代永聯(lián) 郝小靜 衣服德 檀學(xué)進(jìn) 馮永勝

摘? 要：從青島某規(guī)?；u場的病雞上分離到一株疑似志賀氏菌的病原菌（編號(hào)為LB2-1），通過培養(yǎng)純化和16S rDNA測序等，確定該菌株為宋內(nèi)氏志賀氏菌。藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LB2-1菌株已經(jīng)對(duì)多種抗生素產(chǎn)生了不同程度的耐藥性，因此在臨床治療時(shí)，要精準(zhǔn)選用抗生素，或選用不易產(chǎn)生耐藥性的微生態(tài)制劑進(jìn)行治療，從而減少細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。

關(guān)鍵詞：志賀氏菌;分離鑒定;16S rDNA;耐藥性分析

中圖分類號(hào)：S858.31 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-0769（2020）04-0054-03

志賀氏菌是一種能引起人和動(dòng)物腹瀉的革蘭氏陰性桿菌。根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)，其可分為痢疾志賀氏菌（Shigella dyseteriae）、福氏志賀氏菌（Sh. flexneri）、鮑氏志賀氏菌（Sh. boydii）和宋內(nèi)氏志賀氏菌（Sh. sonnei）四個(gè)種群 [1]。2019年9月，我們從青島某規(guī)?；u場的病雞肝臟中分離到了一株疑似志賀氏菌的病原菌（編號(hào)為LB2-1），通過分離培養(yǎng)、生化反應(yīng)以及16S rDNA測序，最終確定該菌株為宋內(nèi)氏志賀氏菌。藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該菌株對(duì)多種抗生素有不同程度的耐藥性，但對(duì)左氧氟沙星和丁胺卡那最為敏感，對(duì)新霉素和鹽酸多西環(huán)素的敏感性次之，這一結(jié)果可供當(dāng)?shù)仉u場在防治畜禽宋內(nèi)氏志賀氏菌病時(shí)提供參考。

1? 材料與方法

1.1 材料

NA培養(yǎng)基、SS瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、志賀氏菌顯色培養(yǎng)基、三糖鐵培養(yǎng)基和志賀氏菌成套生化鑒定管等均購于青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

SW-CJ-1FD型超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），SHP-250型智能生化培養(yǎng)箱（上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司），ZHWY-100B型恒溫培養(yǎng)搖床箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），BX53生物顯微鏡（日本奧林巴斯醫(yī)療株式會(huì)社），Research plus可調(diào)量程移液器（Eppendorf公司）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌的分離純化

在無菌狀態(tài)下，從病雞的肝臟內(nèi)部取少量病料，分別劃線接種于SS瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基上，并置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h～24 h，觀察菌落生長狀況與形態(tài);挑選典型菌落接種于含5 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的試管中，置于37 ℃恒溫?fù)u床（轉(zhuǎn)速為170 r/min，下同）中培養(yǎng)18 h～24 h;從營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中取適量菌液，劃線接種于NA瓊脂上，然后將其置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，純化培養(yǎng)18 h～24 h;按照以上方法重復(fù)純化3～5次，直至獲得純的菌落，隨后挑選典型菌落進(jìn)行革蘭氏染色，再用顯微鏡檢查，觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.3.2 細(xì)菌的顯色培養(yǎng)

用接種環(huán)取一環(huán)菌液，接種于志賀氏顯色培養(yǎng)基上，將接種好的培養(yǎng)基置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h～24 h。

1.3.3 細(xì)菌的生化試驗(yàn)

挑選志賀氏顯色培養(yǎng)基上的典型菌落，隨后分別接種于三糖鐵瓊脂和志賀氏菌成套生化鑒定管進(jìn)行測定，詳細(xì)觀察并記錄結(jié)果。

1.3.4 16S rDNA測序分析

對(duì)數(shù)期的菌樣由上海派森諾基因科技有限公司進(jìn)行檢測。

1.3.5 藥敏試驗(yàn)

選取氨芐西林鈉、復(fù)方新諾明、鏈霉素、慶大霉素、頭孢曲松鈉、氟苯尼考、新霉素、左氧氟沙星、丁胺卡那和鹽酸多西環(huán)素等10種藥敏試紙片，按照世界衛(wèi)生組織推薦的Kirby-Bauer法進(jìn)行耐藥試驗(yàn)[2]，并按照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷。

2? 結(jié)果

2.1 菌落形態(tài)與革蘭氏染色特性

細(xì)菌在SS瓊脂培養(yǎng)基上形成整體半透明、邊緣整齊、表面光滑、稍微凸起和濕潤圓形的菌落;在NA瓊脂上形成直徑為3 mm左右有白色凸起且表面光滑且濕潤圓形的菌落;在麥康凱培養(yǎng)基上形成無色透明、光滑且凸起的圓形菌落。經(jīng)革蘭氏染色鏡檢，該菌為紅色且兩端鈍圓的短桿狀陰性菌。

2.2 顯色培養(yǎng)結(jié)果

致病菌LB2-1在志賀氏顯色培養(yǎng)基上呈直徑為1 mm～3 mm的圓形、邊緣整齊、表面光滑、稍微凸起以及帶藍(lán)色中心的白色菌落。

2.3 生化檢驗(yàn)結(jié)果

三糖鐵瓊脂反應(yīng)結(jié)果顯示：底層產(chǎn)酸但未產(chǎn)氣，斜面顏色未變，未產(chǎn)生H2S;經(jīng)過志賀氏菌成套生化鑒定管測定，參照志賀氏菌生化鑒定GB 4789.5-2012《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)志賀氏菌檢驗(yàn)》標(biāo)準(zhǔn)判定，詳細(xì)結(jié)果見表1。

2.4 16S rDNA測序分析結(jié)果

送上海派森諾基因科技有限公司進(jìn)行16S rDNA測序，美國國家生物技術(shù)信息中心官網(wǎng)上利用BLAST與GenBank數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果表明LB2-1菌株與宋內(nèi)氏志賀氏菌（Sh. sonnei）的進(jìn)化距離較近且同源性高，相似度為99.72%。

2.5 耐藥試驗(yàn)檢測結(jié)果，

LB2-1菌株對(duì)10種常用抗生素的耐藥分析結(jié)果見表2。

由表2可知，LB2-1菌株對(duì)氨芐西林、復(fù)方新諾明、鏈霉素和氟苯尼考等均產(chǎn)生了不同程度的耐藥性，對(duì)左氧氟沙星和丁胺卡那有良好的敏感性。

3? 討論

在中國，最常見的志賀氏菌是痢疾志賀氏菌和福氏志賀氏菌，宋內(nèi)氏志賀氏菌比較少見，但隨著人員的流動(dòng)和動(dòng)物品種的引進(jìn)，我國畜禽養(yǎng)殖行業(yè)動(dòng)物感染宋內(nèi)氏志賀氏菌的比例呈明顯的上升趨勢(shì)[2]。根據(jù)本試驗(yàn)對(duì)病原菌LB2-1菌株的分離與鑒定，最終確定其為宋內(nèi)氏志賀氏菌，說明本地區(qū)其他畜禽養(yǎng)殖場也存在動(dòng)物感染宋內(nèi)氏志賀氏菌的風(fēng)險(xiǎn)，因此本地區(qū)畜禽養(yǎng)殖場需要加強(qiáng)動(dòng)物感染宋內(nèi)氏志賀氏菌的防治工作。

近年來，隨著抗生素的大量使用，許多細(xì)菌對(duì)各種抗生素產(chǎn)生了不同程度的多重耐藥性，志賀氏菌的耐藥范圍和耐藥水平也在不斷攀升[3]。本次藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，LB2-1菌株已經(jīng)對(duì)氨芐西林、復(fù)方新諾明和鏈霉素等多數(shù)抗生素產(chǎn)生了耐藥性，因此在進(jìn)行臨床治療時(shí)，獸醫(yī)要注意篩選敏感抗生素，做到精準(zhǔn)用藥;同時(shí)，在幾種敏感抗生素中，應(yīng)采用輪換用藥，避免細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。另外，近年來有些科研單位和獸藥生產(chǎn)廠研制的新型微生態(tài)制劑（如噬菌體）、裂解酶和中草藥等來替代抗生素，也成為解決畜禽細(xì)菌性疾病防治的一種新途徑。

參考文獻(xiàn)：

[1] 焦振泉，劉秀梅，孟昭赫. 16S rRNA序列同源性分析與細(xì)菌系統(tǒng)分類鑒定[J]. 國外醫(yī)學(xué)衛(wèi)生學(xué)分冊(cè)，1998，2（1）： 12-6.

[2] 王建. 我國宋內(nèi)氏志賀菌流行特征、耐藥性及變異研究[D]. 北京：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，2016.

[3] 王碩. 雞源多重耐藥志賀氏菌病的流行病學(xué)調(diào)查[D]. 長春：吉林農(nóng)業(yè)大 學(xué)，2018.