陳 鵬，況 亮，呂逸麗，張 闊，姚余有,2

抑郁癥是一種慢性精神疾病，特點(diǎn)是思維緩慢、反復(fù)發(fā)作，嚴(yán)重者甚至危及生命。研究[1]發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者海馬、大腦皮層、杏仁核等部位發(fā)生明顯異常。抑郁和焦慮可能與下丘腦分泌過多的促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotrophin-releasing hormone，CRH)有關(guān)[2-4]。課題組以往的實(shí)驗(yàn)[5]結(jié)果顯示，妊娠期慢性應(yīng)激可引發(fā)子代雄鼠抑郁，但目前尚不清楚是否由CRH分泌增多引起。CRH和CRH受體1(CRH receptor 1, CRHR1)廣泛分布于全腦，參與并影響海馬、大腦皮層、杏仁核等部位眾多生理功能[6-7]。因此，現(xiàn)使用慢性不可預(yù)測的輕度應(yīng)激(chronic unpredictable mild stress, CUMS)方式作用于妊娠期大鼠，通過向其子代雄鼠側(cè)腦室微量注射CRHR1拮抗劑(NBI30775)，觀察子代雄鼠行為學(xué)和組織病理學(xué)改變，并利用體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)來研究子代雄鼠抑郁的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器CRHR1拮抗劑NBI30775(英國Tocris Bioscience公司)；anti-mTOR、anti-p-mTOR(Ser2448)(美國Cell Signaling Technology公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；酶聯(lián)免疫試劑盒(ELISA)(上海江萊生物有限公司)；MEM(美國Hyclone公司)；馬血清(美國Gibico公司)；插入式微孔濾膜(美國Millipore公司)；強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)分析系統(tǒng)(上海欣軟信息科技有限公司)；大鼠腦立體定位儀、微量注射器和微量給藥套管(深圳瑞沃德生命科技有限公司)；Western blot 相關(guān)儀器(北京六一廠)；ELX全自動酶標(biāo)儀(美國BD公司)；CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)。

1.2 動物與分組8周齡SPF級Sprague Dawley大鼠，雌鼠30只，雄鼠15只，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。動物飼養(yǎng)方法：室溫(24±1) ℃，相對濕度50%，正常提供食物和水，飼養(yǎng)7 d以適應(yīng)周圍環(huán)境。7 d后，按照雌雄比例2 ∶ 1在20 ∶ 00點(diǎn)合籠，次日早上07 ∶ 00點(diǎn)查陰。標(biāo)記、稱重查到陰栓的母鼠，單籠飼養(yǎng)并記錄為受孕第1天。為研究不同妊娠期應(yīng)激時間對子代大鼠行為學(xué)的影響，將妊娠期母鼠分為妊娠期正常對照組(CON組)、妊娠中期(7～14 d)處理組(MIDDLE組)、妊娠晚期(15～21 d)處理組(LATE組)和妊娠中晚期(7～21 d)處理組(MID-LATE組)。隨機(jī)取出同一組孕鼠孕育的子代雄鼠，于出生后30 d做行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，選取最強(qiáng)致子代抑郁的應(yīng)激方式。在上述基礎(chǔ)上重新應(yīng)激孕鼠(應(yīng)激時間為7～21 d)。待子鼠出生后，按妊娠期應(yīng)激與不應(yīng)激將子代雄鼠分成以下4組：妊娠期正常對照+子代對照組(CON組)、妊娠期正常對照+子代側(cè)腦室注射 CRHR1 拮抗劑組(CON+ANT組)、妊娠期慢性應(yīng)激+子代側(cè)腦室注射 CRHR1拮抗劑組(CUMS+ANT組)、妊娠期慢性應(yīng)激+子代對照組(CUMS組)。

1.3 慢性應(yīng)激方法慢性應(yīng)激組：正常喂養(yǎng)1周后，受孕第8天起開始慢性不可預(yù)知性輕度刺激：夾尾巴(離尾尖5 cm處，5 min)、禁水(24 h)、冰水游泳(水溫4 ℃，15 min)、改變居住環(huán)境(讓鼠在潮濕的墊料上生活24 h)、晝夜顛倒、禁食(24 h)、搖床振蕩等，每天隨機(jī)施加1種刺激方式(禁水、禁食除外)，直到大鼠分娩。

1.4 給藥方式產(chǎn)后10 d，用4%的水合氯醛腹腔注射麻醉子鼠，并利用腦立體定位儀定位側(cè)腦室(以前囟為原點(diǎn)，AP-0.7 mm、L2.0 mm、V3.3 mm)，將不銹鋼導(dǎo)管插入側(cè)腦室，用牙托粉和牙托水將其固定。手術(shù)后皮下注射抗生素(0.1×104U/只，每天1次)，持續(xù)注射3 d防止子鼠感染。NBI30775給藥劑量為2.5 mg/(kg·d)，給藥周期為10～30 d。

1.5 抑郁模型大鼠行為學(xué)評價

1.5.1強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)(forced swimming test，F(xiàn)ST) 試驗(yàn)第1天進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，將大鼠置于直徑20 cm玻璃桶中游泳15 min[水深30 cm，水溫(24±1) ℃]。第2天，將大鼠置于桶中游泳6 min，拍攝大鼠在桶中的運(yùn)動情況，統(tǒng)計(jì)后4 min不動時間總和。

1.5.2糖水偏好實(shí)驗(yàn)(sucrose preference test，SPT) 試驗(yàn)第1天進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，在每個籠子兩側(cè)放2瓶1%蔗糖水(50 ml的透明玻璃瓶)。第2天禁食禁水。第3天，每個籠子一側(cè)放1瓶1%蔗糖水，另外一側(cè)放1瓶純凈水。稱重并記錄1%蔗糖水和純凈水消耗量。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，分析得到得數(shù)據(jù)并且計(jì)算糖水偏好值 =(糖水前后重量差值/總液體前后重量差值)×100%。

1.6HE染色觀察海馬形態(tài)學(xué)改變行為學(xué)實(shí)驗(yàn)全部結(jié)束后，取出全腦，4%多聚甲醛固定腦組織。24 h后進(jìn)行脫水、包埋，做冠狀切片，染色。在顯微鏡(200倍)下拍攝海馬 CA3 區(qū)神經(jīng)細(xì)胞，保存圖片。用 Image-Pro Plus軟件的計(jì)數(shù)功能標(biāo)記出神經(jīng)元的數(shù)目并求出平均值。

1.7 ELISA法檢測海馬組織中CRH含量實(shí)驗(yàn)時稱取一定量的海馬組織，按照酶聯(lián)免疫試劑盒(ELISA)使用書的說明進(jìn)行操作，測定海馬組織CRH的含量，海馬組織CRH的濃度單位用CRH/總蛋白(pg/mg)表示。

1.8 Western blot法檢測海馬組織哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)和p-mTOR(Ser2448)蛋白含量稱量40 mg的海馬組織，加入 PBS輕搖洗滌，勻漿，4 ℃離心后分離上清液，重復(fù)1次。灌制8%的膠,電泳(60 V/90 min,120 V/180 min),轉(zhuǎn)膜(250 mA/250 min)，純水洗膜3次后封閉1.5 h，孵育一抗(4 ℃過夜)。TBST洗膜4次后孵育二抗。加適量顯色液顯影并拍照，保存照片分析結(jié)果?？贵w濃度β-actin鼠抗(1 ∶ 2 000)、mTOR兔抗(1 ∶ 2 000)、p-mTOR兔抗(1 ∶ 2 000)、二抗羊抗兔(1 ∶ 5 000)。

1.9 Western blot法檢測體外培養(yǎng)海馬腦片中mTOR蛋白含量取10 d的SD大鼠大腦，制作冠狀切片(180 μm)，切下的腦片置于4 ℃的HBSS中，最后將切片放置在裝有培養(yǎng)基的Millicell-CM微孔膜上。培養(yǎng)基組成成分為50% MEM、25%馬血清、24% HBSS溶液、1%的100 UL/ml青鏈霉素雙抗、6.5 mg/ml葡萄糖，pH 7.25。放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h內(nèi)換液，隨后1周內(nèi)每隔1 d更換1次培養(yǎng)基，以提供海馬腦片充足的營養(yǎng)和適宜的生長環(huán)境。1周以后，將實(shí)驗(yàn)分為1.0×10-6mol/L CRH+0.1×10-6mol/L CRHR1 拮抗劑組(Low組)、1.0×10-6mol/L CRH+1.0×10-6mol/L CRHR1拮抗劑組(Middle組)、1.0×10-6mol/L CRH+10×10-6mol/L CRHR1拮抗劑組(High組)、1.0×10-6mol/L CRH+溶劑對照組(CRH組)和正常對照組(Control 組)。其中CRHR1拮抗劑終濃度設(shè)定為(0.1～10)×10-6mol/L，CRH濃度為1.0×10-6mol/L。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件分析實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)，用單因素方差分析(ANOVA)比較多組間均數(shù)差異，用最小顯著差異法(least significant difference，LSD)作兩兩比較。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 妊娠期不同應(yīng)激階段對子代雄鼠的影響如表1所示，與CON組相比，MIDDLE、LATE和MID-LATE組的大鼠糖水偏好率均下降(P<0.05)，強(qiáng)迫游泳不動時間均增長(P<0.05)；與MIDDLE組和LATE組相比，MID-LATE組大鼠強(qiáng)迫游泳不動時間更長(P<0.05)，糖水偏好率下降(P<0.05)。

表1 各組子代大鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

與CON組比較：*P<0.05；與MIDDLE組、LATE組比較：#P<0.05

2.2 CRHR1拮抗劑對子代雄鼠行為學(xué)影響如表2所示，與CON組相比，CUMS組大鼠糖水偏好率下降(P<0.05)，強(qiáng)迫游泳不動時間增長(P<0.05)；與CUMS組相比，CUMS+ANT組大鼠糖水偏好率上升(P<0.05),強(qiáng)迫游泳不動時間減少(P<0.05)；與CON組相比，CON+ANT組大鼠糖水偏好率和強(qiáng)迫游泳不動時間無明顯變化。

表2 各組子代大鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

與CON組比較：*P<0.05；與CUMS組比較：#P<0.05

2.3 CRHR1拮抗劑對子代雄鼠海馬病理學(xué)影響HE染色結(jié)果顯示，CON組與CON+ANT組海馬CA3區(qū)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量較多，細(xì)胞排列緊密，核仁界限清晰、明顯。CUMS組海馬CA3區(qū)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量較少，細(xì)胞排列疏松，發(fā)生核固縮的細(xì)胞較多。用Image-Pro Plus分析軟件的計(jì)數(shù)功能標(biāo)記海馬CA3區(qū)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量，分析結(jié)果顯示，與CON組(121.01±9.64)相比，CUMS組(83.00±5.24)神經(jīng)元總數(shù)減少(P<0.05)；與CUMS組(83.00±5.24)相比，CUMS+ANT組(101.25±5.91)神經(jīng)元總數(shù)增加(P<0.05)；而CON組與CON+ANT組(125.67±7.51)相比神經(jīng)元總數(shù)無明顯區(qū)別。見圖1。

圖1 各組子代雄鼠海馬CA3區(qū)HE染色圖 ×200

A:CON組；B:CON+ANT組；C:CUMS組；D:CUMS+ANT組

2.4 CRHR1拮抗劑對子代雄鼠海馬組織中CRH水平影響ELISA檢測結(jié)果顯示，與CON組大鼠相比，CUMS組大鼠海馬組織中CRH水平升高(P<0.05)；與CUMS組相比，CUMS+ANT組大鼠海馬組織中CRH水平降低(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組子代大鼠海馬組織CRH水平影響(n=3)

與CON組比較：*P<0.05；與CUMS組比較：#P<0.05

2.5 CRHR1拮抗劑對子代海馬mTOR、p-mTOR蛋白表達(dá)影響采用Western blot法檢測mTOR和p-mTOR蛋白水平。圖3顯示，與CON組相比，CUMS組大鼠海馬組織中mTOR表達(dá)量下降(P<0.05)；與CUMS組相比，CUMS+ANT組大鼠海馬組織中mTOR表達(dá)量上升。圖4顯示，與CON組相比，CUMS組大鼠海馬組織中p-mTOR水平下降(P<0.05)；與CUMS組相比，CUMS+ANT組大鼠海馬組織中p-mTOR表達(dá)量上升。CON組和CON+ANT組大鼠海馬組織中mTOR和p-mTOR表達(dá)量均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.6 CRHR1拮抗劑對體外培養(yǎng)海馬腦片中mTOR蛋白水平影響采用Western blot法檢測體外培養(yǎng)的海馬腦片mTOR蛋白水平，結(jié)果顯示，與對照組相比，CRH組大鼠海馬腦片mTOR表達(dá)量下降(P<0.05)；與CRH組相比，低、中和高劑量CRHR1拮抗劑組大鼠海馬腦片mTOR表達(dá)量增加(P<0.05)；但低、中和高劑量CRHR1拮抗劑組與對照組相比，大鼠海馬腦片mTOR表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且低、中和高劑量CRHR1拮抗劑組3組之間組內(nèi)比較大鼠海馬腦片mTOR表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖5。

圖3 CRHR1拮抗劑對海馬組織中mTOR蛋白表達(dá)的影響(n=3)

與CON組比較：*P<0.05；與CUMS組比較：#P<0.05

圖4 CRHR1拮抗劑對海馬組織中p-mTOR蛋白表達(dá)的影響(n=3)

與CON組比較：*P<0.05；與CUMS組比較：#P<0.05

3 討論

不同妊娠時期應(yīng)激會對子代雄鼠的行為產(chǎn)生不同的影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， 與CON組相比，MID-DLE、LATE和MID-LATE組的大鼠糖水偏好率下降、強(qiáng)迫游泳不動時間增長，且MID-LATE組比MIDDLE和LATE組強(qiáng)迫游泳不動時間更長，糖水偏好率提高，提示MID-LATE妊娠期應(yīng)激組子代雄性大鼠抑郁程度最嚴(yán)重。

圖5 CRHR1拮抗劑對體外培養(yǎng)海馬腦片中mTOR蛋白表達(dá)的影響(n=3)

1：低劑量CRHR1拮抗劑組；2：中劑量CRHR1拮抗劑組；3：高劑量CRHR1拮抗劑組；4：CRH組；5：對照組；與CRH組比較：*P<0.05

CRH和CRHR1在全腦分布廣泛，故本實(shí)驗(yàn)通過向妊娠期慢性應(yīng)激子鼠側(cè)腦室微量注射CRHR1拮抗劑，并結(jié)合體外培養(yǎng)海馬腦片更有利于探討妊娠期慢性應(yīng)激誘導(dǎo)子代雄性大鼠抑郁的機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與CON組相比，CUMS組大鼠糖水偏好率下降，強(qiáng)迫游泳不動時間增長，說明妊娠期慢性應(yīng)激致子代出現(xiàn)抑郁樣癥狀。與CUMS組相比，CUMS+ANT組大鼠糖水偏好率上升，強(qiáng)迫游泳不動時間減少，提示CRH參與了妊娠期慢性應(yīng)激致子代抑郁。HE染色和海馬組織CRH濃度檢測結(jié)果顯示，與CON相比，CUMS組的子代雄鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)細(xì)胞損傷，海馬組織CRH濃度升高，而加入CRHR1拮抗劑后，CUMS+ANT組子代雄鼠海馬病理損傷改善，提示妊娠期慢性應(yīng)激通過提高子代海馬組織中CRH水平，導(dǎo)致海馬CA3區(qū)損傷，從而引起抑郁樣癥狀。本研究結(jié)果還顯示，CRHR1拮抗劑可下調(diào)CUMS引起的升高的CRH，其機(jī)制不詳，還有待于進(jìn)一步研究。

mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，參與調(diào)控蛋白質(zhì)翻譯、細(xì)胞增殖與死亡等生理過程[8]。研究[9-10]發(fā)現(xiàn)，激活mTOR通路，可通過上調(diào)多種相關(guān)蛋白的磷酸化水平，提高神經(jīng)元的可塑性，產(chǎn)生抗抑郁效果。本研究結(jié)果顯示，CUMS組大鼠海馬組織中mTOR和p-mTOR蛋白的表達(dá)低于CON組，但側(cè)腦室注射CRHR1拮抗劑后mTOR和p-mTOR蛋白表達(dá)升高，提示CRHR1拮抗劑可上調(diào)妊娠期慢性應(yīng)激導(dǎo)致的子鼠mTOR和p-mTOR的蛋白水平的降低。此外體外培養(yǎng)海馬腦片結(jié)果顯示，CRH、低、中和高劑量CRHR1拮抗劑組大鼠海馬腦片mTOR蛋白表達(dá)量增加，且中劑量組的mTOR蛋白表達(dá)水平接近正常水平，進(jìn)一步說明CRHR1拮抗劑可以上調(diào)mTOR蛋白表達(dá)水平，提示妊娠期慢性應(yīng)激通過下調(diào)子鼠海馬mTOR蛋白水平致海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷，最終引起抑郁。遺憾的是，本課題組尚未掌握體外觀察海馬腦片病理形態(tài)的技術(shù)，無法在觀察mTOR蛋白的同時觀察海馬腦片的病理改變。此外本研究也未能成功檢查海馬神經(jīng)元凋亡狀況，也是本文不足之處。

綜上所述，妊娠期慢性應(yīng)激可導(dǎo)致子代出現(xiàn)抑郁樣行為，其作用機(jī)制可能是妊娠期慢性應(yīng)激誘導(dǎo)子代海馬組織CRH水平升高，通過抑制mTOR通路的激活，導(dǎo)致海馬CA3區(qū)神經(jīng)細(xì)胞損傷，進(jìn)而使子代抑郁。