肖清煒，常媛媛，劉起發(fā)，臧小豪，胡蒙蒙，周 渭

（廣東工業(yè)大學(xué) 生物醫(yī)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006）

前列腺癌(Prostate Cancer, PCa)是男性泌尿生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，占據(jù)男性癌癥整體發(fā)病率第二位[1]。其中，發(fā)達(dá)國(guó)家的男性發(fā)病率要高于發(fā)展中國(guó)家[2]。但近年來，隨著醫(yī)療手段的進(jìn)步與生活環(huán)境的變化，包括中國(guó)在內(nèi)的發(fā)展中國(guó)家中男性前列腺癌的發(fā)病率也呈逐年上升趨勢(shì)[3]。針對(duì)癌癥的治療，早期診斷與精準(zhǔn)治療是提高癌癥患者的生存率與治愈率的良好手段。 因此，研究與開發(fā)出一種前列腺癌的早期診斷治療手段是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。

分子探針技術(shù)的開發(fā)極大地提高了對(duì)疾病的診斷效果[4]。其原理是利用某種疾病的特異性靶點(diǎn)開發(fā)出一種靶向性的分子影像探針從而達(dá)到診斷與治療的目的。因此，前列腺癌的早期診斷也可通過分子探針技術(shù)手段實(shí)現(xiàn)。其中，前列腺特異性膜抗原(Prostate specific membrane antigen, PSMA)作為前列腺癌的特異性靶點(diǎn)越來越受到研究者的關(guān)注[5]。

PSMA是一種表達(dá)在前列腺腫瘤上皮細(xì)胞，含有750個(gè)氨基酸的II型跨膜糖蛋白[6-7]，其與II型谷氨酸羧肽酶(GCPII)具有相同的酶活性。II型谷氨酸羧肽酶是存在于神經(jīng)系統(tǒng)中用于催化水解Nacetylaspartylglutamate(NAAG)釋放谷氨酸的一種膜外金屬蛋白酶。但對(duì)于大腦神經(jīng)系統(tǒng)，過量的谷氨酸會(huì)導(dǎo)致一系列的神經(jīng)性疾病，包括中風(fēng)、脊髓損傷、肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)、周圍神經(jīng)病變、慢性疼痛、精神分裂癥和癲癇[8]。抑制GCPII活性將有利于治療由谷氨酸釋放過多所引發(fā)的神經(jīng)性疾病。因此，近年來，針對(duì)II型谷氨酸羧肽酶的抑制劑得以被研究與開發(fā)。如圖1所示，Cyril Barinka和Youngjoo Byun等[9]基于GCPII所作用的NAAG結(jié)構(gòu)通過理論計(jì)算設(shè)計(jì)合成了含有谷氨酸-脲(Glu-Urea)骨架的GCPII型小分子抑制劑并通過多種評(píng)價(jià)手段對(duì)4種抑制劑的結(jié)合機(jī)理與結(jié)合效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明所設(shè)計(jì)合成的Glu-Urea骨架小分子抑制劑能夠與GCPII特異性結(jié)合。同時(shí)，因?yàn)镻SMA與GCPII具有相同酶活性，因此所開發(fā)的小分子抑制劑也能與PSMA進(jìn)行特異性結(jié)合，這給前列腺癌靶向性分子的開發(fā)提供了一種新的途徑[7,10]。當(dāng)前，已經(jīng)有不少研究利用PSMA的小分子抑制劑進(jìn)行靶向分子探針或藥物的開發(fā)[10-14]。因此，設(shè)計(jì)出一條合適的PSMA小分子抑制劑及其類似物的全合成路線對(duì)促進(jìn)前列腺癌靶向性分子影像探針及藥物的開發(fā)有著重要的意義。

圖 1 NAAG及4種具有Glu-Urea骨架的GCPII型小分子抑制劑分子結(jié)構(gòu)[9]Fig.1 The molecular structure of NAAG and Four GCPII Small Molecular Inhibitors with Glu-Urea Framework

PSMA小分子抑制劑的合成路線已見諸報(bào)道，基本策略是以L-谷氨酸二叔丁基酯為起點(diǎn)，通過與其他氨基酸的氨基反應(yīng)構(gòu)成谷氨酸-脲骨架結(jié)構(gòu)。例如，陳驍馳等[15]就提供了一種通過L-谷氨酸叔丁基二酯與芐氧羰基(Cbz)和叔丁氧羰基(Boc)保護(hù)的L-賴氨酸通過三光氣反應(yīng)得到了具有Glu-Urea-Lys骨架的PSMA小分子抑制劑。但到目前為止，還沒有對(duì)以L-谷氨酸和L-賴氨酸為起始原料的合成路線的研究報(bào)道。因此，基于PSMA的小分子抑制劑及其類似物在前列腺癌分子影像學(xué)診斷及靶向治療中的作用，筆者提供了一種以L-谷氨酸和L-賴氨酸為起始原料的合成路線，為利用PSMA為靶點(diǎn)的前列腺癌的診斷與治療手段提供小分子抑制劑的合成策略。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

DF-101D型集熱式磁力攪拌器(鄭州予華)；DHJF-2005低溫?cái)嚢璺磻?yīng)浴(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào))；AVANCE III HD 400型核磁共振波譜儀(瑞士布魯克)；Q Exactive型超高分辨液質(zhì)聯(lián)用儀(Thermo-Filsher公司)；MCP 500自動(dòng)旋光儀(德國(guó)安東帕公司)。

L-谷氨酸、L-賴氨酸等所有藥品均購(gòu)自阿拉丁化學(xué)試劑公司，所有化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

如圖2所示，PSMA小分子抑制劑的合成將按以下路線進(jìn)行，化合物1、2、3 ···與圖中所進(jìn)行編號(hào)的化合物一一對(duì)應(yīng)。

(1) L-谷氨酸二叔丁基酯(化合物1)的合成。

取5 g L-谷氨酸溶于100 ml的醋酸叔丁酯中并置于冰浴中攪拌5 min后，緩慢滴加2.0 eqv的70%高氯酸溶液，置于室溫?cái)嚢柽^夜。反應(yīng)終了后，將反應(yīng)液降至0 ℃，并用冷的0.5 mol/L鹽酸(2×30ml)萃取，收集水相。再將碳酸鈉固體緩慢加入至水相中并攪拌至pH為8～10，二氯甲烷萃取，無水硫酸鈉干燥。過濾后的液體減壓旋蒸得到目標(biāo)化合物1，無色或淺黃色透明黏性液體。產(chǎn)率：47.6%，1H NMR (400 MHz,CDCl3) δ :3.50～3.40 (m, 1H), 3.03 (s, 3H), 2.37 (t, J=7.5 Hz,2H), 2.02 (d, J=10.3 Hz, 1H), 1.90～1.76 (m, 1H), 1.47(t, J=8.9 Hz, 18H)。13C NMR (101 MHz, CDCl3)δ:173.95, 172.61, 81.73, 80.64, 54.11, 31.82, 29.44,28.09, 28.03。HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C13H25NO4{[M+H]+}260.18524, found 260.18563,[α]D20=22.86 (C=0.687,CH3OH)。

(2) N6-(9 -芴甲氧羰基)-N2-叔丁氧羰基-L-賴氨酸(化合物2)的合成。

圖 2 小分子抑制劑PSMA-1的合成路線Fig.2 The synthesis route of small molecule inhibitors PSMA-1

化合物2的合成分為兩步驟進(jìn)行。第一步：17 g碳酸氫鈉加入到50 ml水中，攪拌形成堿液，將10 g L-賴氨酸鹽酸鹽加入其中攪拌15 min。再分批向反應(yīng)器中加入7 g無水硫酸銅攪拌1h，后加入22.1 g 9-芴甲基-N-琥珀酰亞胺碳酸酯和100 ml的四氫呋喃。攪拌14 h后加入100 ml碳酸氫鈉水溶液攪拌3 h。過后加入50 ml水和20 ml甲醇攪拌5 h后，加入50 ml乙酸乙酯攪拌30 min。最后過濾，濾渣至水洗為無色。真空干燥箱烘干后得到N6-Fmoc-L-賴氨酸的銅絡(luò)合物中間體。第二步：取烘干好的中間體10 g溶于四氫呋喃：水=1:1溶液中，依次分批加入10 g無水碳酸鈉與5 g 8-羥基喹啉。室溫?cái)嚢? h后往上述體系中加入6 g的二碳酸二叔丁酯(Boc酸酐)。繼續(xù)室溫?cái)嚢? h，過濾，濾液冷卻至5 ℃以下。用鹽酸調(diào)節(jié)pH至2～3，萃取得到粗產(chǎn)品，硅膠柱層析提純得到目標(biāo)化合物2，黃色粘稠狀液體。兩步驟合并總產(chǎn)率：65%，1H NMR (400 MHz,CDCl3) δ: 7.67 (t, J=6.9 Hz, 2H), 7.51 (d, J=7.2 Hz,2H), 7.32 (t, J=7.4 Hz, 2H), 7.23 (t, J=7.3 Hz, 2H), 6.08(s, 0.4H), 5.58 (s, 0.2H), 5.13 (s, 0.6H), 4.85 (s, 0.8H),4.27 (dd, J=62.5, 28.3 Hz, 6H), 3.11 (d, J=5.9 Hz, 2H),1.89～1.22 (m, 13H)。13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ:176.46, 156.74, 155.88, 143.97, 127.70, 127.08, 125.09,119.98, 80.17, 66.70, 53.27, 47.27, 40.63, 32.05, 29.35,28.36, 22.44。HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C26H32N2O6{[M-H]-}467.21884,found 467.21876。

(3) N6-(9 -芴甲氧羰基)-L-賴氨酸叔丁酯(化合物3)的合成。

取化合物2(1.0 eqv，2 g)溶于50 ml的醋酸叔丁酯中低溫?cái)嚢? min，緩慢滴加1.5 eqv的70%高氯酸溶液，并置于室溫?cái)嚢柽^夜。反應(yīng)終了后，將反應(yīng)液冷卻至0 ℃，小心加入2 mol/L的NaOH水溶液至pH為10。然后立即用乙酸乙酯萃取，無水硫酸鈉干燥后過濾，硅膠柱層析提純得到目標(biāo)化合物3，無色透明黏性液體。產(chǎn)率70%，1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ : 7.70 (d, J=7.5 Hz, 2H), 7.57 (d, J=7.3 Hz, 2H), 7.34 (t, J=7.4 Hz,2H), 7.26 (dd, J=9.9, 4.7 Hz, 2H), 4.39-4.24 (m, 1H),4.15 (d, J=8.3 Hz, 0H), 4.00 (t, J=5.9 Hz, 1H), 3.12 (s,1H), 1.94 (d, J=5.2 Hz, 1H), 1.46 (d, J=30.9 Hz, 14H)。13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ : 171.28, 168.49,156.96, 143.99, 141.24, 127.66, 127.11, 125.26, 125.08,119.89, 84.69, 66.81, 60.45, 54.16, 47.12, 40.34, 29.97,29.13, 27.82, 21.72, 21.07, 14.21。HR-MS(ESI)m/z:Calcd for C25H32N2O4{[M+H]+}425.24310, found 425.24348, [α]20D=7.9(C=1,CH3OH)。

(4) N6-(9 -芴甲氧羰基)-N2-(N-甲?；?L-谷氨酸二叔丁基酯)-L-賴氨酸叔丁酯(化合物4)的合成。

取化合物3(1.0 eqv，1 g)，溶解在二氯甲烷溶液中，置于0 ℃冰浴攪拌5 min后加入三光氣(0.4 eqv，0.28 g)并繼續(xù)在上述條件下反應(yīng)，TLC跟蹤反應(yīng)。反應(yīng)1～2 h后加入化合物1(1.0 eqv，0.612 g)和二異丙基乙胺(DIEA)(4.0 eqv，1.22 g)冰浴攪拌10 min后移至室溫?cái)嚢柚罷LC檢測(cè)反應(yīng)完全。硅膠柱層析提純(石油醚：乙酸乙酯=4:1)得到目標(biāo)化合物4，冷卻條件下為白色膏狀固體，置于室溫為無色透明粘稠狀固體。產(chǎn)率：75.3%，1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ : 7.75 (d,J=7.5 Hz, 2H), 7.61 (t, J=6.4 Hz, 2H), 7.39 (t, J=7.4 Hz,2H), 7.30 (td, J=7.4, 0.9 Hz, 2H), 5.30 (d, J=8.1 Hz, 3H),4.48～4.28 (m, 4H), 4.21(s, 1H), 3.18 (s, 2H), 2.28 (d,J=6.8 Hz, 2H), 2.04 (s, 1H), 1.91～1.79 (m, 1H),1.67～1.29(m, 32H)。13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ:172.60, 172.49, 172.38, 156.98, 156.65, 144.07, 141.30,127.63, 127.04, 125.17, 119.92, 82.16, 81.73, 80.52,66.55, 53.35, 53.05, 47.33, 40.67, 32.69, 31.60, 29.34,28.33, 28.08, 28.04, 28.01, 22.37。HR-MS(ESI)m/z:Calcd for C39H55N3O9{[M+Na]+}732.38275, found 732.38305。

(5) N2-(N-甲?；?L-谷氨酸二叔丁基酯)-L-賴氨酸叔丁酯(化合物5)的合成。

取2 g化合物4置于10%的二乙胺溶液中攪拌，TLC檢測(cè)反應(yīng)完全。減壓旋蒸后柱層析提純(乙酸乙酯：甲醇=25:1至1:1)得到目標(biāo)化合物5，黃色黏性固體。產(chǎn)率：70%，1H NMR (400 MHz, MeOD) δ:4.02(ddd, J=16.9, 8.4, 5.1 Hz, 2H), 2.51 (t, J=7.1 Hz, 2H),2.26～2.02 (m, 2H), 1.88 (dd, J=7.8, 5.9 Hz, 1H), 1.62 (s,2H), 1.52～1.42 (m, 1H), 1.42～1.22 (m, 31H)。13C NMR(101 MHz, MeOD) δ : 172.53, 172.33, 172.08, 158.56,81.38, 81.15, 80.33, 53.41, 52.80, 40.72, 31.99, 31.32,31.13, 27.63, 27.02, 26.97, 26.94, 22.53。HRMS(ESI)m/z: Calcd for C24H45N3O7{[M+H]+}488.33295, found 488.33303。

(6) N6-(對(duì)硝基苯氧羰基)-N2-(N-甲?；?L-谷氨酸二叔丁基酯)-L-賴氨酸叔丁酯(化合物6)的合成。

取化合物5(1.0 eqv，1 g)、三乙胺(1.0 eqv，0.21 g)溶于20 ml二氯甲烷溶液中，再加入對(duì)硝基苯基氯甲酸酯(1.2 eqv，0.49 g)，室溫下攪拌，TLC跟蹤反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后用減壓旋蒸掉多余溶劑，硅膠柱層析提純(石油醚：乙酸乙酯=2:1)得到目標(biāo)化合物6，無色透明黏性液體。產(chǎn)率：73%，1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ :8.288.20 (m, 2H), 7.39～7.30 (m, 2H), 6.01 (s, 1H), 5.29(d, J=8.1 Hz, 1H), 5.20 (s, 1H), 4.37 (qd, J=8.1, 4.8 Hz,2H), 3.27 (d, J=6.0 Hz,2H), 2.45～2.22 (m, 2H),2.15～2.02 (m, 1H), 1.95～1.72 (m, 2H), 1.65～1.54 (m,3H), 1.45 (dd, J=10.8, 7.6 Hz, 29H)。13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ : 173.29, 172.37, 172.22, 157.25,156.33, 153.42, 144.52, 125.03, 121.89, 82.58, 81.80,80.67, 53.27, 53.01, 41.06, 32.72, 31.54, 28.81, 28.16,28.05, 28.01, 22.55。HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C31H48N4O11{[M+H]+}675.32105, found, 675.32118。

(7) N6-(對(duì)硝基苯氧羰基)- N2-(N-甲?；?L-谷氨酸)-L-賴氨酸(PSMA-1)的合成。

取1 g化合物6溶于含有25%TFA的二氯甲烷溶液中反應(yīng)16 h，反應(yīng)液經(jīng)減壓旋蒸掉多余溶液后硅膠柱層析提純(甲醇：乙酸乙酯=1:1)得到目標(biāo)化合物7，無色透明黏性固體。產(chǎn)率：85%，1H NMR (400 MHz,MeOD) δ : 8.27 (d, J=9.1 Hz, 2H), 7.37 (d, J=9.1 Hz,2H), 4.33 (ddd, J=13.2, 8.3, 5.0 Hz, 2H), 3.23 (t, J=6.8 Hz, 2H), 2.49～2.37 (m, 2H), 2.23～2.08 (m, 1H),2.00～1.81 (m, 2H), 1.71 (dd, J=14.0, 7.3 Hz, 1H), 1.62(dd, J=11.4, 7.0 Hz, 2H), 1.51 (dd, J=14.9, 7.5 Hz, 2H)。13C NMR (101 MHz, MeOD) δ: 175.21, 174.63, 158.74,156.36, 154.30, 144.70, 124.68, 122.00, 52.68, 52.21,40.47, 31.65, 29.76, 28.78, 27.55, 22.45。HRMS(ESI)m/z: Calcd for C19H24N4O11{[M-H]-}483.13697, found 483.13688, [α]20D=11.3(C=1,CH3OH)。

2 結(jié)果與討論

本文以L-谷氨酸和L-賴氨酸等基礎(chǔ)化合物為原料，共計(jì)7步反應(yīng)得到具有Glu-Urea-Lys骨架的PSMA小分子抑制劑類似物。各步驟產(chǎn)物均進(jìn)行了1H NMR、13C NMR及高分辨質(zhì)譜表征，對(duì)化合物1，3與7進(jìn)行了旋光測(cè)試證明其仍保持光學(xué)活性。各步驟產(chǎn)率除化合物1的合成外均高于60%，線路總產(chǎn)率為18%。兩種初始中間體, 化合物1與化合物3的產(chǎn)率分別為47.6%與65%。伴隨著目標(biāo)產(chǎn)物的合成，筆者開發(fā)了一種針對(duì)L-賴氨酸羧基與ε氨基保護(hù)基保護(hù)的合成新思路。中間體化合物3的合成本質(zhì)上是氨基酸活性基團(tuán)的保護(hù)與脫保護(hù)。我們首先通過9-芴甲基氧羰基與叔丁氧羰基對(duì)L-賴氨酸ε氨基與α氨基進(jìn)行了保護(hù)，合成得到了化合物2。相較于其他文獻(xiàn)中ε氨基進(jìn)行芐氧羰基保護(hù)的L-賴氨酸中間體，9-芴甲基的優(yōu)點(diǎn)在于其脫保護(hù)時(shí)只需要二乙胺等有機(jī)胺即可短時(shí)間內(nèi)脫除，對(duì)比芐氧羰基的Pt/C +H2脫除法，成本更低，實(shí)驗(yàn)更安全。其次，在合成化合物3的過程中，我們通過運(yùn)用醋酸叔丁酯與70%HClO4的實(shí)驗(yàn)條件，一步反應(yīng)實(shí)現(xiàn)了對(duì)L-賴氨酸羧基的Boc保護(hù)與α氨基的Boc脫保護(hù)。

如圖3所示，I號(hào)路線為化合物3潛在的一般性合成路線，其合成過程為，首先對(duì)賴氨酸兩個(gè)氨基進(jìn)行保護(hù)，然后用叔丁基對(duì)羧基進(jìn)行保護(hù)，最后選擇性脫除α位Boc保護(hù)基得到化合物3。II號(hào)路線為筆者優(yōu)化改進(jìn)路線，兩種路線相比，I號(hào)路線比II號(hào)路線多一個(gè)步驟，且由于叔丁醇的位阻較大，其與羧基的酯化反應(yīng)將較為困難，在實(shí)際的合成過程中，其酯化產(chǎn)率低于30%，且后面還有一個(gè)Boc脫除的步驟，使化合物2到化合物3的產(chǎn)率低于20%。因此，我們?cè)O(shè)計(jì)了II號(hào)路線來達(dá)到合成化合物3的目的，首先仍然是對(duì)L-賴氨酸的兩個(gè)氨基進(jìn)行保護(hù)，在得到化合物2后，利用醋酸叔丁酯與70%HClO4與羧基進(jìn)行酯交換反應(yīng)得到L-賴氨酸叔丁酯衍生物。與此同時(shí)，在反應(yīng)過程中，利用HClO4的強(qiáng)酸性，反應(yīng)還伴隨著氨基上的Boc脫除進(jìn)而實(shí)現(xiàn)一步合成化合物3的目的，II號(hào)路線的設(shè)計(jì)不僅減少了反應(yīng)步驟，而且將化合物3的產(chǎn)率從I號(hào)路線的小于20%提高到70%。

圖 3 化合物3的合成優(yōu)化策略Fig.3 Optimized strategy for the synthesis of compound 3

3 結(jié)論

本文提供了一種PSMA小分子抑制劑的合成策略，以期望用于輔助開發(fā)靶向前列腺癌的分子探針及靶向治療藥物。合成路線中所選用的原料便宜易得，反應(yīng)過程條件溫和，有著18%的反應(yīng)總產(chǎn)率。同時(shí)，在開發(fā)PSMA小分子抑制劑的合成路線過程中，本文提供了一種一步法實(shí)現(xiàn)賴氨酸羧基與ε氨基Boc保護(hù)與脫保護(hù)的合成思路。