焦婷，朱慧越，司倩，許夢(mèng)舒，孫姍姍，馬方勵(lì)，王剛*，趙建新，張灝，陳衛(wèi)

1(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫，214122)2(無限極(中國(guó))有限公司，廣東 廣州，510623)

在亞洲地區(qū)，隨著人們生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的變化，非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)患病率逐年升高，由此演變的非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化以及肝癌的發(fā)病率也隨之增加[1]。由于非酒精性脂肪性肝病的預(yù)后性較好，治療NAFLD已成為預(yù)防惡性肝臟類疾病的重要措施。NAFLD的發(fā)病原因復(fù)雜，目前尚無明確完整的病理機(jī)制[2]。研究表明，NAFLD患者多具有明顯的肝臟脂肪變性、血脂代謝紊亂、胰島素抵抗、腸道菌群紊亂等癥狀[3]。目前緩解NAFLD的方式主要為加強(qiáng)運(yùn)動(dòng)、降低能量攝入，尚無專門針對(duì)NAFLD的藥物[2， 4]。

腸道菌群是腸道屏障中的重要成員，影響著宿主的營(yíng)養(yǎng)吸收、能量代謝以及免疫應(yīng)答[5]。在健康人群中，腸道菌群種類及數(shù)量繁多，作為優(yōu)勢(shì)菌群的Firmicutes與Bacteroidetes在腸道菌群結(jié)構(gòu)中呈現(xiàn)相對(duì)穩(wěn)定的比例，腸道菌群失調(diào)則使腸道菌群結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和豐度有所降低，改變腸道菌群代謝產(chǎn)物，促進(jìn)疾病的形成[6]。肝臟是外源化合物和微生物產(chǎn)物通過腸道后接觸到的第一個(gè)可以產(chǎn)生免疫應(yīng)答的器官，腸道菌群的結(jié)構(gòu)以及腸道微生物產(chǎn)物的組成對(duì)肝臟代謝的正常運(yùn)行有著非常重要的影響[7]。近年來，越來越多的研究表明，NAFLD的形成跟腸道菌群失調(diào)有著密切的聯(lián)系[8]，因而調(diào)節(jié)腸道微生物已成為緩解NAFLD的重要方式。

乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)能夠緩解高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD的疾病癥狀(高血脂、高血糖以及肝損傷癥狀等)[9]。目前的研究主要集中在分析菌株對(duì)NAFLD癥狀的影響，對(duì)于菌株緩解NAFLD途徑尚無定論[10]。本文旨在研究LAB干預(yù)NAFLD后腸道中短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids，SCFAs)的變化、腸道菌群變化以及腸道內(nèi)變化與NAFLD癥狀的相關(guān)性，以期發(fā)現(xiàn)菌株在腸道內(nèi)緩解NAFLD的途徑，為后期的研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高脂高膽固醇飲食(high-gat and high-cholesterol diet，HFHCD)(能量為19.67 kJ/g，蛋白質(zhì)、脂肪和碳水化合物所提供的能量分別占總能量的16%、42%和43%)，低脂低糖飼料(能量為16.74 kJ/g，其中蛋白質(zhì)、脂肪和碳水化合物所提供的能量分別占總能量的20%、12%和68%)，南通特洛菲有限公司。色譜純乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸，中國(guó)國(guó)藥試劑公司；糞便DNA快速提取試劑盒，MP biomedicals有限公司；膠回收試劑盒，倍沃醫(yī)學(xué)科技有限公司；甘油三酯(triglyceride，TG)檢測(cè)試劑盒、總膽固醇(total cholestenone,TC)檢測(cè)試劑盒以及蛋白定量試劑盒，南京建成生物技術(shù)公司；蘇木精-伊紅(hematoxylin,HE)染色液套裝，南昌雨露實(shí)驗(yàn)器材有限公司；IL-6，IL-1β，TNF-α ELISA試劑盒，R&D有限公司；辛伐他汀片，美國(guó)默沙東有限公司；羅格列酮片，成都恒瑞制藥有限公司；胰島素檢測(cè)試劑盒，南京森貝伽生物科技有限公司；植物乳桿菌L1(FSDJN73M1)、兩歧雙歧桿菌B1(FJSWX26M9)和羅伊氏乳桿菌CCFM8631,均來源于江南大學(xué)食品生物技術(shù)中心菌種保藏庫(kù)。

1.2 儀器與設(shè)備

SX-300高溫高壓滅菌鍋，日本Tomy公司；BC-5000 Vet全自動(dòng)生化分析儀，深圳邁瑞醫(yī)療有限公司；氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀、多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)賽默飛世爾科技公司；手動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)，德國(guó)徠卡公司；數(shù)字切片掃描儀，匈牙利3DHISTCH公司；5804R高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)艾本德公司；恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；Illumina miseq pe300高通量測(cè)序儀，美國(guó)Illumina公司。

1.3 LAB懸浮液的制備

菌株的活化及擴(kuò)培參照司倩等[11]的方法進(jìn)行，菌體的收集與凍存參照朱廣素等[12]的方法進(jìn)行。臨用前，加入9倍體積的無菌蒸餾水重懸菌株，即菌株濃度稀釋為5.0×109CFU/mL。

1.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

42只4周齡雄性SPF級(jí)C57BL/6J小鼠購(gòu)買于上海斯萊克，飼養(yǎng)在SPF級(jí)12 h明暗交替的恒溫恒濕環(huán)境中，溫度為(23±3) ℃，濕度為(55±15)%。適應(yīng)喂養(yǎng)1周后，按表1隨機(jī)分成7組，每組各6只，并做相應(yīng)處理23周。每周稱體重、換水1次，飼料每2天換1次且稱重。在23周時(shí)，收取小鼠糞便凍存于-80 ℃冰箱，禁食不禁水12 h后，稱取小鼠體重，注射50 mg/(kg·bw) 10 g/L戊巴比妥鈉溶液進(jìn)行麻醉，采血取樣。

表1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案Table 1 The animal experiment design

注：3%蔗糖溶液為質(zhì)量分?jǐn)?shù)

1.5 血清中生化指標(biāo)的測(cè)定

血清中的TG、TC、高密度脂蛋白膽固醇(high density liptein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density liptein cholesterol，LDL-C)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotrasferase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、膽堿酯酶(cholinesterase，CHE)以及葡萄糖(glucose，GLU)水平用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。

1.6 肝臟中的細(xì)胞因子

肝臟中的白介素-1β(IL-1β)，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，白介素-6(IL-6)的含量用ELISA試劑盒測(cè)定，結(jié)果用蛋白水平進(jìn)行校準(zhǔn)。

1.7 肝臟組織病理分析

肝臟切片的制作及觀察按前人所述操作[11]，肝臟評(píng)分采用SAF評(píng)分系統(tǒng)，根據(jù)BEDOSSA等[13]的方法進(jìn)行。

1.8 結(jié)腸中的SCFAs分析

糞便中SCFAs的提取及分析操作參照WANG等[14]的方法進(jìn)行。

1.9 腸道宏基因組

用MP biomedicals DNA快速提取試劑盒提取糞便中的DNA，16S rDNA測(cè)序及分析按照WANG等[15]的方法進(jìn)行。

1.10 統(tǒng)計(jì)與繪圖

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS進(jìn)行單因素方差分析及相關(guān)性分析。采用Graphpad Prism6、TBtools作圖。LEfSe分析在http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/上完成。所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表示為Mean±SD。

2 結(jié)果與分析

2.1 CCFM8631的攝入減少NAFLD小鼠體重增量

肥胖是NAFLD的重要危險(xiǎn)因素，一般表現(xiàn)為體重增量和白色脂肪指數(shù)增加。不同干預(yù)對(duì)NAFLD小鼠體重增量和白色脂肪指數(shù)的影響結(jié)果如圖1所示。HFHC組的體重增量和白色脂肪指數(shù)顯著高于NC組，與HFHC組相比，藥物和LAB的干預(yù)均能顯著降低HFHCD喂養(yǎng)小鼠的體重增量。此外，羅格列酮和CCFM8631的干預(yù)還能夠顯著緩解HFHCD誘導(dǎo)的白色脂肪指數(shù)上升。雖然L1和B1也能夠顯著減少小鼠的體重增量，但對(duì)白色脂肪指數(shù)的控制無顯著效果。由此可知，羅格列酮和CCFM8631對(duì)肥胖的進(jìn)程具有阻礙作用，與朱廣素等的研究結(jié)果一致[16]。

a-體重增量；b-白色脂肪指數(shù)圖1 不同干預(yù)對(duì)NAFLD小鼠體重水平的影響Fig.1 The effect of different treatment on body weight of NAFLD mice注：圖中不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2 CCFM8631的攝入能夠改善NAFLD小鼠的血脂代謝紊亂

不同組別的脂肪代謝水平如圖2所示。與NC組相比，HFHCD喂養(yǎng)23周的小鼠血清中的TC、HDL-C和LDL-C水平均顯著升高，血清TG水平無明顯差異。HFHCD導(dǎo)致肝臟TC和TG水平顯著升高。肝臟TG水平升高而血清TG水平保持穩(wěn)定，提示模型小鼠脂肪肝的形成。與HFHC組相比，3株LAB均顯著降低了肝臟中TC、TG的水平，但對(duì)血清中TC水平的影響并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這說明3株LAB均能有效地緩解小鼠肝臟中的脂質(zhì)堆積，但可能由于血清中TC水平受飼料的即時(shí)影響更大，因此在血清TC指標(biāo)上并無顯著差異。但從HDL-C和LDL-C水平來看，尤其是LDL-C的水平的恢復(fù)，CCFM8631的干預(yù)表現(xiàn)出了非常顯著的效果，L1和B1對(duì)血清LDL-C水平的影響并無顯著性差異。結(jié)合血清TC水平的變化，雖然3株LAB對(duì)血清TC的影響相對(duì)HFHC組均無顯著性差異，但從趨勢(shì)上看，CCFM8631對(duì)血清TC水平的升高具有相對(duì)明顯的緩解作用。這提示相比L1和B1，CCFM8631對(duì)HFHCD導(dǎo)致的TC水平的即時(shí)升高具有更為顯著的減緩作用?？赡苷怯捎贑CFM8631的攝入使得小鼠血清中TC水平更快下降，機(jī)體產(chǎn)生的LDL-C水平才會(huì)相應(yīng)的降低。以上結(jié)果表明，3株LAB均能夠阻止小鼠肝臟的脂肪堆積，但CCFM8631可能更傾向于在更短的時(shí)間內(nèi)降低血清中由HFHCD導(dǎo)致的高水平TC，可能跟羅伊氏乳桿菌菌株中的高活性膽鹽水解酶有關(guān)[17]。高活性的膽鹽水解酶有助于分解胃腸道中的結(jié)合態(tài)膽鹽，將其轉(zhuǎn)變成氨基酸和游離膽汁酸，游離膽汁酸能與TC共沉淀，以糞便的形式排出體外[18]。

a-血清TC；b-血清HDL-C；c-血清LDL-C；d-血清TG；e-肝臟TC；f-肝臟TG圖2 不同干預(yù)對(duì)NAFLD小鼠脂肪代謝的影響Fig.2 The effect of different treatment on lipid metabolism of NAFLD mice

2.3 CCFM8631的攝入能夠改善NAFLD小鼠的胰島素抵抗

小鼠空腹血糖、胰島素水平以及胰島素抵抗指數(shù)結(jié)果如圖3所示。與NC組相比，HFHCD喂養(yǎng)23周的小鼠空腹血糖水平顯著升高，胰島素水平顯著降低，胰島素抵抗指數(shù)升高，表明HFHCD喂養(yǎng)23周造成了小鼠血糖代謝紊亂。羅格列酮和辛伐他汀的攝入均顯著降低了小鼠的胰島素抵抗指數(shù)，但對(duì)小鼠的空腹胰島素水平?jīng)]有表現(xiàn)出顯著的恢復(fù)作用。此外，辛伐他汀還顯著下調(diào)了小鼠的空腹血糖水平。3株LAB中，CCFM8631和B1顯著恢復(fù)了小鼠的空腹胰島素水平并降低了空腹血糖，但只有CCFM8631對(duì)胰島素抵抗指數(shù)表現(xiàn)出了更為顯著的降低作用。

a-空腹血糖；b-空腹胰島素；c-胰島素抵抗指數(shù)圖3 不同干預(yù)對(duì)NAFLD小鼠胰島素抵抗的影響Fig.3 The effect of different treatment on insulin resistance of NAFLD mice

2.4 CCFM8631的攝入能夠緩解NAFLD小鼠的肝臟損傷

小鼠肝功能指標(biāo)如圖4所示。HFHCD喂養(yǎng)23周的小鼠肝臟指數(shù)顯著增加，同時(shí)血清中ALT、AST和CHE水平顯著升高。辛伐他汀顯著降低了血清中ALT和AST水平，但對(duì)肝臟指數(shù)和CHE水平未表現(xiàn)出顯著影響，羅格列酮表現(xiàn)出了強(qiáng)烈的肝損傷作用。羅格列酮的攝入導(dǎo)致ALT、AST以及肝臟指數(shù)的進(jìn)一步升高。與羅格列酮和辛伐他汀不同，LAB的干預(yù)在肝臟損傷上表現(xiàn)出了顯著的優(yōu)勢(shì)，尤其表現(xiàn)在AST水平的恢復(fù)上，3株LAB均表現(xiàn)出了顯著的緩解效果。而在這3株LAB中，CCFM8631表現(xiàn)出了更好的預(yù)防HFHCD導(dǎo)致肝臟損傷的能力，具體表現(xiàn)在對(duì)肝臟指數(shù)以及ALT水平的恢復(fù)能力上。而L1和B1能夠減緩肝臟線粒體的損傷，但對(duì)肝細(xì)胞損傷修復(fù)效果不明顯。

同樣，肝臟組織切片病理結(jié)果如圖4所示，與NC組相比，HFHC組的肝臟細(xì)胞排列松散且不規(guī)則，其中肝脂滴將細(xì)胞核擠向一側(cè)，形成大量中大型脂肪空泡，同時(shí)伴有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。另外，部分肝細(xì)胞發(fā)生了氣球樣病變。羅格列酮的干預(yù)促進(jìn)肝臟進(jìn)一步發(fā)生氣球樣病變，加重肝臟損傷程度。CCFM8631的干預(yù)改善了HFHCD喂養(yǎng)小鼠的肝臟病變程度，同時(shí)肝臟病理評(píng)分顯著低于HFHC組。

a-肝臟指數(shù)；b-ALT；c-AST；d-CHE；e-病理切片；f-肝臟病理評(píng)分圖4 不同干預(yù)對(duì)NAFLD小鼠肝臟損傷的影響Fig.4 The effect of different treatment on liver damage of NAFLD mice

2.5 CCFM8631的攝入降低NAFLD小鼠肝臟中炎癥因子的水平

不同干預(yù)對(duì)NAFLD小鼠肝臟炎癥水平的影響如圖5所示，與NC組相比，HFHC組的肝臟中的TNF-α，IL-6和IL-1β水平顯著增加。羅格列酮和辛伐他汀在TNF-α水平上表現(xiàn)出了下調(diào)作用。而3株LAB對(duì)TNF-α水平的影響比藥物更顯著。此外，CCFM8631還顯著地緩解了IL-6和IL-1β水平的上升，而另外2株菌只有B1在IL-1β上表現(xiàn)出了顯著的下調(diào)作用。

a-TNF-α；b-IL-6；c-IL-β圖5 不同干預(yù)對(duì)肝臟中促炎因子的影響Fig.5 The effect of different treatment on lipid metabolism of NAFLD mice

2.6 CCFM8631的攝入提高NAFLD小鼠糞便中SCFAs水平

SCFAs是腸道中的微生物代謝人體未消化吸收的碳水化合物所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。不同干預(yù)對(duì)NAFLD小鼠糞便中SCFAs含量的影響如圖6所示。HFHCD喂養(yǎng)23周后，小鼠腸道中的丙酸和異丁酸水平顯著降低，乙酸和丁酸水平無顯著差異。與HFHC組相比，羅格列酮和辛伐他汀均無法恢復(fù)下降的SCFAs水平，甚至?xí)M(jìn)一步降低乙酸的水平。相反，3株LAB的干預(yù)均能顯著提高4種SCFAs的濃度。據(jù)報(bào)道，口服乙酸鹽能夠抑制高脂飲食小鼠體重增加[19]；丙酸鹽能抑制脂肪合成中的幾種限速酶的轉(zhuǎn)錄以減少肝臟脂肪堆積[8]；丁酸鹽能夠促進(jìn)線粒體功能增加能量消耗[20]，此外還能夠促進(jìn)肝臟GLP-1受體表達(dá)阻礙NAFLD的進(jìn)程[19, 21]。3株LAB干預(yù)后，腸道中的SCFAs含量均有所提高，而對(duì)于NAFLD各癥狀的緩解效果表現(xiàn)卻不一致。很明顯，CCFM8631干預(yù)后，NAFLD小鼠的血脂血糖水平以及肝臟損傷程度均有所降低，體現(xiàn)出CCFM8631對(duì)NAFLD具有良好的緩解作用，而L1和B1并未表現(xiàn)出緩解作用，暗示除SCFAs以外，還存在著其他機(jī)制共同決定NAFLD的緩解。

a-丙酸；b-異丁酸；c-乙酸；d-丁酸圖6 不同干預(yù)對(duì)NAFLD小鼠糞便中SCFAs含量的影響Fig.6 The effect of different treatment on fecal SCFAs of NAFLD mice

2.7 CCFM8631的攝入對(duì)NAFLD小鼠腸道菌群的影響

NAFLD的發(fā)生伴隨著腸道菌群紊亂，在腸道菌群上的表現(xiàn)目前并無統(tǒng)一的結(jié)論，大多數(shù)研究表明高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD小鼠腸道中Firmicutes的豐度上升，Bacteroidetes的豐度下降[22-23]。Firmicutes與Bacteroidetes是人體腸道中的優(yōu)勢(shì)菌群之一，腸道菌群中Firmicutes豐度的增加有利于能量的吸收更容易導(dǎo)致機(jī)體肥胖，F(xiàn)irmicutes與Bacteroidetes比值的上升與肥胖密切相關(guān)[23]。不同干預(yù)條件對(duì)NAFLD小鼠腸道菌群門水平改變?nèi)鐖D7所示，與NC組相比，HFHC組的Firmicutes水平保持不變，但Bacteroidetes降低，即Firmicutes與Bacteroidetes的比值上升，Actinobacteria和Proteobacteria在腸道中的比例升高。羅格列酮和辛伐他汀進(jìn)一步提高了Firmicutes與Bacteroidetes的比值，同時(shí)降低了Actinobacteria的豐度，另外羅格列酮的攝入反而進(jìn)一步增加了Proteobacteria在腸道中的豐度。3株LAB的干預(yù)逆轉(zhuǎn)了Firmicutes與Bacteroidetes的比值升高的現(xiàn)象，但對(duì)其他微生物在門水平上的改變呈現(xiàn)出不同的結(jié)果。其中CCFM8631和B1的干預(yù)增加了腸道中Bifidobacterium所在的Actinobacteria的豐度，降低了Proteobacteria的豐度，L1的干預(yù)對(duì)腸道中Actinobacteria和Proteobacteria的豐度無影響。Proteobacteria是腸道穩(wěn)態(tài)失調(diào)的標(biāo)志物之一，其豐度的升高通常與宿主的代謝紊亂、炎癥反應(yīng)有關(guān)[24]。

a-Firmicutes;b-Bacteroidetes;c-Firmicutes/Bacterpidetes比值；d-Atinbacteria;e-Proteobateria;f-各門水平所占比例圖7 不同干預(yù)對(duì)門水平的影響Fig.7 The effect of different treatment on phylum level

如圖8所示，通過LDA Effect Size(LEfSe)分析(LDA=2)發(fā)現(xiàn)， HFHCD喂養(yǎng)23周導(dǎo)致小鼠腸道菌群發(fā)生顯著改變。如圖9所示，與NC組相比，HFHCD顯著增加了腸道菌群中的以下菌屬的豐度，Mucispirillum、Turicibacter、Dorea以及Allobaculum，同時(shí)顯著降低了Desulfovibrio的豐度。CCFM8631和B1的攝入顯著提高了小鼠腸道中的Bifidobacterium、Lactobacillus的豐度，L1的攝入顯著增加了小鼠腸道中的Akkermansia、Bacteroides以及Bilophila的豐度；另外，CCFM8631還顯著提高了小鼠腸道中Desulfovibrio的比例。3株LAB降低了小鼠腸道中的Mucispirillum、Turicibacter、SMB53以及Allobaculum的豐度。Bifidobacterium、Bacteroides、Lactobacillus以及Akkermansia對(duì)腸道菌群穩(wěn)態(tài)具有促進(jìn)作用，其豐度的增加在多種疾病的恢復(fù)中發(fā)揮著重要影響，越來越多研究表明這些菌能夠在腸道內(nèi)發(fā)揮有益的作用[25-26]。有研究表明，Turicibacter參與炎癥反應(yīng)[27]，糖尿病的減輕伴隨著Turicibacter豐度的降低[28]。同樣由于高脂飲食誘導(dǎo)的高血脂癥，隨著癥狀緩解也伴隨著Turicibacter豐度的降低[29]。MASANORI等將糖尿病小鼠和非糖尿病小鼠的腸道菌群對(duì)比后發(fā)現(xiàn)，SMB53在糖尿病小鼠的豐度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常小鼠[30]。另有研究表明，Allobaculum能夠產(chǎn)生氧化三甲胺(TMAO)[31]，而TMAO能夠通過抑制法尼醇X受體調(diào)節(jié)膽汁酸代謝促進(jìn)NAFLD[32]，Allobaculum豐度的升高可能促進(jìn)NAFLD[33]。這些結(jié)果進(jìn)一步表明3株LAB的干預(yù)升高了部分有益菌的豐度，降低了NAFLD小鼠腸道中部分條件致病菌的比例，這可能是保護(hù)肝臟損傷的機(jī)理之一。

圖8 基于LEfSe分析的腸道微生物菌群圖Fig.8 Cladogram of gut microbiota based on LEfSe analysis

a-Bifidobacterium; b-Mucispirillum; c-Turicibacter; d-Clostridium; e-SMB53; f-Dorea; g-Allobaculum; h-Akkermansia; i-Bacterodes; j-Bilophila; k-Dasulfovibrio; l-Lactobacillus圖9 不同干預(yù)對(duì)NAFLD小鼠腸道菌群屬水平的影響Fig.9 The effect of different treatment on genus level

2.8 CCFM8631的攝入對(duì)NAFLD小鼠影響的相關(guān)性分析

為了進(jìn)一步確定LAB對(duì)NAFLD實(shí)現(xiàn)干預(yù)的主要途徑，我們將所有指標(biāo)進(jìn)行可視化處理，結(jié)果如圖10所示，將腸道內(nèi)的因素與NAFLD病理相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如表2所示，將腸道菌群中有差異的OTU與短鏈脂肪酸水平進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如表3所示?？梢暬Y(jié)果顯示，所有組分為了2個(gè)大簇，NC、CCFM8631、L1和B1組位于同一簇，而RC、SC和HFHC組則位于另一簇，表明菌株干預(yù)組結(jié)果和NC組具有相似性，且與藥物干預(yù)組以及HFHC組具有差異。所有指標(biāo)聚成了3個(gè)大簇，Turicibacter、Clostridium、SMB53和Allobaculum與肝臟病理主要指標(biāo)(ALT、AST、肝臟TG和TNF-α等)聚集在同一大簇中，Clostridium同時(shí)與ALT、AST和肝臟指數(shù)聚集在一小簇，表明Turicibacter、Clostridium、SMB53、Allobaculum豐度的變化可能與肝臟病理形成相關(guān)。

圖10 各指標(biāo)可視化結(jié)果Fig.10 The visualization of indicators

相關(guān)性結(jié)果顯示，4種SCFAs水平與肝臟TG、AST、CHE、TNF-α呈中度負(fù)相關(guān)性(r>0.4)。與已有的研究結(jié)論一致，表明4種SCFAs產(chǎn)量的提升可能通過減緩炎癥進(jìn)一步延緩NAFLD的進(jìn)程。Bifidobacterium、Bacteroides和Bilophila與肝臟的TNF-α呈強(qiáng)負(fù)相關(guān)，Lactobacillus和Desulfovibrio與肝臟IL-6以及IL-1β水平呈中度負(fù)相關(guān)。有報(bào)道稱，脂肪肝患者血清炎癥因子與Bifidobacterium、Bacteroides和Lactobacillus呈負(fù)相關(guān)[34]，炎性疾病的緩解伴隨著Bifidobacterium和Lactobacillus豐度的增加[35]，提示Bifidobacterium、Bacteroides、Bilophila、Lactobacillus和Desulfovibrio可能參與炎癥反應(yīng)的負(fù)調(diào)控。Turicibacter、SMB53以及Allobaculum與促炎因子TNF-α、IL-6以及IL-1β呈中度正相關(guān)，表明Turicibacter、SMB53以及Allobaculum可能參與炎癥，與前人研究一致[27, 31]。肝硬化患者和NAFLD患者腸道菌群中Dorea豐度顯著高于健康人群[36-37]，Turicibacter和Dorea與肝臟TG、CHE呈中度正相關(guān)性，提示Turicibacter和Dorea可能促進(jìn)肝臟線粒體損傷，從而加重肝臟脂肪堆積。綜上所述，小鼠腸道中Turicibacter、SMB53、Allobaculum和Dorea的豐度增加可能促進(jìn)NAFLD的形成，Bifidobacterium、Bacteroides、Bilophila、Lactobacillus和Desulfovibrio的豐度增加可能阻礙NAFLD的形成，4種SCFAs水平的提高可能也是NAFLD緩解的因素之一。

表2 腸道內(nèi)影響因素與NAFLD主要指標(biāo)的相關(guān)性

注：*表示P≤0.05，**表示P≤0.01(下同)

表3 SCFAs與腸道菌群的相關(guān)性Table 3 Correlation between SCFAs and gut microbiota

腸道菌群中有差異的OTU與4種SCFAs的相關(guān)性結(jié)果顯示，乙酸、丙酸和異丁酸與Bifidobacterium、Bacteroides、Lactobacillus以及Bilophila呈中度正相關(guān)，因而Bifidobacterium、Bacteroides以及Bilophila的豐度與這3種SCFAs的產(chǎn)量有關(guān)。Turicibacter、SMB53、Allobaculum以及Clostridium與4種SCFAs呈強(qiáng)負(fù)相關(guān)，提示Turicibacter、SMB53、Allobaculum以及Clostridium可能與4種SCFAs的含量減少有關(guān)。CCFM8631的攝入顯著提高了腸道中4種SCFAs的含量，上調(diào)了Bifidobacterium、Lactobacillus和Desulfovibrio的豐度，降低了Mucispirillum、Turicibacter、SMB53以及Allobaculum的豐度，因而CCFM8631緩解NAFLD可能與降低條件致病菌的豐度以及通過調(diào)節(jié)腸道菌群影響腸道內(nèi)SCFAs的水平有關(guān)。然而L1和B1對(duì)NAFLD的緩解效果不佳，推測(cè)除以上調(diào)節(jié)方式外，CCFM8631可能還存在其他途徑共同參與了NAFLD的緩解。

3 結(jié)論

本研究通過對(duì)HFHCD小鼠灌胃3株LAB(CCFM8631、L1和B1)探究LAB對(duì)NAFLD形成的影響。其中CCFM8631具有相對(duì)最為良好的緩解NAFLD的能力。此外，CCFM8631的攝入顯著提高了腸道中4種SCFAs的含量，上調(diào)了Bifidobacterium、Lactobacillus和Desulfovibrio的豐度，降低了Mucispirillum、Turicibacter、SMB53以及Allobaculum的豐度。對(duì)腸道內(nèi)因素與病理指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析后發(fā)現(xiàn)，CCFM8631緩解NAFLD可能與降低條件致病菌的豐度以及通過調(diào)節(jié)腸道菌群影響腸道內(nèi)SCFAs的水平有關(guān)。該研究為腸道菌群與NAFLD發(fā)生之間的關(guān)系提供參考，同時(shí)為實(shí)現(xiàn)膳食干預(yù)NAFLD提供依據(jù)。