楊雷 魏麗軍 王福花 曾勇

1山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院（太原030013）；山西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2婦一科，

3分子生物室（太原030013）

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一。由于卵巢位于盆腔深部，早期卵巢癌發(fā)病無明顯癥狀且無特異性的腫瘤標(biāo)記物進(jìn)行診斷，大多數(shù)卵巢癌患者初次診斷即為晚期。而且卵巢癌易復(fù)發(fā)和化療耐藥，使得晚期卵巢癌患者5年生存率低于30%[1]。目前卵巢腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)聯(lián)合化療是治療卵巢癌的重要手段，而順鉑等鉑類藥物是目前卵巢癌一線化療藥物[2]?；颊哳A(yù)后很大程度上取決于是否對鉑類化療藥物敏感。由于部分患者對化療藥物耐藥而導(dǎo)致化療失敗，從而縮短生存期。上皮性卵巢癌為卵巢癌中最為常見的類型（占80%～85%）。上皮性卵巢癌相關(guān)基因表達(dá)異常是導(dǎo)致化療耐藥的重要因素之一。因此近年來卵巢癌化療耐藥相關(guān)基因也成為上皮性卵巢癌研究的熱點。

在筆者前期研究[3]中利用miRNA表達(dá)譜基因芯片技術(shù)篩選出與上皮性卵巢癌化療耐藥相關(guān)低表達(dá)量的miR-93-3p。在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用兩種生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-93-3p 可能的靶基因，結(jié)合文獻(xiàn)分析靶基因可能參與上皮性卵巢癌化療耐藥的生物學(xué)過程及信號通路。本研究采用RT-PCR 技術(shù)檢測miR-93-3p和CDC42在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)，比較上皮性卵巢癌化療敏感和化療耐藥組織中的表達(dá)水平。探討miR-93-3p在上皮性卵巢癌化療耐藥中可能的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2015年8月至2018年7月間就診于山西省腫瘤醫(yī)院111例上皮性卵巢癌患者的組織學(xué)標(biāo)本。根據(jù)NCCN 公布的卵巢癌臨床實踐指南，將患者分為鉑類化療敏感組與耐藥組。其中鉑類化療敏感組44例，耐藥組67例?；颊吣挲g35～62歲，耐藥組平均年齡49.9歲，敏感組平均年齡51.1歲。將鉑類化療敏感組定義為對照組。上皮性卵巢癌化療耐藥定義標(biāo)準(zhǔn)：腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)后對初次化療有反應(yīng)，但完成化療后相對較短的時間通常6個月內(nèi)復(fù)發(fā)者；上皮性卵巢癌化療敏感定義標(biāo)準(zhǔn)：腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)后對初次化療有明確反映，并達(dá)到臨床完全緩解，停用化療藥6個月后復(fù)發(fā)者。上皮性卵巢癌復(fù)發(fā)的證據(jù)和跡象：（1）CA125水平升高；（2）出現(xiàn)胸、腹水；（3）體檢發(fā)現(xiàn)腫塊；（4）影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)腫塊；（5）不明原因腸梗阻。存在上述兩項或兩項以上指標(biāo)即可考慮為上皮性卵巢癌復(fù)發(fā)。納入實驗標(biāo)準(zhǔn)為：（1）患者年齡35～62歲；（2）無其他惡性腫瘤病史；（3）術(shù)前均未接受任何抗腫瘤藥物治療且未行其他輔助治療；（4）接受卵巢癌細(xì)胞減滅術(shù)后經(jīng)病理學(xué)證實為上皮性卵巢癌并在術(shù)后完整規(guī)范接受紫杉醇聯(lián)合鉑類藥物化療患者。所有組織標(biāo)本取出后0.5 h 內(nèi)置于的凍存管中，液氮冷凍保存?zhèn)溆?。本研究?jīng)山西醫(yī)科大學(xué)附屬山西省腫瘤醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號：201507），受試者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑TaqMan Real-time PCR miRNA Array、SYBR?Select Master Mix，購自ABI公司；RNAiso Plus，購自TaKaRa公司；the First Strand cDNA Synthesis Kit，購自Tiangen?公司。

1.3 方法

1.3.1 miR-93-3p靶基因預(yù)測及功能、生物學(xué)通路分析通過miRD、mirTarbas 等生物信息學(xué)分析軟件對miR-93-3p 進(jìn)行靶基因預(yù)測分析，選取2種軟件共同結(jié)果作為其可能靶基因，并對每個micro RNA所有靶基因在DAVID 網(wǎng)站進(jìn)行KEGG和功能通路分析（P＜0.05）。

1.3.2 實時熒光定量PCR檢測（1）運用RNAiso Plus，在無RNase 條件下提取卵巢癌組織總RNA。使用Nanodrop2000c 分光光度儀進(jìn)行RNA濃度及純度的測定，測量到260 nm和280 nm的吸光度值的比值（OD260/OD280）均在1.8～2.0間，用于進(jìn)一步實驗。（2）使用the First Strand cDNA Synthesis kit，將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反應(yīng)條件：25℃10 min，37℃120 min，85℃5 min。（3）將合成的cDNA 作為定量PCR 模板，按照miScript SYBR Green PCR Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明對cDNA 實施RT-PCR 擴(kuò)增。用20 μL反應(yīng)體系，標(biāo)本使用U6作為內(nèi)參。擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃5 min，95℃45 s，60℃30 s，40 cycles。每一樣本PCR 反應(yīng)重復(fù)3次。miR-93-3p 引物序列：上游5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；下游5′-ACUGCUGAGCUAGCACUU-3′。CDC42 引物序列：上游5′-CCATCGGAATATGTACCGACTG-3′；下游：5′-CTCAGCGGTCGTATCTGTCA-3′。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 24.0 對PCR 數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。每個樣品目的基因的ΔCt 值用內(nèi)參基因進(jìn)行處理（ΔCt=Ct目的基因-CtU6，U6為內(nèi)參，隨后對化療敏感組ΔCt 取平均值，記為ΔCt敏感均值。ΔΔCt=ΔCt目的基因-ΔCt敏感均值），最后計算樣品目的基因相對表達(dá)量即2-ΔΔCT?；熌退幗M織及化療敏感組織數(shù)據(jù)采用t檢驗分析比較，數(shù)據(jù)以表示。miR-93-3p和CDC42的相關(guān)性采用Spearman 相關(guān)性檢驗。

2 結(jié)果

2.1 miR-93-3p靶基因預(yù)測及生物信息學(xué)分析對miR-93-3p 通過2個數(shù)據(jù)庫（miRD，mirTarbas）預(yù)測靶基因信息，把2個數(shù)據(jù)庫的預(yù)測結(jié)果取交集作為預(yù)測結(jié)果，可以降低預(yù)測靶基因的假陽性率。運用2種生物信息學(xué)軟件分析預(yù)測到miR-93-3p 可能的靶基因有ACTB，CDC42，ENAH，MAP2K1，PNMA5，ING3，ABR 等126個。通過靶基因GO 功能注釋分析發(fā)現(xiàn)：miR-93-3p 預(yù)測到靶基因參與的生物學(xué)過程主要富集在RNA 代謝過程調(diào)節(jié)、細(xì)胞分化、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)結(jié)合等方面（P＜0.05）。通過靶基因KEGG 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分析發(fā)現(xiàn)：miR-93-3p 靶基因顯著富集在焦點粘連、癌癥通路、蛋白質(zhì)分解等基因通路（P＜0.05）。結(jié)果見圖1、2。結(jié)合藥物代謝及化療耐藥相關(guān)理論和相關(guān)文獻(xiàn)，并將生物學(xué)過程中所包含的靶基因與信號通路中所包含的靶基因取交集，CDC42 可能通過miR-93-3p的調(diào)控Focal adhesion 信號通路參與上皮性卵巢癌化療耐藥。

圖1 miR-93-3p 預(yù)測靶基因GO 功能注釋分析Fig.1 GO function annotation analysis of miR-93-3p predictive target gene

圖2 miR-93-3p 靶基因KEGG 通路富集分析Fig.2 KEGG pathway enrichment analysis of miR-93-3p target genes

2.2 RT-PCR檢測上皮性卵巢癌組織中miR-93-3p和CDC42的表達(dá)水平

2.2.1 實時定量PCR檢測miR-93-3p、CDC42和U6內(nèi)參的擴(kuò)增曲線和溶解曲線miR-93-3p、CDC42和U6 內(nèi)參擴(kuò)增曲線呈S型，曲線光滑，拐點清楚（圖3、5）；miR-93-3p、CDC42和U6 內(nèi)參溶解曲線呈單峰，提示擴(kuò)增的特異性較好，結(jié)果可信（圖4、6）。

2.2.2 miR-93-3p、CDC42在化療耐藥和敏感組織中的表達(dá)水平比較實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，miR-93-3p在化療耐藥組中的相對表達(dá)量顯著低于敏感組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表1）。CDC42在化療耐藥組中的相對表達(dá)量顯著高于敏感組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表1）。

圖3 miR-93-3p和U6 內(nèi)參擴(kuò)增曲線Fig.3 miR-93-3p and U6 internal parameter amplification curves

2.3 miR-93-3p、CDC42表達(dá)量與上皮性卵巢癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系按照上皮性卵巢癌患者不同臨床特征對研究對象進(jìn)行分組，miR-93-3p在臨床分期中的表達(dá)量隨著期別升高呈現(xiàn)明顯下調(diào)，CDC42的表達(dá)量隨著期別升高呈現(xiàn)明顯上調(diào)（P＜0.05）。miR-93-3p在不同的組織學(xué)分級中，隨著分級升高，腫瘤惡性程度增加，miR-93-3p表達(dá)水平呈現(xiàn)明顯下調(diào)，而CDC42表達(dá)水平呈現(xiàn)明顯上調(diào)（P＜0.05）。有淋巴轉(zhuǎn)移及無淋巴轉(zhuǎn)移組中，miR-93-3p的表達(dá)在淋巴轉(zhuǎn)移組較淋巴無轉(zhuǎn)移組明顯下調(diào)，CDC42的表達(dá)在淋巴轉(zhuǎn)移組較淋巴無轉(zhuǎn)移組明顯上調(diào)（P＜0.05）。而與年齡無明顯相關(guān)（P＞0.05）。見表2。

圖4 miR-93-3p和U6 內(nèi)參溶解曲線Fig.4 The Melt curves of miR-93-3p and U6

圖5 CDC42和U6 內(nèi)參擴(kuò)增曲線Fig.5 CDC42 and U6 internal parameter amplification curves

圖6 CDC42和U6 內(nèi)參溶解曲線Fig.6 The Melt curves of CDC42 and U6

表1 miR-93-3p、CDC42在化療耐藥和敏感組織中的表達(dá)水平比較Tab.1 Comparison of expression levels of miR-93-3p and CDC42 in chemotherapy-resistant and sensitive tissues（n=111）±s

表1 miR-93-3p、CDC42在化療耐藥和敏感組織中的表達(dá)水平比較Tab.1 Comparison of expression levels of miR-93-3p and CDC42 in chemotherapy-resistant and sensitive tissues（n=111）±s

組別敏感組耐藥組miR-93-3p 2-ΔΔCT 1.303±1.000 0.075±0.052 P 值0.023 CDC42 2-ΔΔCT 1.069±0.447 1.704±0.705 P 值0.017

表2 上皮性卵巢癌組織miR-93-3p、CDC42 相對表達(dá)量與部分臨床病理參數(shù)的關(guān)系Tab.2 Relationship between relative expressions of miR-93-3p and CDC42 in epithelial ovarian cancer tissues and some clinicopathological parameters±s

表2 上皮性卵巢癌組織miR-93-3p、CDC42 相對表達(dá)量與部分臨床病理參數(shù)的關(guān)系Tab.2 Relationship between relative expressions of miR-93-3p and CDC42 in epithelial ovarian cancer tissues and some clinicopathological parameters±s

注：G1級為高分化，惡性度相對較低；G3為低分化，惡性度高；N1組為有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，N0組為無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

病理參數(shù)年齡＜50≥50臨床分期Ⅰ～ⅡⅢ～Ⅳ組織學(xué)分級G1 G2 G3淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移N1 N0例數(shù)53 58 61 50 16 34 61 60 51 miR-93-3P 1.36±0.56 1.34±1.02 1.47±1.70 1.16±1.47 1.33±1.22 1.07±0.71 0.12±0.22 0.28±0.54 1.05±1.56 P 值0.323 0.031 0.028 0.001 CDC42 0.38±0.17 0.36±0.25 0.31±0.03 0.91±0.47 0.21±0.13 0.81±0.37 0.95±0.23 0.88±0.36 0.45±0.41 P 值0.562 0.043 0.001 0.037

2.4 miR-93-3p與CDC42表達(dá)的相關(guān)性111例卵巢癌患者組織中miR-93-3p與CDC42表達(dá)經(jīng)Spearman 相關(guān)性分析顯示，miR-93-3p與CDC42表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.469，P＜0.01）。

3 討論

miRNA是非編碼RNA 家族的成員之一，長度約20～25個核苷酸，在真核生物中首次被發(fā)現(xiàn)[4]，以往認(rèn)為miRNA 無生物學(xué)功能。當(dāng)前研究[5]發(fā)現(xiàn)，人類各種類型腫瘤發(fā)生與miRNA的異常表達(dá)相關(guān)。miRNA 能夠通過控制其靶mRNA的表達(dá)來促進(jìn)腫瘤的生長、侵襲、血管生成和免疫逃避，調(diào)控靶基因的表達(dá)[6-7]。miRNA與靶基因的3′端非翻譯區(qū)互補(bǔ)結(jié)合后，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)節(jié)作用，并且同時調(diào)控多個目標(biāo)基因，此為miRNA 作用廣泛的重要機(jī)理[8]。與腫瘤相關(guān)的miRNAs 被分為兩類：抑癌miRNAs和促癌miRNAs[9]。抑癌miRNAs表達(dá)量減少，其所調(diào)控的下游靶基因表達(dá)量增加，下游基因一般為致癌基因。相反，促癌miRNAs 一般表達(dá)量增多，其調(diào)控的下游靶基因表達(dá)量減少，一般為抑癌基因。盡管如此，有關(guān)人類miRNAs 異常表達(dá)導(dǎo)致惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的研究才剛剛開始，這是因為一個miRNA 可以同時調(diào)控多個靶基因，一個靶基因也可以被多個miRNA 調(diào)控，miRNA與靶基因之間形成了復(fù)雜的關(guān)系。

研究[10-11]表明，在卵巢癌患者中，參與不同卵巢癌通路的miRNA表達(dá)是上調(diào)或下調(diào)的。miRNA在不同組織類型的卵巢癌的發(fā)病機(jī)制和發(fā)生過程中都發(fā)揮著重要作用。miR-93屬于miR-106b-25家族成員，miR-93-3p 屬于miR-93的亞型。有研究[12]發(fā)現(xiàn)miR-93 可抑制腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力，并且負(fù)向調(diào)控靶基因表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程。miR-93在非小細(xì)胞肺癌和彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤中表達(dá)上調(diào)，而在胃癌組織中則表達(dá)降低，說明不同腫瘤組織中miR-93的作用和分布均存在較大差異[13]。XIANG 等[14]研究了在人結(jié)腸癌干細(xì)胞中不同miRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示，miR-93會抑制SW1116 干細(xì)胞增值，屬于抑癌基因。在SRIVASTAVA 等[15]研究中，從卵巢癌細(xì)胞分離出的miR-93表達(dá)水平下降，且與鉑類化療耐藥相關(guān)。有研究[16]表明，miR-93-3p 通過靶向促進(jìn)FZD7的表達(dá)，激活Wnt/β-catenin 信號通路，促進(jìn)骨肉瘤的進(jìn)展。迄今為止，miR-93-3p在上皮性卵巢癌化療耐藥中的作用還不清。筆者前期運用miRNA表達(dá)譜基因芯片技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)miR-93-3p在上皮性卵巢癌化療耐藥組織中低表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，miR-93-3p 相對于化療敏感組，在鉑化療耐藥組中的表達(dá)量顯著下調(diào)；在臨床分期中的表達(dá)，隨著期別升高其表達(dá)水平卻呈現(xiàn)明顯下降；組織學(xué)分級中，隨著腫瘤惡性程度增加，miR-93-3p表達(dá)量明顯下降；在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)水平較無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組表達(dá)水平明顯下降。說明miR-93 低表達(dá)可能在卵巢癌化療耐藥過程中可能發(fā)揮抑癌基因的作用。

筆者利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測到miR-93-3p可能的126個靶基因，進(jìn)一步對預(yù)測到的靶基因進(jìn)行GO 分析和KEGG Pathway 分析，GO 分析結(jié)果顯示小的GTPase 介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、正調(diào)控RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)運過程與化療耐藥相關(guān)。KEGG Pathway分析結(jié)果顯示FAK 信號通路可能與上皮性卵巢癌化療耐藥發(fā)生相關(guān)。FAK是一種分子量125 kD的非受體、非膜性的胞質(zhì)酪氨酸蛋白激酶，主要位于黏附細(xì)胞的黏著斑，主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，其在進(jìn)化上高度保守，并在調(diào)節(jié)細(xì)胞生存、黏附、凋亡中發(fā)揮重要作用。在細(xì)胞癌變過程中，F(xiàn)AK 活化，并通過自動磷酸化后激活下游信號通路，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和遷移[17-18]。有研究[19]表明，宮頸癌標(biāo)本中FAK 被激活，而宮頸細(xì)胞、宮頸炎細(xì)胞中FAK 未被激活，激活的FAK與宮頸癌患者臨床預(yù)后不良相關(guān)，特別是FAK 基因可通過抑制腫瘤細(xì)胞凋亡而起到促腫瘤的作用。本研究中筆者通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測到可能的靶基因CDC42 參與FAK 信號通路，因此選擇CDC42 作為接下來的研究方向。CDC42是Rho 家族的一種小GTP 酶，全長191個氨基酸，促進(jìn)細(xì)胞分裂和生長，包括細(xì)胞周期進(jìn)展、轉(zhuǎn)錄、肌動蛋白細(xì)胞骨架組織和膜運輸?shù)萚20]。CDC42 除參與正常的細(xì)胞生理過程外，與腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[21]，CDC42 可以增強(qiáng)細(xì)胞間的黏附，促進(jìn)細(xì)胞骨架構(gòu)建和腫瘤血管壁生成，阻斷正常凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑從而抑制凋亡。在消化系統(tǒng)腫瘤、頭頸部腫瘤、黑色素瘤等惡性腫瘤中表達(dá)增高[22]。在體內(nèi)成像觀察和侵入性研究表明偽足在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中起主要作用[23]。有研究[24]表明，miR-924在肝癌細(xì)胞株中表達(dá)下調(diào)，當(dāng)miR-924在肝癌細(xì)胞中過表達(dá)后，可靶向調(diào)控CDC42 抑制細(xì)胞的增殖和遷移。LIU 等[25]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過化療后殘存的乳腺癌衰老細(xì)胞可表現(xiàn)出對內(nèi)分泌藥物的耐藥性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌衰老細(xì)胞中CDC42 高表達(dá)，CDC42在乳腺癌衰老細(xì)胞中通過激活ERK 信號通路增加對內(nèi)分泌藥物的耐藥性。本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)CDC42在上皮性卵巢癌鉑類化療耐藥組中顯著高表達(dá)，且高表達(dá)量的CDC42與上皮性卵巢癌臨床分期、組織學(xué)分級、淋巴轉(zhuǎn)移有顯著相關(guān)性。miR-93-3p和CDC42的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。表明高表達(dá)的CDC42與上皮性卵巢癌惡性程度及遷移有關(guān)。

綜上所述，miR-93-3p 低水平表達(dá)可能與上皮性卵巢癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，并在上皮性卵巢癌化療耐藥中產(chǎn)生作用。miR-93-3p 可能通過調(diào)節(jié)靶基因CDC42 參與上皮性卵巢癌鉑類化療耐藥過程。