趙仲艷，劉 濤，趙二義，黃仕雄，徐志育

阿爾茨海默病(alzheimer disease，AD)是一種進行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其發(fā)病機制尚不清楚，臨床治療主要以控制精神癥狀、改善患者認知功能為主[1]。建立相應的動物模型來研究其發(fā)病機制，尋找更有效的藥物對于AD的治療具有重要意義。神經(jīng)妥樂平(neurotropin，NTP)是牛痘疫苗接種家兔后，從其炎癥皮膚中提取的一種小分子活性物質[2]。NTP可以調節(jié)機體的免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等，具有神經(jīng)修復、抗感染、鎮(zhèn)痛等作用，臨床常用于腰痛癥、肩周炎、變形性關節(jié)炎等的治療[3]。近年來，研究[4]顯示，NTP可以調節(jié)機體的信號通路，保護神經(jīng)元損傷。因此，該研究建立AD體外模型，旨在分析NTP對AD大鼠的作用及其具體作用機制，為新藥物的開發(fā)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 動物、儀器與試劑SPF級SD雄性大鼠45只，體質量220～250 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物許可證號SCXK(京)2017-0022，飼養(yǎng)于本院動物中心實驗室，保持室溫恒定為25 ℃，模擬晝夜，自由攝食與飲水。HT-7700透射電鏡購自日本日立公司；NTP購自日本Nippon Zoki Pharmaceutical，注冊證號 S20140085；β淀粉樣蛋白(Aβ1-42)購自美國Sigma公司；TUNEL檢測試劑盒購自上海秉新生物科技有限公司；Notch1、NICD、Hes5、Caspase-3、Bcl-2、Bax、Beclin1、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ單克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司；β-actin和辣根過氧化酶(HRP)標記羊抗兔IgG購自DAKO公司。

1.2 動物造模及給藥大鼠預飼養(yǎng)1周后，隨機均分為對照組、模型組和NTP組。模型組和NTP組每日上午腹腔注射D-半乳糖(100 mg/kg)[5]，6周后，模型組和NTP組麻醉后，海馬區(qū)緩慢注入5 μl β淀粉樣蛋白(Aβ1-42)，對照組注射等體積生理鹽水。若造模后大鼠出現(xiàn)反應遲鈍、動作遲緩等，則為造模成功[6]。造模后，NTP組腹腔注射1 ml NTP溶液(1.2 Nu/kg)；模型組和對照組腹腔注射等體積生理鹽水，連續(xù)治療2周。于治療后處死大鼠，迅速斷頭取腦，無菌取大鼠海馬組織。

1.3 各組大鼠行為學測試及腦組織病理學檢查造模前，將大鼠放入溫水中自由游泳5 min，熟悉水迷宮[6]。于術后第10 天至術后第14 天采用Morris水迷宮測試各組大鼠的行為學。定位航行實驗：將大鼠從一個象限輕放入水，若120 s內大鼠能找到平臺，記錄其時間為逃避潛伏期，若120 s后仍未找到，則逃避潛伏期為120 s，連續(xù)試驗4 d?？臻g探索實驗：實驗第5天將平臺拿走，將大鼠從一個象限輕放入水，記錄120 s內大鼠在原平臺象限停留的時間及占總路程的百分比。

1.4 各組大鼠腦組織病理學檢查取大鼠海馬組織，采用4%多聚甲醛固定，進行常規(guī)切片制作，進行HE染色，在光鏡下觀察組織的病理變化，每張切片隨機取5個視野拍照。

1.5 各組海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡的觀察取大鼠海馬組織，采用4%多聚甲醛固定，進行常規(guī)切片，采用TUNEL法進行染色，嚴格按照試劑盒說明操作，于熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡情況，根據(jù)陽性細胞數(shù)與總細胞數(shù)，計算出細胞凋亡率。采用Western blot測定組織中Caspase-3、Bax和Bcl-2的表達量。

1.6 各組海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)元自噬的觀察取大鼠海馬組織，采用2.5%戊二醛和2%多聚甲醛的磷酸緩沖液的混合固定液固定，梯度酒精脫水、浸泡、包埋，醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，電鏡下觀察。采用Western blot測定組織中Beclin1、LC3-Ⅱ和LC3-Ⅰ的表達量。

1.7 Western blot檢測海馬組織Notch信號通路的表達取海馬區(qū)腦組織，勻漿，使用細胞裂解液嚴格按照蛋白裂解步驟提取總蛋白，采用BCA法進行蛋白定量，取50 ng總蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，電轉膜至PVDF膜，室溫密封2 h，采用洗膜緩沖液洗膜并加一抗(稀釋比例均為1 ∶ 1 000)4 ℃孵育過夜，洗膜加二抗(稀釋比例均為1 ∶ 5 000)室溫孵育2 h。再用ECL化學發(fā)光顯示，選用β-actin作為內參，凝膠圖像處理系統(tǒng)分析對比條帶強弱。

2 結果

2.1 NTP對AD大鼠學習記憶能力的影響Morris水迷宮試驗結果顯示：與對照組比較，模型組和NTP組大鼠逃避潛伏期在第2、3 和4 天明顯增加(P<0.05)，第5天在原象限停留的時間比和路程比明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，NTP組大鼠逃避潛伏期在第2、3和4天明顯降低(P<0.05)，第5天在原象限停留的時間比和路程比明顯升高(P<0.05)。見圖1。

2.2 NTP對AD大鼠海馬CA1組織病理變化的影響HE染色結果顯示，對照組大鼠海馬組織細胞結構完整，神經(jīng)元細胞形態(tài)正常；模型組大鼠海馬組織大量細胞出現(xiàn)核固縮呈三角形，胞質嗜伊紅，正常細胞數(shù)減少；NTP組大鼠海馬組織細胞形態(tài)趨于正常，僅見少量核固縮的細胞。見圖2。

2.3 NTP對AD大鼠海馬CA1組織凋亡的影響TUNEL結果顯示，與對照組比較，模型組和NTP組海馬組織細胞的凋亡率明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，NTP組海馬組織細胞的凋亡率明顯降低(P<0.05)。Western blot實驗顯示，與對照組比較，模型組和NTP組海馬組織Caspase-3、Bax蛋白的表達明顯上調(P<0.05)，Bcl-2蛋白的表達明顯下調(P<0.05)；與模型組比較，NTP組海馬組織Caspase-3、Bax蛋白的表達明顯下調(P<0.05)，Bcl-2蛋白的表達明顯上調(P<0.05)。見圖3。

圖1 NTP對AD大鼠學習記憶能力的影響

A： Morris水迷宮定位航行實驗統(tǒng)計結果；B：水迷宮空間探索實驗統(tǒng)計結果；a：對照組；b：模型組；c：NTP組；與對照組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05

圖2 NTP對AD大鼠海馬組織形態(tài)學影響 HE×400

A：對照組；B：模型組；C：NTP組

圖3 NTP對AD大鼠海馬組織凋亡的影響

A：TUNEL染色檢測AD大鼠海馬組織的凋亡×400；B：Western blot檢測蛋白的表達；a：對照組；b：模型組；c：NTP組；與對照組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05

圖4 NTP對AD大鼠海馬CA1組織自噬的影響

A：電鏡檢測AD大鼠海馬組織的自噬，箭頭所指為凋亡小體×20 000；B：Western blot檢測蛋白的表達；a：對照組；b：模型組；c：NTP組；與對照組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05

2.4 NTP對AD大鼠海馬CA1組織自噬的影響電鏡顯示，對照組大鼠海馬組織細胞結果完整，偶見個別的自噬體；模型組大鼠海馬組織的自噬體數(shù)量明顯增多；NTP組大鼠海馬組織的自噬體數(shù)量明顯減少。Western blot實驗顯示，與對照組比較，模型組海馬組織Beclin-1蛋白的表達明顯下調，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例明顯上調(P<0.05)；與模型組比較，NTP組海馬組織Beclin-1和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例均明顯上調(P<0.05)。見圖4。

2.5 NTP對AD大鼠海馬組織Notch信號通路表達的影響與對照組比較，模型組和NTP組大鼠Notch1、NICD和Hes5蛋白的表達明顯下調(P<0.05)；與模型組比較，NTP組大鼠Notch1、NICD和Hes5蛋白的表達明顯上調(P<0.05)。見圖5。

3 討論

AD是一種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，腹腔注射D-半乳糖注射造模是一種最為簡便有效的方式，海馬區(qū)注射Aβ多肽是模擬AD病理損害的一種重要的方法[7]。因此，本研究采用腹腔注射D-半乳糖聯(lián)合海馬區(qū)注射Aβ1-42建立大鼠AD模型。NTP干預可以顯著縮短AD大鼠在Morris水迷宮試驗中延長的逃避潛伏期。Morris水迷宮是常用的評估動物學習記憶能力的實驗，包括陳述性記憶和空間參考記憶兩個方面，提示NTP干預可以顯著改善AD大鼠降低的學習記憶能力。本研究中，NTP干預可以明顯改善AD大鼠海馬組織的病理損傷。李波 等[8]的研究顯示，NTP可以調節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，對于腦缺血、腦水腫、神經(jīng)痛等具有良好的臨床療效，提示NTP可能通過調節(jié)機體的信號通路，改善AD大鼠的學習記憶障礙，減輕腦組織損傷。

本研究中，AD大鼠海馬組織的溶酶體和自噬體數(shù)量明顯增加，經(jīng)NTP干預后溶酶體和自噬體數(shù)量明顯減少。臨床研究[9]顯示，AD患者存在異常增強的自噬作用，可以參與Aβ的產(chǎn)生、轉運和清除，參與AD的發(fā)生發(fā)展，本研究結果與之基本一致，提示NTP可能通過調節(jié)自噬，減輕AD的病理損傷。本研究中，NTP干預可以下調AD大鼠海馬組織中降低的Beclin1水平，上調LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比例。LC3是一種典型的自噬體標志物，在自噬狀態(tài)下，LC3-Ⅰ會轉變?yōu)橐环N膜結合形式即LC3-Ⅱ，臨床常用LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值來衡量自噬活性；Beclin1是一個參與自噬和調控自噬的關鍵基因，與自噬吞噬小泡的形成初期有關[10]。Pomilio et al[11]的研究顯示，早期誘導自噬可以加快病理蛋白的清除，減輕Aβ的神經(jīng)毒性，本研究結果與之基本一致，提示NTP可能通過誘導自噬，加快Aβ的清除，減輕AD大鼠的病理損傷。本研究中，NTP干預可以明顯下調凋亡蛋白Caspase-3和Bax的表達，上調Bcl-2的表達，降低AD大鼠升高的細胞凋亡率。Zhang et al[12]的研究顯示，Beclin-1是可以與Bcl-2等抗凋亡蛋白結合，抑制其抗凋亡作用，本研究結果與之基本一致，提示NTP可能通過調節(jié)機體的自噬作用，抑制神經(jīng)元細胞凋亡，保護腦組織損傷。

Notch信號通路是一種高度保守的信號通路，廣泛的存在于脊椎動物和非脊椎動物中，可以參與多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展，包括AD、腦缺血損傷等。本研究中，AD大鼠海馬組織中Notch1、NICD和Hes5蛋白的表達顯著下調，經(jīng)NTP干預后，表達明顯上調。Notch 1是一種單次跨膜受體，與相鄰配體結合可以活化γ-分泌酶，促進NICD的釋放并與核內的轉錄因子結合，增強下游靶基因Hes的表達，Hes5是Notch1信號通路的關鍵靶基因，可以參與調控多個細胞的發(fā)育、增殖、凋亡等[13]。Kong et al[14]的研究顯示，AD患者的海馬組織中Notch1的表達水平顯著高于正常組，其機制可能與β淀粉樣前體蛋白、早老素等有關，本研究結果與之有所差異，可能是由于本研究采用Aβ1-42建立大鼠AD模型，抑制Notch1的表達，引起神經(jīng)退行性變化。張麗 等[15]的研究顯示，Aβ可以抑制Notch1的表達，抑制神經(jīng)干細胞的增殖分化，本研究結果與之基本一致，提示NTP干預可能通過激活Notch信號通路，促進神經(jīng)干細胞分化，提高AD大鼠的學習記憶能力。

圖5 各組大鼠海馬組織Notch信號通路的表達

a：對照組；b：模型組；c：NTP組；與對照組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05