曹國瓊，洪林，蒲蘭，李冰冰，張永萍

(貴州中醫(yī)藥大學,貴州 貴陽 550025)

闊葉十大功勞Mahoniabealei(Fort.)Carr.為小檗科Berberidaceae十大功勞屬常綠灌木或小喬木，在我國分布廣泛，產于廣西、四川、貴州、湖北、江西、浙江[1-2]。闊葉十大功勞味苦，性寒，具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效，用于目赤腫痛、黃疸尿赤、濕熱瀉痢等[3]。該植物以莖入藥稱為功勞木，以葉入藥稱為功勞葉。以該植物為主要原料開發(fā)的成藥制劑有腸胃適膠囊、痔瘡片、功勞去火片、婦科千金片、婦科千金膠囊等，市場需求量大，應用前景廣闊。闊葉十大功勞含多種生物堿如氧化小檗堿、小檗堿、藥根堿、非洲防己堿、巴馬汀等[4-5]。小檗堿類具有多種藥理作用，如抗炎、抗腫瘤、降血糖等[6-7]。藥理研究表明闊葉十大功勞具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗氧化等藥理作用[8-10]，其根具有明顯的抗病毒作用[11]，而其根部抗炎鎮(zhèn)痛作用及其有效部位仍不明確。

功勞木為常用中藥材，是多種中藥制劑的重要原料，隨著對闊葉十大功勞基礎研究的不斷深入，其用途不斷拓寬。闊葉十大功勞含多種生物堿類成分，生物堿是其質量控制的指標性成分，也是其發(fā)揮藥效的物質基礎。對闊葉十大功勞與同屬植物的研究表明，其具有抗菌、抗炎和抗氧化等藥理作用。但是，目前對闊葉十大功勞藥理作用和藥效物質基礎的研究仍不深入。對闊葉十大功勞不同入藥部位進行系統深入的研究，有利于其資源的開發(fā)和利用。

中藥藥效研究中，常檢測多項指標，如果各指標按單變量進行統計分析，檢驗效果較低，難以得出綜合結果，故需要應用多指標綜合評價的方法[12]。物元分析理論適用于多因子評價模型，是解決不相容問題的有力工具[13]。運用基于變異系數的模糊物元模型評價中藥藥效的各個指標，避免了主觀偏好性，更加準確、客觀。近年來，模糊物元模型評價方法廣泛應用于中藥物質基礎的研究和質量控制[14-16]等領域。采用模糊物元模型評價不同提取部位藥效作用是一種客觀、公正、科學的新評價方法，該方法簡便、可操作性強。如許珊珊等[17]采用模糊物元模型評價當歸不同提取部位的活血作用；任國瑾等[12]建立了當歸不同提取部位潤腸通便綜合評價模糊物元模型；楊蕊菁等[18]采用模糊物元模型評價大黃不同提取部位降血脂的效果。

基于此，本實驗采用基于變異系數權重的模糊物元模型，綜合評價闊葉十大功勞根抗炎鎮(zhèn)痛的有效部位，為進一步具體活性物質的研究提供實驗基礎。

1 材料

1.1 實驗動物

清潔級昆明小鼠280只，重18 ～ 22 g，雌雄各半，由重慶騰鑫生物技術有限公司提供，實驗動物生產許可證號：SCXK(軍)2012-0011。

1.2 藥物與試劑

闊葉十大功勞采自貴州，經貴州中醫(yī)藥大學科研實驗中心肖承鴻老師鑒定為小檗科十大功勞屬植物闊葉十大功勞Mahoniabealei(Fortune.)Carr.，根烘干，粉碎成粗粉，過一號篩備用。乙酰水楊酸片(規(guī)格：2.2 mg/片，遠達醫(yī)藥(中國)有限公司，生產批號：180308)；其他試劑均為分析純(天津市富宇精細化工有限公司)。

1.3 儀器

Mettler AE240型電子分析天平(瑞士梅特勒公司)；恒溫水浴鍋(天津泰斯特儀器有限公司)；JM-A10002型電子天平(諸暨市超澤衡器設備有限公司)；HBM-109 型粉碎機(瑞安市瀚博機電有限公司)；RE52-99型旋轉蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器有限公司)；SHZ-Ⅲ型環(huán)水真空泵(上海亞榮生化儀器有限公司)；SB-4200型超聲儀(寧波新藝超聲設備有限公司)。

2 方法

2.1 闊葉十大功勞根不同提取部位的制備

稱取一定量闊葉十大功勞根過一號篩粗粉，回流提取兩次，每次1 h，分別用10、8倍量的水、乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、石油醚提取，合并濾液，減壓回收蒸干，放入4 ℃冰箱中備用。臨用前以0.5 %吐溫80稀釋成所需濃度。

2.2 動物分組與給藥

每項實驗56只小鼠，按體質量隨機分為7組，每組8只，雌雄各半，分別為模型組、陽性對照組、水提取物組、乙醇提取物組、正丁醇提取物組、乙酸乙酯提取物組、石油醚提取物組。模型組灌胃給予含0.5%吐溫80的蒸餾水，其余各組均灌胃給予相應藥液，陽性對照藥劑量為220 mg/kg，闊葉十大功勞各提取部位劑量均為25 g/kg(以生藥計)，給藥體積為10 mL/kg。

2.3 闊葉十大功勞根不同提取部位抗炎實驗

炎癥反應常用的造模方法有二甲苯致耳腫脹法、角叉菜膠致足腫脹法和小鼠腹腔毛細血管通透性檢測法等。傷害性疼痛是傷害性感受器對酸性物質、熱、劇烈的機械壓力等外界的直接壓力啟動應答反應[19]，目前常用的造模方法有醋酸扭體法、熱板法和熱水縮尾法等。

2.3.1 對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響

小鼠連續(xù)給藥7 d，每日灌胃1次，末次給藥30 min后，用二甲苯50 μL致炎小鼠右耳正反面，左耳為對照，30 min后處死小鼠，用打孔器在沿左右耳片同一部位打下圓耳片，精密稱量，以同一小鼠右耳與左耳質量之差即為腫脹度，并計算小鼠耳廓腫脹抑制率。

2.3.2 對足跖腫脹的影響

連續(xù)給藥6 d，每日灌胃1次，第7 d在小鼠右后足墊皮下注射1.0 %角叉菜膠50 μL致炎，后再給予各組藥物1次，次日處死小鼠，剪取雙后足，精確稱量，以右足的質量減去左足的質量即為足跖炎性腫脹度，計算小鼠足跖腫脹抑制率[20]。

2.4 闊葉十大功勞根不同提取部位鎮(zhèn)痛實驗

2.4.1 對醋酸致小鼠扭體反應的影響

各組小鼠適應性飼養(yǎng)3 d，各組按2.2節(jié)下灌胃給予各受試藥物，每日1次，連續(xù)給藥3 d。末次給藥前禁食12 h，給藥后1 h，各組腹腔注射給藥 0.5%冰醋酸0.2 mL/只，觀察 15 min內各組小鼠扭體反應次數。

2.4.2 對小鼠熱水縮尾反應的影響

小鼠分組與給藥方法同2.2節(jié)，末次給藥前禁食12 h，給藥后1 h，將各組小鼠尾下部垂直浸入(55±0.5)℃熱水中3 cm，計時，以尾回縮出水面的潛伏期為指標。時間以30 s為限，超過以30 s計[19]。

2.4.3 對熱板致痛的影響

將小鼠逐只放于(55±0.5)℃熱板上，記錄小鼠舔后足反應所需時間，挑選痛閾值在5～30 s內的小鼠，雌雄各半，分組及給藥方法同2.2節(jié)，連續(xù)灌胃給藥7 d，于末次給藥1 h后，分別將小鼠置于(55±0.5)℃的熱板上，測定痛閾值[21]。

2.5 統計分析

實驗所得數據用SPSS 19.0統計軟件分析，結果均用x±s表示，組間比較采用 ANOVA(one-way analysis of variance)單因素方差分析，若方差齊性用LSD檢驗，方差不齊用Dunnet’T3檢驗。P<0.05表示有顯著性差異。

3 結果

3.1 闊葉十大功勞根不同提取部位抗炎鎮(zhèn)痛作用

由表1可知，與模型組比較，陽性對照組、水提取物、乙醇提取物、正丁醇提取物、乙酸乙酯提取物和石油醚提取物組均對二甲苯致小鼠耳腫脹具有顯著的抑制作用(P<0.05)。與模型組比較，陽性對照組、水提取物、乙醇提取物、正丁醇提取物、乙酸乙酯提取物組對角叉菜膠致小鼠足腫脹具有顯著的抑制作用(P<0.05)。表明闊葉十大功勞根水提取物、乙醇提取物、正丁醇提取物、乙酸乙酯提取物和石油醚提取物具有一定的抗炎作用。

表1 闊葉十大功勞根不同提取部位抗炎作用Table 1 The anti-inflammatory effects of different extract parts from the roots of Mahonia bealei

注:與模型組小鼠比較，*P<0.05，說明有差異。

由表2可知，與模型組比較，陽性對照、水提取物、乙醇提取物、正丁醇提取物和乙酸乙酯提取物組的冰醋酸引起小鼠扭體次數有顯著的減少(P<0.05)。表明陽性藥乙酰水楊酸、闊葉十大功勞根乙醇提取物和乙酸乙酯提取物對熱引起的疼痛有顯著的抑制作用(P<0.05)。

表2 闊葉十大功勞根不同提取部位鎮(zhèn)痛作用Table 2 The analgesic effects of different extract parts from the roots of Mahonia bealei

注:與模型組小鼠比較，*P<0.05，說明有差異。

3.2 建立評價抗炎鎮(zhèn)痛效果的n維復合模糊物元模型

模糊物元是由所描述的事物M及其特征C和量值X組成R=(M，C，X)，三者稱為物元的三要素，通常把m個事物的n維組合在一起，構成m個事物的n維復合模糊物元Rmn[15,22]。根據參考文獻[15]的方法，在本研究中可以把實驗分組看作事物M，把檢測指標看作特征C，把各指標值看作X，因此組成評價闊葉十大功勞根抗炎鎮(zhèn)痛作用的模糊物元模型。建立評價闊葉十大功根勞抗炎鎮(zhèn)痛的n維復合模糊物元模型R7-5。共有7個樣品(M1，M2，…，M7)，對每個樣品計算了5項指標(C1為耳腫脹度，C2為足腫脹度，C3為扭體次數，C4為縮尾潛伏期，C5為痛閾值)。即：

耳腫脹度、足腫脹度、扭體次數屬于越小越優(yōu)型，痛閾值、縮尾潛伏期屬于越大越優(yōu)型。因此，建立的從優(yōu)隸屬度模糊物元如下：

其構成的標準模糊物元如下：

構成的簡單差絕對值復合模糊物元如下：

用變異系數法來計算有關指標的權重：各評價指標的均值Xi= 8.02，12.66，22.40，26.98，2.38；均方差Di=2.33，2.72，7.99，6.06，0.65； 變異系數δi=0.29，0.21，0.36，0.22，0.27；權重Wi=0.21，0.16，0.27，0.16，0.20。最后，用Wi和R△得到貼進度復合模糊物元如下：

根據計算得出的貼近度從大到小排序：M6，M4，M3，M5，M2，M7，M1，即闊葉十大功勞根不同提取部位抗炎鎮(zhèn)痛作用由大到小順序為乙酸乙酯提取物組(M6，ρHj=0.60)，乙醇提取物組(M4，ρHj=0.54)，水提取物組(M3，ρHj=0.46)，正丁醇提取物組(M5，ρHj=0.39)，陽性對照組(M2，ρHj=0.37)，石油醚提取物組(M7，ρHj=0.32)，模型組(M1，ρHj=0.24)，結果表明乙酸乙酯提取物組抗炎鎮(zhèn)痛作用最好。

4結論

本研究采用兩種炎癥模型和三種疼痛模型研究闊葉十大功勞抗炎鎮(zhèn)痛作用，結果表明闊葉十大功勞根不同提取部位均有一定的抗炎鎮(zhèn)痛作用。通過抗炎鎮(zhèn)痛實驗，結合變異系數權重的模糊物元模型，對闊葉十大功勞根不同提取部位抗炎鎮(zhèn)痛效果進行綜合評價，篩選出不同提取部位的抗炎鎮(zhèn)痛作用強度由大到小為：乙酸乙酯部位，乙醇部位，水部位，正丁醇部位，石油醚部位。通過對闊葉十大功勞根不同提取部位抗炎鎮(zhèn)痛作用的比較，為進一步活性物質的研究提供了實驗基礎。