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梯棱羊肚菌分子鑒別研究

2020-06-11 13:22沈千匯李春紅謝美霞李文佳錢(qián)正明
食藥用菌 2020年3期
關(guān)鍵詞:泳道羊肚特異性

沈千匯 李春紅 謝美霞 李文佳 錢(qián)正明,3* 張 霽,*

梯棱羊肚菌分子鑒別研究

沈千匯1李春紅2謝美霞2李文佳2錢(qián)正明2,3*張 霽1,2*

(1. 華南師范大學(xué)腦科學(xué)與康復(fù)醫(yī)學(xué)研究院,廣東 廣州 510631;2. 廣東東陽(yáng)光藥業(yè)有限公司國(guó)家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)研究室,廣東 東莞 523850;3. 湘南學(xué)院,湖南 郴州 423000)

針對(duì)羊肚菌品種,特別是產(chǎn)業(yè)化培植品種,建立快速準(zhǔn)確的品種鑒定方法。通過(guò)對(duì)來(lái)源確切的梯棱羊肚菌樣品及同屬5種其他羊肚菌進(jìn)行ITS測(cè)序,并結(jié)合網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)中的梯棱羊肚菌ITS序列進(jìn)行分析,獲得梯棱羊肚菌的特異性鑒別引物。進(jìn)一步對(duì)分子鑒別實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行考察,以確定最終實(shí)驗(yàn)條件。通過(guò)對(duì)梯棱羊肚菌及羊肚菌近緣品種的分析,發(fā)現(xiàn)只有梯棱羊肚菌呈現(xiàn)特征電泳條帶。表明該研究設(shè)計(jì)的特異性引物和優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)方法,可用于梯棱羊肚菌菌種的快速鑒定及產(chǎn)品的真?zhèn)舞b別。

梯棱羊肚菌;分子鑒別;特異性引物;PCR反應(yīng)

羊肚菌又稱羊肚蘑、草笠竹等,因其菌蓋多褶皺,子實(shí)體似羊肚狀凹陷而得名[1,2]。羊肚菌為我國(guó)傳統(tǒng)中藥材和珍稀食材,具有很高的藥用及食用價(jià)值[3, 4]。一方面由于價(jià)格高昂,市場(chǎng)上存在偽品銷售的現(xiàn)象,如皺蓋鐘菌和鹿花菌[5, 6]。偽品若加工處理不當(dāng),食用后會(huì)出現(xiàn)中毒現(xiàn)象[6, 7],另一方面,羊肚菌人工栽培近年來(lái)得到快速發(fā)展,但其菌種存在品種銷售混亂等問(wèn)題。因此,建立快速準(zhǔn)確的羊肚菌品種鑒定方法,特別是針對(duì)羊肚菌產(chǎn)業(yè)化培植品種的真?zhèn)舞b別,對(duì)保障產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。

分子鑒別技術(shù)具有準(zhǔn)確率高、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn),已被廣泛應(yīng)用于冬蟲(chóng)夏草、光慈菇等食藥用真菌的真?zhèn)舞b別[8-10]。有文獻(xiàn)報(bào)道采用ITS序列分析方法可鑒定梯棱羊肚菌真?zhèn)?,但需要的樣本量大,測(cè)序成本高,分析耗時(shí)長(zhǎng),如果樣品DNA有斷裂或降解則有可能無(wú)法進(jìn)行鑒別[11, 12]。特異性引物分子鑒別是一種專屬性強(qiáng)、鑒定速度快的分析方法。本課題組前期采用該技術(shù)建立了產(chǎn)業(yè)化品種六妹羊肚菌的快速真?zhèn)舞b別方法[13]。而另一個(gè)大品種梯棱羊肚菌的快速真?zhèn)舞b別研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)對(duì)梯棱羊肚菌進(jìn)行特異性引物分子鑒別研究,可為該品種的質(zhì)量評(píng)價(jià)技術(shù)提升提供支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗(yàn)收集了18批羊肚菌樣品,其中S1~S11均為梯棱羊肚菌,S12~S18為其他品種羊肚菌。相關(guān)信息如下:S1采自廣東東莞、S2~S4采自廣東韶關(guān)、S5采自貴州遵義、S6采自四川崇州、S7采自四川南充、S8采自云南麗江、S9采自四川成都、S10采自四川綿陽(yáng)、S11采自四川廣元;S12、S13為六妹羊肚菌,分別采自四川南充和成都;S14、S15為粗柄羊肚菌,來(lái)自北京;S16為七妹羊肚菌,來(lái)自北京;S17為高羊肚菌,來(lái)自北京;S18為小海綿羊肚菌,來(lái)自北京。

10條網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)中的梯棱羊肚菌ITS系列信息如下:MN462953.1和MN462954.1來(lái)自伊比利亞半島,MK447933.1來(lái)自卡拉布里亞(意大利),MH423881.1和MH468775.1來(lái)自秦嶺地區(qū),MK432691.1來(lái)自新西蘭,KU865008.1來(lái)自塞浦路斯,MK253759.1來(lái)自湖南,MH198762.1來(lái)自北美西部,MF170632.1來(lái)自以色列。

1.2 試劑與儀器

試劑包括:高效植物基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司);PrimeSTAR?Max DNA Polymerase(含HS DNA聚合酶),DL500 DNA Marker,10×Loading Buffer(寶日醫(yī)生物技術(shù)北京有限公司);瓊脂糖,GelRed Nucleic Acid Gelstain(北京全式金生物技術(shù)有限公司)。

儀器包括:Vortex Genie 2渦旋振蕩器(Scientific Industries, Inc.),XS-205DR電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司),MM400混合球磨儀(德國(guó)萊馳公司),HWS-24電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學(xué)儀器有限公司),5425離心機(jī)(艾本德中國(guó)有限公司),ProFlex 3*32 well PCR儀(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)(ABI)公司),ND-2000核酸蛋白儀(美國(guó)賽默飛世爾科技公司),XGLDTED脈動(dòng)真空滅菌器(山東新華醫(yī)療器械股份有限公司),Aqbd Cubee迷你離心機(jī)(瑞基海洋生物科技股份有限公司),Tanon 3500凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司),PJ210C-BF微波爐(美的集團(tuán))。

1.3 方法

(1)樣品DNA提取。提取羊肚菌樣品(S1~S18)DNA,取適量樣品采用混合型球磨儀粉碎。取樣品粉末約30 mg至離心管中,使用高效植物基因組DNA試劑盒提取總DNA,并使用核酸蛋白儀測(cè)定DNA濃度,將所有樣品DNA濃度分別稀釋至50 ng/μL,分裝放置在-20 ℃下備用。

(2)通用引物PCR擴(kuò)增。采用真菌通用引物(ITS5F/ITS4R)對(duì)所提取的樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序,得到樣品ITS序列。引物信息為ITS5F:5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3',ITS4R:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3。PCR擴(kuò)增體系總體積25 μL,包含2 × PrimeSTAR Max premix 12.5 μL,ITS5F/ITS4R(10 μmol/L)各1 μL,DNA模板1 μL,雙蒸水補(bǔ)足至25 μL,并設(shè)置陰性對(duì)照組(等體積雙蒸水代替DNA模板)。PCR反應(yīng)參數(shù)為:94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性45 s,62 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán);72 ℃最后延伸10 min。將PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后,采用自動(dòng)熒光凝膠成像儀檢測(cè)目標(biāo)條帶,之后將PCR產(chǎn)物送至廣州艾基生物有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序并拼接。

(3)序列分析和引物設(shè)計(jì)。以11批梯棱羊肚菌的ITS序列和10條該品種網(wǎng)絡(luò)序列為基礎(chǔ),設(shè)計(jì)梯棱羊肚菌的特異性引物。所使用的梯棱羊肚菌ITS序列均采用GenBank和MLST數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證其準(zhǔn)確性[12]。應(yīng)用DNAMAN軟件對(duì)11批梯棱羊肚菌的序列和Genbank中下載的10條可靠的梯棱羊肚菌ITS序列進(jìn)行分析、校對(duì),找出穩(wěn)定差異的變異位點(diǎn),并使用Primer Premier 5.0軟件對(duì)梯棱羊肚菌的特異位點(diǎn)設(shè)計(jì)了3對(duì)特異性鑒別引物對(duì),命名為T(mén)L-1s / TL-1a(TL-1s:GTTTGAT TCTGACGTCGGC / TL-1a:CACCAGGGCTAGTA GCTTTAC,166 bp)、TL-2s / TL-2a(TL-2s:ATGA CGCTCGAACAGGCATG / TL-2a:GCCGACGTC AGA ATCATAAC,191 bp)、TL-3s / TL-3a(TL-3s:ATGACGCTCGAACAGGCATG / TL-3a:CACCAG GGCTAGTAGCTTTAC,337 bp),引物由廣州艾基生物有限公司合成。

(4)引物篩選及特異性引物PCR條件優(yōu)化。對(duì)所設(shè)計(jì)的引物對(duì)進(jìn)行篩選和擴(kuò)增反應(yīng)條件的優(yōu)化。以梯棱羊肚菌(S5)DNA為模板,用所設(shè)計(jì)的3對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增,PCR反應(yīng)采用25 μL反應(yīng)體系:含2 × PrimeSTAR Max premix 12.5 μL,上下游引物各1 μL(濃度為10 μmol/L),雙蒸水 9.5 μL,DNA模板1 μL。PCR參數(shù)為:94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性45 s,58 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán);72 ℃最后延伸10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

特異性引物PCR條件優(yōu)化。對(duì)特異性引物TL-1s / TL-1a的PCR條件進(jìn)行以下參數(shù)優(yōu)化:①退火溫度設(shè)62 ℃、64 ℃、66 ℃、68 ℃;②退火時(shí)間設(shè)10 s、15 s;③延伸時(shí)間設(shè)10 s、15 s;④反應(yīng)輪數(shù)設(shè)30輪、35輪。

(5)方法學(xué)考察。分子鑒別研究通常會(huì)進(jìn)行專屬性、靈敏度、耐用性的方法學(xué)考察[9, 14]。①專屬性考察:對(duì)所有樣品的DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,驗(yàn)證所設(shè)計(jì)特異性引物的專屬性,PCR反應(yīng)參數(shù)為“1.3(4)”節(jié)優(yōu)化后的條件,擴(kuò)增產(chǎn)物使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。②靈敏度考察:將梯棱羊肚菌(S5)DNA溶液(50 ng/μL)連續(xù)稀釋至不同濃度(30 ng/μL、10 ng/μL、1 ng/μL、0.1 ng/μL、0.01 ng/μL),PCR反應(yīng)參數(shù)為“1.3(4)”節(jié)優(yōu)化后的條件,擴(kuò)增產(chǎn)物使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。③耐用性考察:PCR擴(kuò)增體系中使用不同體積的引物(0.75 μL,1.0 μL,1.25 μL,1.5 μL),PCR反應(yīng)參數(shù)為“1.3(4)”節(jié)優(yōu)化后的條件,擴(kuò)增產(chǎn)物使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選及PCR反應(yīng)條件優(yōu)化

將3對(duì)特異性引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠檢測(cè),結(jié)果表明,引物對(duì)TL-1s / TL-1a在166 bp左右能成功擴(kuò)增出單一的目標(biāo)條帶,另外2對(duì)引物顯示出假陽(yáng)性擴(kuò)增結(jié)果和多條非特異性條帶,因此選擇引物對(duì)TL-1s / TL-1a作為梯棱羊肚菌的鑒別引物,并進(jìn)一步進(jìn)行PCR反應(yīng)參數(shù)優(yōu)化。

利用引物TL-1s / TL-1a進(jìn)行反復(fù)試驗(yàn),最終確定其在退火溫度為68 ℃,退火時(shí)間為15 s,延伸時(shí)間為10 s,反應(yīng)輪數(shù)為35個(gè)循環(huán)(表1)條件下,不僅能保證擴(kuò)增穩(wěn)定進(jìn)行,而且擴(kuò)增效率最好。

表1 特異性引物TL-1s/TL-1a的PCR反應(yīng)條件

2.2 方法學(xué)考察

(1)引物專屬性考察。利用優(yōu)化后的反應(yīng)參數(shù),對(duì)11批次的梯棱羊肚菌和7批其他近緣種羊肚菌樣品進(jìn)行分析,結(jié)果顯示所有的梯棱羊肚菌樣品在約166 bp位置均出現(xiàn)唯一目標(biāo)條帶,而陰性對(duì)照和其他樣品在相應(yīng)位置均無(wú)條帶出現(xiàn)(圖1),表明該方法專屬性良好,能準(zhǔn)確地鑒別梯棱羊肚菌與羊肚菌近緣種。

(2)引物靈敏度考察。通過(guò)將濃度為50 ng/μL梯棱羊肚菌DNA溶液(樣品S5)稀釋至不同濃度進(jìn)行擴(kuò)增,當(dāng)濃度為30 ng/μL和10 ng/μL時(shí),目的條帶沒(méi)有明顯的差異;當(dāng)DNA濃度低至約0.1 ng/μL時(shí),PCR產(chǎn)物顯示出淺淡的單一目的條帶(圖2),表明該方法靈敏度高。

(3)引物耐用性考察。通過(guò)使用不同引物量(0.75 μL、1 μL、1.25 μL、1.5 μL)進(jìn)行擴(kuò)增,結(jié)果顯示樣品在約166 bp位置均出現(xiàn)唯一特征性條帶,表明本方法耐用性良好(圖3)。

3 結(jié)論與討論

目前羊肚菌培植種源復(fù)雜、菌種市場(chǎng)品種摻假混雜等問(wèn)題嚴(yán)重制約了產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)步發(fā)展,故羊肚菌品種的鑒定研究對(duì)于羊肚菌的產(chǎn)業(yè)化栽培和市場(chǎng)產(chǎn)品的質(zhì)量控制具有重要的意義[15, 16]。近年來(lái),DNA條形碼因能快速準(zhǔn)確鑒定物種的優(yōu)勢(shì)逐漸成為鑒定動(dòng)植物和真菌的熱點(diǎn)技術(shù)。其中,ITS序列已被提出可作為真菌遺傳鑒定的條形碼[17, 18]。現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道了采用ITS序列分析法鑒定梯棱羊肚菌,但用該方法成本高、耗時(shí)長(zhǎng),而且若樣品中DNA發(fā)生降解,ITS序列的通用引物擴(kuò)增可能不成功,導(dǎo)致無(wú)法進(jìn)行分析[9, 19]。

圖A:11批梯棱羊肚菌擴(kuò)增電泳圖。M:DL 500 Marker;泳道1~11分別為樣品S1~S11;泳道12:陰性對(duì)照。

M:DL 500 Marker;泳道1,2:DNA濃度為50 ng/μL;泳道3,4:DNA濃度為30 ng/μL;泳道5,6:DNA濃度為10 ng/μL;泳道7,8:DNA濃度為1 ng/μL;泳道9,10:DNA濃度為0.1 ng/μL;泳道11,12:DNA濃度為0.01 ng/μL;泳道13:陰性對(duì)照。

特異性引物是根據(jù)物種間序列差異設(shè)計(jì)的一段特有DNA序列,在適宜條件下通過(guò)特異性擴(kuò)增,便可完成對(duì)指定物種的特異性檢驗(yàn),具有快速、簡(jiǎn)便和特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)[13, 14]。本研究基于DNA條形碼技術(shù),以梯棱羊肚菌為研究對(duì)象,比較序列的差異,在ITS區(qū)域內(nèi)設(shè)計(jì)了該品種的特異性引物(約166 bp),并確定其最佳PCR反應(yīng)條件為:98 ℃預(yù)變性1 min;98 ℃ 15 s,68 ℃ 15 s,72 ℃ 10 s進(jìn)行35個(gè)循環(huán);72 ℃最后延伸5 min。該P(yáng)CR方法耗時(shí)約30 min,檢測(cè)效率高;對(duì)不同品種羊肚菌、不同DNA模板濃度、不同引物量的測(cè)試結(jié)果顯示,其具有良好的專屬性、靈敏度和耐用性。

M: DL 500 Marker;泳道1,2:引物量為0.75 μL;泳道3,4:引物量為1.0 μL;泳道5,6:引物量為1.25 μL;泳道7,8:引物量為1.5 μL。

本試驗(yàn)采用電子PCR驗(yàn)證所設(shè)計(jì)引物的應(yīng)用廣泛性,在使用NCBI的Primer-Blast過(guò)程中發(fā)現(xiàn),有非梯棱羊肚菌也可能被擴(kuò)增出來(lái),如六妹羊肚菌(MH468776.1)。進(jìn)一步通過(guò)MLST數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)六妹羊肚菌(MH468776.1)序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn),該序列實(shí)際為梯棱羊肚菌。此種情況是由于NCBI中部分序列被錯(cuò)誤記錄導(dǎo)致的,前期已有文獻(xiàn)報(bào)道類似情況[4, 12]。

本試驗(yàn)選取GenBank中粗柄羊肚菌(KR809597.1)六妹羊肚菌(KX809733.1)、高羊肚菌(MK890308.1)、七妹羊肚菌(MG589680.1)、黑脈羊肚菌Morchella angusticeps(KM587987.1)的ITS序列,并經(jīng)GenBank和MLST數(shù)據(jù)庫(kù)雙庫(kù)核對(duì)準(zhǔn)確后,采用NCBI Primer-Blast進(jìn)行電子PCR驗(yàn)證,結(jié)果顯示以上5種羊肚菌均未出現(xiàn)特異性片段。說(shuō)明本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的特異性引物可有效地鑒別梯棱羊肚菌和其他5種羊肚菌。

綜上,本研究所建立的分子鑒別方法特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、分析速度快,可快速有效鑒別梯棱羊肚菌,為該品種的科學(xué)研究、質(zhì)量評(píng)價(jià)及菌種市場(chǎng)規(guī)范打下了良好的基礎(chǔ)。

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Molecular identification of

Shen Qianhui1Li Chunhong2Xie Meixia2Li Wenjia2Qian Zhengming2, 3*Zhang Ji1, 2*

(1. Institute for Brain Research and Rehabilitation, South China Normal University, Guangzhou, Guangdong 510631, China; 2. Key Laboratory of State Administration of Traditional Chinese Medicine, Sunshine Lake Pharma Co., LTD, Dongguan, Guangdong 523850, China; 3. Xiangnan University, Chenzhou, Hunan 423000, China)

It is important to establish a rapid and accurate method for the identification of species for the cultivation morels varieties. The ITS (internal transcribed spacer) sequences was obtained from all ofand 5 other species of morels collected from different location in China. Combined with reliable online-sequences for homology alignment, the specific-species primers ofwere designed according to the variation sites. And the optimal experimental conditions were obtained by optimizing conditions such as annealing temperature, annealing time and extension time, etc. The developed PCR method was applied in all samples.showed unique characteristic band, and other species of morels had no band. The results showed that the developed specific primer and PCR approach can be used for rapid identification of.

; molecular identification; species-specific primer; PCR

S646

A

2095-0934(2020)03-172-06

工信部年度中藥材提升與保障領(lǐng)域項(xiàng)目(2017020)

沈千匯(1995—),女,在讀碩士,研究方向?yàn)樘烊慌c生化藥物。E-mail:455230573@qq.com。

錢(qián)正明(1982—),男,博士,高級(jí)工程師,研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量評(píng)價(jià)。E-mail:qianzhengming1982@126.com。張霽(1962—),男,博士,藥物研發(fā)/工藝研發(fā)首席科學(xué)家。E-mail:zhangjipaper@163.com。

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