(xiàn)相應(yīng)生物學(xué)效應(yīng)的改變過程中，MAPK 相應(yīng)出現(xiàn)多級激酶的變化，而在這一過程中，ERK1/2 活化是將信號從細(xì)胞膜表面受體轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核的關(guān)鍵，這一轉(zhuǎn)導(dǎo)過程有GTPase2Ras、Ras21和MEK 雙特異性激酶等上游元素參與，Ras/Raf/MEK/ERK 細(xì)胞信號傳遞通路中ERK1/2是重要的信號分子[10-13]。

課題組前期通過表達(dá)譜芯片技術(shù)分析EMs在位、異位內(nèi)膜中基因表達(dá)譜差異，發(fā)現(xiàn)MAPK、VEFG、PKC、Ras、ERK、NF-κB和PI3K 等因子顯著上調(diào)，各因子間具體調(diào)控機(jī)制不明確。前期研究已驗證子宮內(nèi)膜異位癥中ERK1/2 較正常內(nèi)膜呈高表達(dá)，需進(jìn)一步明確ERK1/2 及其對EMs 細(xì)胞侵襲性作用機(jī)制。結(jié)合腫瘤學(xué)研究顯示ERK 通過Ras/Raf/MEK/ERK 通路介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，結(jié)合前期研究機(jī)制統(tǒng)一指向Ras/Raf/MEK/ERK 信號通路。PAQR3 作為Ras/Raf/MEK/ERK 通路特異負(fù)性調(diào)節(jié)因子，本研究采用重組過表達(dá)PAQR3 慢病毒轉(zhuǎn)染EMs在位原代間質(zhì)細(xì)胞抑制Ras/Raf/MEK/ERK 信號通路，運用Western blot 及Transwell實驗方法，結(jié)果顯示實驗組過表達(dá)PAQR3 后ERK1/2 蛋白表達(dá)較陰性對照組呈下降趨勢，且實驗組較陰性對照組細(xì)胞侵襲性明顯受抑制，陰性對照組與空白對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。說明在子宮內(nèi)膜異位癥中ERK 可能是通過Ras/Raf/MEK/ERK 信號通路發(fā)揮作用，影響細(xì)胞侵襲性變化，進(jìn)而促進(jìn)子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生發(fā)展。

ERK1/2[14]是一種細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶，主要被各種生長因子、離子射線、過氧化氫等磷酸化激活發(fā)揮作用。ERK1/2[15]主要定位于胞質(zhì)，受細(xì)胞外炎性因子刺激并由其上游激酶MEK 激活，繼而入核發(fā)揮作用。Matsuzaki S 教授等研究表明在內(nèi)異癥及深部浸潤內(nèi)異癥患者上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中ERK1/2表達(dá)及磷酸化程度較正常內(nèi)膜相比顯著增高[16]，提示ERK1/2 可能在子宮內(nèi)膜異位癥侵襲和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。近年研究[17]發(fā)現(xiàn)PAQR3 作為一種抑癌新基因在許多腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及凋亡變化過程中發(fā)揮重要作用。PAQR3是一種特異定位于高爾基體膜上的細(xì)胞器膜蛋白，PAQR3 已被認(rèn)定為許多腫瘤的抑制因子，PAQR3 過度表達(dá)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、種植和血管生成[18-19]，其主要作用是將胞質(zhì)內(nèi)的B-Raf和C-Raf 激酶錨定在高爾基體上，造成Raf 激酶空間分布變化，干擾Raf 激酶與上游活化G 蛋白Ras-GTP 以及下游底物MEK 激酶的結(jié)合，阻斷和抑制其活化信號的傳遞，進(jìn)而阻礙絲裂原信號Ras/Raf/MEK/ERK 通路的活化[20]，其在能量代謝，細(xì)胞凋亡，腫瘤發(fā)生等方面發(fā)揮重要調(diào)控作用[21-22]。在人類白血病研究中其可通過抑制ERK表達(dá)進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[23]。依據(jù)本實驗結(jié)果顯示子宮內(nèi)膜異位癥中過表達(dá)PAQR3 抑制Ras/Raf/MEK/ERK 信號通路，可下調(diào)ERK1/2 蛋白表達(dá)并且抑制細(xì)胞侵襲性變化。這一發(fā)現(xiàn)是從機(jī)制和源頭上尋找內(nèi)異癥發(fā)生發(fā)展的原因，進(jìn)一步揭示復(fù)發(fā)的關(guān)鍵。

綜上所述，ERK1/2在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，而該作用可能是通過Ras/Raf/MEK/ERK 通路調(diào)控，但具體調(diào)節(jié)機(jī)制仍需進(jìn)一步明確。EMs 作為一種多因素導(dǎo)致的基因混亂疾病，對于其研究仍任重道遠(yuǎn)。