李慶超

病毒是導(dǎo)致人類疾病的一類重要病原體。早在還不知道什么是病毒的時(shí)候，人類就已經(jīng)想方設(shè)法對(duì)付病毒了。

中國(guó)人明朝就開(kāi)始使用人痘預(yù)防天花，1798年，英國(guó)醫(yī)生詹納發(fā)明了使用牛痘作為疫苗預(yù)防天花的方法；1885年，法國(guó)科學(xué)家巴斯德發(fā)明了狂犬病疫苗；1892年人類發(fā)現(xiàn)了第一種病毒——煙草花葉病毒，這種病毒比細(xì)菌小，能讓植物生??；1898年發(fā)現(xiàn)了首個(gè)動(dòng)物病毒——感染牛羊的口蹄疫病毒；1901年發(fā)現(xiàn)了首個(gè)人類病毒——通過(guò)蚊子傳播的黃熱病病毒；1911年發(fā)現(xiàn)了可以導(dǎo)致雞腫瘤的勞氏肉瘤病毒（圖1）。

后來(lái)，人們對(duì)病毒的認(rèn)識(shí)越來(lái)越深刻，病毒研究成為一門(mén)單獨(dú)的學(xué)科：病毒學(xué)（圖2）和一般人想象的不同，病毒學(xué)研究除了回答基礎(chǔ)的科學(xué)問(wèn)題、預(yù)防和治療病毒病之外，還涉及開(kāi)發(fā)和利用病毒。而這三種功能都離不開(kāi)最重要的病毒研究工具：反向遺傳操作系統(tǒng)。這一系統(tǒng)，可以說(shuō)是病毒學(xué)家的“毒門(mén)秘籍”了。

一、病毒檢測(cè)

病毒學(xué)研究的第一步是病毒檢測(cè)。

已知病毒的檢測(cè)，主要應(yīng)用于醫(yī)學(xué)診斷和流行病學(xué)調(diào)查，采用的檢測(cè)方法主要有癥狀診斷、免疫學(xué)檢測(cè)、核酸檢測(cè)以及一些凝血實(shí)驗(yàn)等特異性反應(yīng)的檢測(cè)。

對(duì)于未知病毒，則需要通過(guò)分離、培養(yǎng)、鑒定的過(guò)程去發(fā)現(xiàn)，最后可以通過(guò)電子顯微鏡來(lái)直接觀察病毒。但最終要通過(guò)測(cè)序的手段拿到病毒的基因組序列。這是因?yàn)椋《镜幕蚪M序列是其最核心的組分，抓住了病毒的基因組序列，就等于找到了病毒。

今天的科技迅猛發(fā)展，科研人員采用深度測(cè)序技術(shù)（圖3），很容易就能發(fā)現(xiàn)大量新的病毒。對(duì)于疑似感染未知病原體的病人，我們可以在恰當(dāng)?shù)牟课徊蓸樱崛『怂?，?gòu)建文庫(kù)，并進(jìn)行深度測(cè)序。測(cè)序之后，通過(guò)生物信息的方法尋找其中的病原體序列，并給出鑒定結(jié)果。

二、放大招：“毒”門(mén)秘籍

找到病毒之后接下來(lái)怎么開(kāi)展研究呢？接下來(lái)，我們就來(lái)介紹病毒學(xué)家所使用的最重要的研究工具：反向遺傳操作系統(tǒng)。

1.遺傳學(xué)及反向遺傳學(xué)

為了了解反向遺傳學(xué)，需要先了解一下遺傳學(xué)。觀察生物體，我們可以發(fā)現(xiàn)一些結(jié)構(gòu)、功能方面的特征，比方說(shuō)頭發(fā)、皮膚、瞳孔的顏色，這些稱之為表現(xiàn)型，也叫表型。表現(xiàn)型是由生物體的基因組所決定的，而生物個(gè)體的全部基因組合就總稱為基因型（圖4）。基因型決定了表型，而表型反映了基因型。

一開(kāi)始，人們并不知道遺傳的本質(zhì)，因此最初是從表型出發(fā)來(lái)研究遺傳學(xué)的相關(guān)問(wèn)題的。孟德?tīng)柺褂猛愣?、摩爾根使用果蠅?lái)研究遺傳學(xué)，他們通過(guò)豌豆的紅花、白花或者說(shuō)果蠅的紅眼、白眼這種表型來(lái)尋找遺傳規(guī)律，并定位表型相關(guān)的基因。因此，經(jīng)典的遺傳學(xué)是從表型出發(fā)來(lái)研究基因型的，這就是正向遺傳學(xué)。

在正向遺傳學(xué)中，需要通過(guò)自然突變或誘變的方式，篩選具有特殊表型的突變體，然后再定位是哪個(gè)基因決定了這個(gè)表型，并且研究該基因的功能。

在反向遺傳學(xué)中，科學(xué)家拿到一個(gè)未知的基因，可以主動(dòng)對(duì)這個(gè)基因進(jìn)行突變或者改變它的表達(dá)量，再去觀察基因突變或基因表達(dá)量的變化引起了什么樣的表型變化，并與野生型（沒(méi)有經(jīng)過(guò)人為改變的正常基因型）的表型進(jìn)行比較，從而推測(cè)基因的功能。因此，反向遺傳學(xué)是通過(guò)改變基因型，觀察表型改變的結(jié)果，來(lái)研究基因的功能（圖5）。

2.反向遺傳學(xué)的必備條件是基因工程技術(shù)

根據(jù)概念，我們不難看出，反向遺傳學(xué)中，需要對(duì)特定的核酸序列進(jìn)行改造，而這種改造的技術(shù)，實(shí)際上是我們認(rèn)識(shí)了DNA這種遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，發(fā)展了多種基因工程工具酶或者基因工程手段之后，才得以實(shí)現(xiàn)的?；蚬こ淌抢蒙锛夹g(shù)對(duì)生物體基因進(jìn)行直接操縱的、改變細(xì)胞的遺傳組成的技術(shù)。因此反向遺傳學(xué)的思路，要比經(jīng)典遺傳學(xué)的思路出現(xiàn)得晚。

DNA是細(xì)胞生物的遺傳物質(zhì)，它比RNA要穩(wěn)定，而且大多數(shù)基因工程的工具酶作用對(duì)象是DNA，因此遺傳物質(zhì)的改造主要是在DNA上進(jìn)行的。我們進(jìn)行遺傳物質(zhì)改造，主要是在質(zhì)粒（圖6）上完成的，因?yàn)橘|(zhì)粒是一種基因組外的、可以獨(dú)立復(fù)制的游離DNA，其擴(kuò)增比較方便，可以在細(xì)菌或酵母中進(jìn)行。

3.感染性克隆

病毒的基因組通常比較小，因此我們可以把病毒基因組的雙鏈接DNA副本組裝在質(zhì)粒中。把這些帶有病毒序列的質(zhì)粒DNA，或者由質(zhì)粒指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA送進(jìn)細(xì)胞——這個(gè)過(guò)程叫做“轉(zhuǎn)染”——可以指導(dǎo)細(xì)胞工廠產(chǎn)生病毒蛋白，復(fù)制新的病毒基因組，并組裝釋放，產(chǎn)生感染性病毒顆粒。

病毒的基因組可以是DNA，也可以是RNA。DNA病毒的基因組可以擴(kuò)增、切割之后直接連入質(zhì)粒；而RNA病毒的基因組，則需要通過(guò)RNA指導(dǎo)合成DNA的逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程，轉(zhuǎn)化成DNA之后，再連入質(zhì)粒。這些攜帶有病毒基因組序列、可以產(chǎn)生感染性病毒顆粒的質(zhì)粒，就稱作“感染性克隆”。將構(gòu)建好的感染性克隆轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，或轉(zhuǎn)錄成RNA之后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，就可以產(chǎn)生新的病毒（圖7）。

4.反向遺傳操作系統(tǒng)

前面講到，反向遺傳研究的思路就是改變基因序列，從基因型出發(fā)研究表型，進(jìn)而研究基因功能。對(duì)病毒也是一樣：構(gòu)建感染性克隆，對(duì)其進(jìn)行基因工程改造，將改造后的感染性克隆轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，就能產(chǎn)生帶有突變的病毒，然后用這些新的病毒去感染細(xì)胞或宿主，觀察病毒的復(fù)制、宿主的癥狀等表型，就可以研究病毒相關(guān)基因的功能（圖8）。這樣一套系統(tǒng)，我們稱之為病毒的反向遺傳操作系統(tǒng)。

以最近發(fā)布的新冠病毒反向遺傳操作系統(tǒng)為例：它是借助酵母獲得感染性克隆的。首先，新冠病毒基因組RNA通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增獲得DNA片段，或者直接合成病毒的DNA版本，然后在酵母中重組合成感染性克隆質(zhì)粒，提取質(zhì)粒之后，轉(zhuǎn)錄合成RNA，RNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞之后，就可以產(chǎn)生新冠病毒了（圖9）。

不論是用于研究，還是用于疫苗或者治療，要制作病毒，我們都需要在質(zhì)粒上進(jìn)行改造，改造的過(guò)程中，就會(huì)借助一些酶切位點(diǎn)、篩選標(biāo)記、以及必要的質(zhì)粒片段等基因工程工具。

同時(shí)，我們的病毒序列是從天然的病毒中獲取的，設(shè)計(jì)和制造感染性克隆過(guò)程中，勢(shì)必會(huì)沿用現(xiàn)有的理論模型以及設(shè)計(jì)思路，即便是從頭開(kāi)始人工合成一個(gè)新的病毒，也會(huì)在密碼子使用頻率等等方面，留下人工痕跡。因此，一個(gè)病毒是否是人工合成的，是很容易鑒定出來(lái)的。

三、病毒學(xué)研究的應(yīng)用

病毒的反向遺傳操作系統(tǒng)，是病毒學(xué)以及相關(guān)生命科學(xué)領(lǐng)域中非常重要的工具，它可以用于基礎(chǔ)研究，研究病毒中各個(gè)基因的功能，也可以用于疫苗開(kāi)發(fā)，還可以將病毒作為載體，裝載上不同的基因序列，用于其他生命科學(xué)研究。此外，隨著生命科學(xué)的發(fā)展，病毒載體用于細(xì)胞治療、基因治療以及癌癥治療的前景也越來(lái)越光明。

1. 基礎(chǔ)研究應(yīng)用

病毒學(xué)的思路及工具在生物學(xué)基礎(chǔ)研究中應(yīng)用廣泛。目前病毒載體廣泛應(yīng)用于基因的過(guò)表達(dá)、敲除、敲低、動(dòng)物模型改造等各個(gè)方面。以病毒學(xué)研究中的假病毒應(yīng)用為例（圖10）：我們可以使用反向遺傳操作系統(tǒng)的基本方法制作假病毒顆粒，令假病毒顆粒包膜上含有所研究病毒的包膜蛋白，可以用來(lái)模擬病毒顆粒的抗原性、被中和及感染早期過(guò)程。

但是，顆粒內(nèi)部?jī)H含有缺陷病毒基因組或沒(méi)有基因組，因此假病毒不能完成病毒的復(fù)制周期，也就不會(huì)讓宿主發(fā)病。由于安全性比較好，借助假病毒顆粒，我們就可以在生物安全級(jí)別相對(duì)較低的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)研究一些危險(xiǎn)的病毒。

2.疫苗研發(fā)和生產(chǎn)

我們每個(gè)人都打過(guò)疫苗，大家可以摸一摸自己胳膊上的疤痕，那是注射卡介苗留下來(lái)的。疫苗通過(guò)刺激機(jī)體產(chǎn)生獲得性免疫保護(hù)，從而預(yù)防疾病。根據(jù)疫苗的組分，可以分為滅活疫苗、弱毒活疫苗、類毒素、亞單位疫苗、重組蛋白或多肽疫苗，以及病毒載體疫苗、DNA或RNA疫苗等。

疫苗需要同時(shí)滿足兩個(gè)條件：既能刺激機(jī)體產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)，又要不導(dǎo)致疾病。接種疫苗過(guò)程，類似一場(chǎng)免疫系統(tǒng)的軍事訓(xùn)練：在不損傷機(jī)體的前提下訓(xùn)練免疫系統(tǒng)。而所謂的免疫力，實(shí)際上就是機(jī)體在下次遇到病原時(shí)能迅速消滅病原體，讓人（或動(dòng)物）不發(fā)病的能力。

我們看一個(gè)反向遺傳操作系統(tǒng)制作疫苗的例子（圖11）。我們知道，流感會(huì)發(fā)生頻繁的突變，每年流行的病毒毒株可能都不相同，換了“馬甲”之后免疫系統(tǒng)就不認(rèn)識(shí)它了。因此我們必須根據(jù)當(dāng)年所流行的病毒株，來(lái)生產(chǎn)新的流感疫苗。

這時(shí)就要用到反向遺傳操作系統(tǒng)：① 我們從臨床中檢測(cè)到流行強(qiáng)毒株，獲得它的抗原編碼序列，② 然后通過(guò)基因工程的方式，將抗原部分的編碼序列重組到疫苗弱毒株的感染性克隆中；③ 然后我們將這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)部，就能夠產(chǎn)生帶有強(qiáng)毒株抗原、并且不具有致病性的、弱的新疫苗毒株，就可以用于預(yù)防當(dāng)年所流行的流感。

預(yù)防病毒病最有效的方式是研發(fā)疫苗。為了防控新冠疫情，全球科研人員都在努力研發(fā)新型冠狀病毒的疫苗，我國(guó)陳薇院士團(tuán)隊(duì)研發(fā)的重組新型冠狀病毒疫苗（腺病毒載體）（“Ad5-nCoV”）已經(jīng)進(jìn)入 II期臨床試驗(yàn)。

根據(jù)名字就可以知道，這個(gè)疫苗所使用的病毒載體是腺病毒，腺病毒是一種沒(méi)有包膜的DNA病毒，我們將腺病毒中能夠?qū)е录膊〉幕蛞约耙恍o(wú)關(guān)的基因刪除掉，然后重組引入新型冠狀病毒的抗原蛋白表達(dá)基因，就制作完成了以腺病毒載體為基礎(chǔ)的冠狀病毒疫苗。

腺病毒載體的特點(diǎn)是高效率、高滴度（滴度是指病毒的濃度）、低致病性，并且不會(huì)整合進(jìn)入宿主細(xì)胞染色體，是一種常用的病毒載體。目前國(guó)內(nèi)外的研究者還使用了滅活疫苗、亞單位疫苗、假病毒顆粒、痘病毒載體疫苗及納米顆粒疫苗等策略研發(fā)疫苗（圖12）。其中，納米顆粒疫苗是由病毒抗原及自組裝蛋白組分組成的納米顆粒。

3.病毒也能治病

病毒或病毒載體，還可以應(yīng)用于噬菌體治療、細(xì)胞治療、基因治療以及癌癥治療和預(yù)防。

由于各種抗生素的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用，細(xì)菌對(duì)人類健康的危害大大降低了，但是，抗生素濫用帶來(lái)了細(xì)菌耐藥性的問(wèn)題，其中有些細(xì)菌具有多重抗生素抗性，我們稱之為超級(jí)細(xì)菌，超級(jí)細(xì)菌感染是非常危險(xiǎn)的、且在醫(yī)學(xué)上是非常棘手的問(wèn)題，而噬菌體是可以感染細(xì)菌的病毒，因此使用噬菌體來(lái)治療耐藥菌感染成為細(xì)菌感染治療的思路之一。

2015年，加州大學(xué)的一對(duì)科學(xué)家夫婦在埃及旅游途中，丈夫Tom Patterson感染了超級(jí)細(xì)菌，生命垂危，后來(lái)使用噬菌體治療才得以康復(fù)（圖13）。

癌癥是一類嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，而某些病毒可以導(dǎo)致腫瘤的消溶，我們稱之為溶瘤病毒。溶瘤病毒包含腺病毒、痘病毒、甲病毒、新城疫病毒、單純皰疹病毒-1、麻疹病毒等（圖14）。

這些病毒經(jīng)過(guò)改造之后，可以用于癌癥治療：一方面不導(dǎo)致疾病，另一方面可以殺死腫瘤細(xì)胞。溶瘤病毒治療腫瘤的機(jī)制有多種，比如破壞腫瘤血管，切斷腫瘤營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，直接殺死腫瘤細(xì)胞，或者誘導(dǎo)針對(duì)腫瘤的細(xì)胞免疫反應(yīng)等等。

人體內(nèi)的免疫系統(tǒng)就像一支軍隊(duì)，可以抵御外來(lái)病原體的入侵，同時(shí)也可以識(shí)別并消滅異常的“叛變”細(xì)胞，而有些細(xì)胞可以躲過(guò)這種監(jiān)視，不被免疫系統(tǒng)所識(shí)別和清除，肆意生長(zhǎng)，這就是癌細(xì)胞。

細(xì)胞治療的方法可以借助慢病毒載體，給免疫系統(tǒng)的士兵——T細(xì)胞——安裝上能夠識(shí)別癌細(xì)胞的受體CAR，幫助免疫系統(tǒng)識(shí)別并消滅腫瘤（圖15）。慢病毒載體是改造HIV病毒而來(lái)的，它的感染效率高，可以將外源基因穩(wěn)定地插入到細(xì)胞基因組中，在細(xì)胞治療中應(yīng)用廣泛。

隨著基因編輯技術(shù)的迅猛發(fā)展，基因治療的前景越來(lái)越被看好。基因治療是通過(guò)改造基因來(lái)治療或預(yù)防疾病的，它采用的方法主要有替換突變基因，敲除有害基因，或者引入新基因?；蛑委熖貏e適合治療遺傳病，也可以用于治療病毒病或癌癥。

“蝴蝶男孩”的康復(fù)是基因治療的一個(gè)經(jīng)典例子。2017年，一位患有交界型大皰性表皮松解癥的男孩Hassan因全身皮膚嚴(yán)重破損而入院，他的皮膚異常脆弱，一碰就破，面臨生命危險(xiǎn)。這一種嚴(yán)重的遺傳病，是由皮膚的層黏連蛋白基因異常所導(dǎo)致的，人們形象地將這位患病的孩子稱為“蝴蝶男孩”。

科學(xué)家把正常的黏連蛋白基因裝載到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中，然后用病毒感染體外培養(yǎng)的皮膚細(xì)胞，這些皮膚細(xì)胞被病毒載體引入了正常的基因，從而能夠表達(dá)正常的蛋白。在體外培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因皮膚后，把皮膚移植到小孩身體上，逐步取代原來(lái)的皮膚，達(dá)到治療的目的（圖16）。

脊髓性肌萎縮是一種致死性的遺傳病，患兒的腦干和脊髓中的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元逐步被破壞，慢慢失去說(shuō)話、走路的能力，到最后，甚至無(wú)法呼吸和吞咽，最終被奪去性命。研究發(fā)現(xiàn)這種疾病是SMN1基因異常造成的，美國(guó)諾華公司開(kāi)發(fā)的腺病毒相關(guān)病毒載體，可以將正常的SMN1基因裝到病患的基因組上，從而治療這種疾病。

這種病毒載體藥物只需要注射一次，而一次的費(fèi)用高達(dá)200萬(wàn)美元（圖17）。這里所使用的AAV病毒是復(fù)制依賴于腺病毒的缺陷病毒，本身不導(dǎo)致疾病，能夠感染分裂和不分裂的細(xì)胞（神經(jīng)細(xì)胞通常不分裂），可以定點(diǎn)整合到人19號(hào)染色體上，是一種常用的病毒載體。

病毒是導(dǎo)致人類疾病的重要病原體，從古到今，各種病毒都是人類的夢(mèng)魘，即便是當(dāng)今社會(huì)，面臨新冠疫情，人類健康、經(jīng)濟(jì)、社會(huì)各方面依然受到極大的沖擊。隨著人與自然的邊界愈加模糊，氣候環(huán)境劇烈變遷，人或動(dòng)物的國(guó)際交流運(yùn)輸頻繁，新發(fā)病毒病永遠(yuǎn)是、而且越來(lái)越是一種極其可能發(fā)生、且已經(jīng)或正在發(fā)生的、對(duì)人類社會(huì)的嚴(yán)重威脅。

結(jié)語(yǔ)：

病毒學(xué)研究讓我們?cè)谛掳l(fā)病毒病預(yù)警、處置和防疫方面有了長(zhǎng)足的進(jìn)步，我們發(fā)現(xiàn)新病毒的速度越來(lái)越快，做出有效防疫措施和決策越來(lái)越快，藥物和疫苗研發(fā)也越來(lái)越快。相較歷史上的歷次瘟疫，人類社會(huì)應(yīng)對(duì)傳染病的能力已經(jīng)今非昔比。同時(shí)，病毒學(xué)研究也為生命科學(xué)基礎(chǔ)研究、醫(yī)學(xué)研究帶來(lái)了很多令人矚目的成果。

我們常說(shuō)，21世紀(jì)是生命科學(xué)的世紀(jì)，很多專家也把基因編輯為代表的生命科學(xué)技術(shù)作為第四次工業(yè)革命的主要組成部分，而這一切離不開(kāi)病毒學(xué)工具。因此，病毒學(xué)研究不論從生命科學(xué)發(fā)展還是人類健康事業(yè)來(lái)說(shuō)，都是非常重要的。

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