鄭雨星，朱慧越，焦婷，楊樹榮，劉倩，王剛，趙建新，張灝，陳衛(wèi)

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是一種易復(fù)發(fā)的胃腸道炎癥性疾病，目前其發(fā)病機(jī)制尚不清楚，研究顯示主要與遺傳因素，腸道屏障，免疫紊亂，腸道菌群以及環(huán)境因素有關(guān)[1]。IBD患者的腸道屏障受到破壞，主要表現(xiàn)為腸道黏液層變薄甚至消失；腸道緊密連接結(jié)構(gòu)損傷，腸道上皮組織(包括腸上皮細(xì)胞，杯狀細(xì)胞，神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞，潘氏細(xì)胞和M細(xì)胞)破壞；腸道固有層免疫細(xì)胞異常應(yīng)答并產(chǎn)生大量促炎癥細(xì)胞因子，導(dǎo)致腸黏膜炎癥反應(yīng)[1-3]。IBD患者的臨床表現(xiàn)主要是腹痛、腹瀉、便血和體重下降。目前常用的IBD治療藥物作用比較局限，且副作用較多[2]。

腸道菌群與宿主共同進(jìn)化形成復(fù)雜的互利共生關(guān)系，參與宿主許多的生理功能[3]。腸道穩(wěn)態(tài)的破壞與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，包括炎癥性腸病，抑郁癥，糖尿病等[3-5]。研究顯示，與健康人相比，IBD 患者腸道菌群的穩(wěn)定性降低，表現(xiàn)為腸道菌群多樣性和豐富度降低以及腸道菌群組成和結(jié)構(gòu)改變[3]。GOPHNA等[6]發(fā)現(xiàn)克羅恩病患者腸道中變形菌門和擬桿菌門數(shù)量顯著增加，梭狀芽孢桿菌豐度降低。研究顯示，IBD患者的糞便樣品中丁酸產(chǎn)生菌的數(shù)量顯著減少，炎癥反應(yīng)相關(guān)的菌群數(shù)量增加[7-8]。此外，腸道菌群對于IBD的影響還體現(xiàn)在參與宿主的代謝，ZELANTE等[9]發(fā)現(xiàn)腸道菌群參與宿主色氨酸代謝生成芳香烴受體激活配體并影響DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠的恢復(fù)。

短鏈脂肪酸(short chain fatty acids, SCFAs)是腸道菌群發(fā)酵膳食纖維產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，主要包括乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸和戊酸。研究顯示乙酸，丙酸和丁酸具有增強(qiáng)腸道屏障功能，改善腸黏膜損傷的作用，主要途徑包括通過識別腸上皮細(xì)胞膜受體GPR41、GPR43等激活下游的信號通路,增加Treg細(xì)胞增殖，抑制Th1細(xì)胞和Th17細(xì)胞分化，降低炎癥因子水平[10];激活核受體PPARγ, 抑制NF-κB信號通路, 減少促炎因子表達(dá)；通過激活轉(zhuǎn)錄因子(包括STAT3和SP1等)[11]誘導(dǎo)編碼緊密連接相關(guān)組件的基因促進(jìn)緊密連接蛋白表達(dá), 保持腸上皮完整；丁酸作為組蛋白去乙酰化酶抑制劑, 能夠抑制炎癥基因表達(dá), 增加抗菌肽分泌從而減少黏膜炎癥[12]。

鼠李糖乳桿菌作為益生菌的一種，安全性高且具有多種健康功能而被廣泛應(yīng)用于食品生產(chǎn)。已有大量的研究報(bào)道鼠李糖乳桿菌在緩解結(jié)腸炎上的益處[13-14]。本文選取了來自于2個(gè)不同地區(qū)(浙江臺州，內(nèi)蒙古二連浩特)，全基因組比對分析后處于進(jìn)化樹不同分支上親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的2株鼠李糖乳桿菌，探究其對于DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎的緩解效果及作用機(jī)制，以期為進(jìn)一步探究鼠李糖乳桿菌緩解結(jié)腸炎的研究打下基礎(chǔ)，為有益于健康的益生菌產(chǎn)品開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

鼠李糖乳桿菌FZJTZ46L6、FNMGEL5-1，均來源于江南大學(xué)食品生物技術(shù)中心菌種保藏庫。其中，菌株FZJTZ46L6，分離自浙江臺州人群糞便樣本，菌株FNMGEL5-1，分離自內(nèi)蒙古二連浩特人群糞便樣本。

1.2 試劑與儀器

葡聚糖硫酸鈉,美國MP Biomedicals；美沙拉嗪緩釋顆粒，上海愛的發(fā)制藥有限公司；糞便隱血試劑盒，珠海貝索生物技術(shù)有限公司；髓過氧化物酶檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所；TNF-α，IL-1β，IL-6，IFN-γ酶聯(lián)免疫試劑盒，美國R&D Systems公司； HiFiScript gDNA Removal cDNA Synthesis Kit，康為世紀(jì)生物科技有限公司；PCR 擴(kuò)增引物以及合成序列，上海生工生物工程有限公司; 糞便DNA快速提取試劑盒，美國MP biomedicals有限公司；膠回收試劑盒，倍沃醫(yī)學(xué)科技有限公司。

HWS-80隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；GCMS-QP2010單四級桿氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，島津公司；CFX ConnectTMReal-time System實(shí)時(shí)熒光定量基因擴(kuò)增儀，伯樂公司；Pannoramic MIDI 數(shù)字切片掃描儀，匈牙利3DHistech；Illumina miseq pe300高通量測序儀，Illumina公司。

1.3 菌株活化和培養(yǎng)

用接種環(huán)蘸取少量鼠李糖乳桿菌凍存菌液,在MRS固體平板上劃線并置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h。挑取單菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)15 h，接著以2%體積分?jǐn)?shù)接種量擴(kuò)增培養(yǎng)18 h后，以5 000 r/min轉(zhuǎn)速在4 ℃下離心 5 min收集菌體，用無菌的 PBS 洗 3 次后用300 g/L蔗糖溶液重懸菌體凍存于-80 ℃。

1.4 動物試驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)動物為4周齡SPF級健康雄性C57BL/6J 小鼠，購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司，動物倫理審查編號為JN.No20190430c0900605[101]，飼養(yǎng)于(23±2)℃，相對濕度(50±10)%，12 h光照12 h黑夜交替的屏障環(huán)境內(nèi)。30只小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、藥物組、鼠李糖乳桿菌FZJTZ46L6，鼠李糖乳桿菌FNMGEL5-1共5組，每組6只。適應(yīng)飼養(yǎng)1周，適應(yīng)期內(nèi)所有組均給予正常飲水與飼料。從第2周開始，空白組、模型組每日灌胃30 g/L蔗糖溶液0.2 mL，藥物組每日灌胃含美沙拉嗪(給藥劑量300 mg/kg)的30g/L蔗糖溶液0.2 mL，實(shí)驗(yàn)組每日灌胃1×109CFU鼠李糖乳桿菌的3%蔗糖溶液0.2 mL，持續(xù)27 d。第29天，在小鼠飲水中添加 25 g/L DSS，連續(xù)飼喂7 d誘導(dǎo)小鼠急性結(jié)腸炎。動物試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 動物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案Table 1 Animal experimental design

1.5 試驗(yàn)指標(biāo)測定

1.5.1 體重變化和疾病活動指數(shù)計(jì)算

造模期間，每天定時(shí)稱量小鼠體重并計(jì)算其變化的百分比。此外，每日觀察小鼠的糞便性狀，根據(jù)BERBERAT等[15]的方將其分為3個(gè)等級： 第一， 正常小鼠的糞便成型， 且為顆粒狀； 第二，糞便黏度增加且易散，但不黏附于肛門則為“松散”；第三，糞便呈稀水樣或不成形且黏附于肛門，即為“稀便”。同時(shí)，使用匹拉米洞法測定小鼠糞便隱血情況，若小鼠糞便含有肉眼可見的紅褐色或鮮紅色血液，則判定為肉眼便血。最后，根據(jù) BERBERAT等[15]的評分標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算得出小鼠的疾病活動指數(shù)(disease activity index，DAI)，具體評分項(xiàng)目得分如表2所示。

表2 動物疾病活動指數(shù)評分系統(tǒng)Table 2 Scoring standard of the disease activity index

1.5.2 結(jié)腸HE染色及組織損傷評分

小鼠結(jié)腸石蠟切片和HE染色參考王俊通[7]的方法。使用Pannoramic MIDI 數(shù)字切片掃描儀對HE染色切片進(jìn)行掃描拍照，所得照片從腸黏膜上皮病變、腸隱窩損害、炎癥浸潤和纖維組織增生4個(gè)方面進(jìn)行組織損傷評分。

1.5.3 結(jié)腸組織髓過氧化物酶活性測定

按照MPO試劑盒說明書測定小鼠結(jié)腸中的髓過氧化物酶活性。

1.5.4 小鼠結(jié)腸中細(xì)胞因子含量測定

根據(jù)ELISA試劑盒說明書測定小鼠結(jié)腸組織中的細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ的含量。

1.5.5 RT-QPCR測定結(jié)腸緊密連接相關(guān)蛋白基因表達(dá)水平

在PrimerBank上查找得到小鼠4種緊密連接相關(guān)蛋白Claudin-3、ZO-1、ZO-2和Occludin和GAPDH基因的引物序列，由上海生工有限公司合成引物，序列如表3所示。

根據(jù)王俊通[7]的方法提取小鼠結(jié)腸RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA并進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。QPCR的反應(yīng)體系為5 μL SYBR Green Supermix，3 μL去離子水，0.5 μL上游引物(10 μmol/L)，0.5 μL下游引物(10 μmol/L)和1 μL的cDNA模板(100 ng/μL)。QPCR運(yùn)行程序設(shè)定為94 ℃,2 min，(94 ℃，30 s；61 ℃，30 s；72 ℃,20 s)39個(gè)循環(huán)。確保擴(kuò)增產(chǎn)物溶解曲線為單峰，且CT值均在可信范圍之內(nèi)，陰性對照NTC無擴(kuò)增。

表3 引物序列Table 3 Primer sequence

1.5.6 小鼠糞便中短鏈脂肪酸含量測定

根據(jù)毛丙永[16]的方法利用島津單四級桿氣質(zhì)聯(lián)用儀測定小鼠凍干糞便中的短鏈脂肪酸含量。

1.5.7 小鼠腸道16S rDNA宏基因組測序

收集小鼠解剖前1天的糞便，用DNA快速提取試劑盒按說明書方法步驟提取糞便中的DNA，參照文獻(xiàn)[17]的研究方法對樣本16S rDNA的V3～V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用膠回收試劑盒對擴(kuò)增片段進(jìn)行純化回收，在Illumina miseq pe300平臺進(jìn)行高通量測序，采用 QIIME2分析平臺對擴(kuò)增子進(jìn)行分析。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”(Means±S.D.)，使用 GraphPad Prism 5繪圖。應(yīng)用 SPSS 軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)或者 t 檢驗(yàn)(student’s t-tests)分析進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，采用pearson方法進(jìn)行相關(guān)性分析，PCA分析在網(wǎng)站https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/home.xhtml完成。LEfSe分析在網(wǎng)站http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 鼠李糖乳桿菌改善結(jié)腸炎小鼠腸道黏膜損傷

本文采用DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎并通過測定造模期間小鼠的體重變化，疾病活動指數(shù)，小鼠結(jié)腸病理評分以及小鼠結(jié)腸髓過氧化物酶活性來評估2株鼠李糖乳桿菌對于小鼠腸道損傷的改善作用。造模期間，模型組小鼠出現(xiàn)明顯的便血，糞便松散并從第5天開始體重顯著下降(圖1)。與模型組相比，鼠李糖乳桿菌FZJTZ46L6和FNMGEL5-1均能顯著減少DSS引起的體重下降并改善糞便性狀，降低DAI值，且效果優(yōu)于300 mg/kg的藥物美沙拉嗪(圖1，表4)。

通過HE染色對小鼠結(jié)腸病理進(jìn)行觀察并評分，由圖2可知空白組小鼠結(jié)腸形態(tài)良好，腸上皮完整，隱窩結(jié)構(gòu)完整，排列有序且含有大量的杯狀細(xì)胞，沒有發(fā)現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤；模型組小鼠結(jié)腸可見大量黏膜上皮細(xì)胞變性、壞死，杯狀細(xì)胞數(shù)量明顯減少和腸隱窩損傷，炎細(xì)胞浸潤及纖維組織增生等病理變化，其結(jié)腸組織損傷評分顯著高于空白對照組；鼠李糖乳桿菌FZJTZ46L6能夠顯著減少上述組織病變，除極個(gè)別隱窩結(jié)構(gòu)損壞，其結(jié)腸結(jié)構(gòu)與正常組相似，組織損傷評分顯著低于模型組；陽性對照藥物美沙拉嗪也較好地保護(hù)了結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)，但仍可見部分上皮結(jié)構(gòu)和隱窩結(jié)構(gòu)損壞以及炎癥浸潤。而鼠李糖乳桿菌FNMGEL5-1對結(jié)腸黏膜病理損傷沒有顯著改善效果，可見與模型組類似程度的隱窩結(jié)構(gòu)破壞和炎癥侵潤。

圖1 DSS造模期間小鼠體重變化Fig.1 Changes of mice body weight during DSS treatment注： *表示P < 0.05(下同)

髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)富含于中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞中，在受到外界刺激時(shí)，中性粒細(xì)胞嗜天青顆粒釋放MPO并造成炎癥損傷[18]。腸道炎癥反應(yīng)是結(jié)腸炎的病理基礎(chǔ)，而中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的吞噬作用是炎癥反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)[19]。故MPO活性可作為以中性粒細(xì)胞為主的炎癥浸潤指標(biāo)并作為評價(jià)結(jié)腸炎炎癥嚴(yán)重程度的指標(biāo)[19-20]。由圖3可知，造模組的MPO值顯著高于空白組，而鼠李糖乳桿菌FZJTZ46L6組的MPO值幾乎回到了正常水平，表明菌株FZJTZ46L6能夠顯著減輕結(jié)腸炎癥浸潤。而藥物干預(yù)和菌株FNMGEL5-1均不能抑制DSS引起的MPO升高，可見美沙拉嗪和FNMGEL5-1不能減輕結(jié)腸炎癥細(xì)胞浸潤。該結(jié)果與病理結(jié)果相一致，表明鼠李糖乳桿菌FZJTZ46L6可以通過減少中性粒細(xì)胞的數(shù)量，減輕炎癥反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對小鼠結(jié)腸炎的緩解作用。

表4 小鼠造模期間疾病活動指數(shù)Table 4 Disease activity index during DSS treatment

注：表中同一列標(biāo)注相同小寫字母表示不同組間無顯著差異，否則具有顯著差異(P<0.05)(下同)

a-空白組；b-藥物組；c-模型組；d-FZJTZ46L6；e-FNMGEL5-1；f-結(jié)腸病歷組織評價(jià)圖2 小鼠結(jié)腸HE染色和組織損傷評分Fig.2 HE staining and histological score of mice colon注：柱形圖中標(biāo)注相同字母表示不同組間無顯著差異，否則具有顯著差異(P<0.05)(下同)

圖3 小鼠結(jié)腸MPO值Fig.3 MPO activity of mice colon

2.2 鼠李糖乳桿菌降低小鼠結(jié)腸中促炎細(xì)胞因子含量

大量研究表明，結(jié)腸中TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ等細(xì)胞因子的含量與結(jié)腸炎的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[14, 21-27]。本文測定了小鼠結(jié)腸中TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ的含量，結(jié)果顯示，與對照組相比模型組小鼠結(jié)腸中促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ含量顯著增高,尤其是TNF-α和IL-6的水平顯著增高；與模型組相比，鼠李糖乳桿菌FZJTZ46L6和FNMGEL5-1顯著降低了結(jié)腸中TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ的含量，且效果優(yōu)于藥物美沙拉嗪(圖4)。研究顯示，TNF-α與結(jié)腸炎的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，且IBD患者的IL-6含量可見顯著增高[21-23]，這與本文的研究結(jié)果一致。說明DSS造模后小鼠體內(nèi)促炎因子含量顯著上升，鼠李糖乳桿菌能夠通過降低結(jié)腸中的促炎因子含量減少結(jié)腸炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生。

a-小鼠結(jié)腸組織TNF-α含量;b-小鼠結(jié)腸組織IL-1β含量;c-小鼠結(jié)腸組織IL-6含量;d-小鼠結(jié)腸組織IFN-γ含量圖4 小鼠結(jié)腸細(xì)胞因子含量Fig.4 Content of cytokines in mice colon

2.3 鼠李糖乳桿菌提高結(jié)腸緊密連接蛋白基因轉(zhuǎn)錄水平

腸道上皮細(xì)胞間的緊密連接相關(guān)蛋白在維持腸上皮結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，發(fā)揮腸道屏障功能中起到重要的作用[28-30]。本文測定了小鼠結(jié)腸中4種主要緊密連接蛋白Claudin-3、ZO-1、ZO-2和Occludin的基因表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組小鼠4種緊密連接蛋白轉(zhuǎn)錄水平均發(fā)生了顯著下調(diào)，提示DSS造成了腸上皮緊密連接結(jié)構(gòu)的破壞，而本文所用的2株鼠李糖乳桿菌均能在一定程度上提高結(jié)腸緊密連接蛋白Claudin-3、ZO-1、ZO-2和Occludin的轉(zhuǎn)錄水平(圖5)，提示鼠李糖乳桿菌FZJTZ46L6和FNMGEL5-1可能通過上調(diào)緊密連接蛋白Claudin-3、ZO-1、ZO-2和Occludin的表達(dá)，從而增強(qiáng)腸道緊密連接，提高腸道屏障功能。

2.4 鼠李糖乳桿菌提高小鼠糞便中短鏈脂肪酸含量

短鏈脂肪酸是腸道菌群的代謝產(chǎn)物，能夠?yàn)榻Y(jié)腸細(xì)胞提供能量，調(diào)節(jié)腸腔內(nèi)的pH值，參與宿主免疫調(diào)節(jié)并增強(qiáng)腸道屏障作用[24]。研究顯示，IBD患者中短鏈脂肪酸含量顯著減少[25]，施用短鏈脂肪酸合成酶混合物顯著改善結(jié)腸炎癥和疾病活動指數(shù)得分并抑制促炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)。在本文中，與空白組相比，模型組小鼠糞便中短鏈脂肪酸總量顯著減少，尤其是丁酸含量顯著減少；與模型組相比，菌株FZJTZ46L6顯著提高了小鼠糞便中短鏈脂肪酸的含量，包括乙酸、丙酸、丁酸、異戊酸和戊酸；而菌株FNMGEL5-1雖然能在一定程度上提高小鼠糞便中短鏈脂肪酸含量，但是沒有顯著差異(表5)。該結(jié)果與病理結(jié)果基本一致，提示FZJTZ46L6對于小鼠結(jié)腸損傷的改善作用與其提高短鏈脂肪酸含量密切相關(guān)。

圖5 小鼠結(jié)腸緊密連接蛋白基因相對轉(zhuǎn)錄水平Fig.5 mRNA transcription levels of tight junction proteins in mice colon注：**表示P < 0.01

表5 小鼠糞便中短鏈脂肪酸含量 單位：pmol/mg

2.5 鼠李糖乳桿菌調(diào)節(jié)小鼠腸道菌群

大量研究顯示IBD患者腸道菌群表現(xiàn)為多樣性降低，菌群組成和結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致腸道菌群穩(wěn)態(tài)受到破壞[21,26-27]。在本研究中，與空白組相比，模型組小鼠Shannon指數(shù)顯著降低，說明DSS結(jié)腸炎小鼠腸道菌群多樣性顯著降低。FZJTZ46L6和FNMGEL5-1顯著抑制了DSS引起的Shannon指數(shù)降低，提高群落多樣性(圖6)。此外，beta多樣性分析顯示，DSS造模后小鼠腸道菌群群落構(gòu)成與空白組形成明顯差異，而FZJTZ46L6和FNMGEL5-1均能在一定程度上減少這種差異(圖7)從而維護(hù)腸道菌群結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。腸道菌群主要由厚壁菌門，擬桿菌門，放線菌門和變形菌門四大類組成[28]，如圖8-a所示，DSS結(jié)腸炎小鼠的腸道菌群組成發(fā)生了顯著變化。與空白組相比，模型組小鼠中的厚壁菌門(Firmicutes)豐度顯著降低，而擬桿菌門(Bacteroidetes)豐度顯著升高，即厚壁菌門/擬桿菌門(F/B)的比值下降(圖8-b)，而F/B比率被作為評估病理狀態(tài)的生物標(biāo)志物[28]。Bacteroidetes擁有的參與脂類和碳水化合物代謝的酶基因比Firmicutes要少[29]，因此這也可能是造成小鼠體重下降的原因。此外，DSS造模后引起了變形菌門(Proteobacteria)豐度的顯著上升(圖8-b)，表明DSS處理造成了小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)失調(diào)。據(jù)報(bào)道，Proteobacteria等革蘭氏陰性菌的LPS與宿主炎癥有關(guān)[8]。鼠李糖乳桿菌FZJTZ46L6和FNMGEL5-1干預(yù)后在一定程度上降低了擬桿菌門的豐度并增加厚壁菌門的豐度，從而減輕厚壁菌門/擬桿菌門的比例失調(diào)，改善菌群結(jié)構(gòu)失衡。

圖6 腸道菌群α多樣性分析Fig.6 α diversity of gut microbiota

圖7 腸道菌群beta多樣性分析Fig.7 Beta-diversity of gut microbiota

進(jìn)一步對腸道菌群進(jìn)行分析，利用LEfSe分析找到不同分組間豐度顯著差異的物種，進(jìn)化樹分支圖(圖9)顯示了在不同分組間具有重要影響的標(biāo)記物種，找出其中具有顯著差異的菌屬進(jìn)一步分析，結(jié)果顯示DSS造模后除了顯著增加Bacteroides(擬桿菌屬)豐度外，還提高了與炎癥反應(yīng)相關(guān)的菌屬Fusobacterium豐度，而Coprococcus(糞球菌屬)和Oscillospira(顫螺菌屬)豐度顯著降低，其中Coprococcus是丁酸和丙酸的主要產(chǎn)生菌屬，Oscillospira與健康相關(guān)，并在炎癥人群腸道內(nèi)豐度減少。與模型組相比，F(xiàn)ZJTZ46L6和FNMGEL5-1干預(yù)后提高了Coprococcus和Oscillospira的豐度。值得注意的是FNMGEL5-1顯著提高了Dorea和Mucispirillum的豐度(圖10)。研究顯示[30]，Dorea在DSS結(jié)腸炎小鼠中豐度顯著增加，而Mucispirillum是一種黏液層共生菌，在宿主產(chǎn)生炎癥時(shí)Mucispirillum數(shù)量增加，并在一定條件下誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生IgG反應(yīng)，故被認(rèn)為是導(dǎo)致疾病產(chǎn)生的病原體[10]?？梢奆NMGEL5-1雖然提高了腸道菌群的多樣性并減輕腸道菌群失調(diào)，但是顯著增加了有害菌屬Dorea和Mucispirillum的豐度，這很可能是其無法改善結(jié)腸黏膜損傷的原因之一。上述結(jié)果表明，DSS處理后使腸道中有害菌的數(shù)量增加，同時(shí)減少有益菌的數(shù)量，而鼠李糖乳桿菌FZJTZ46L6干預(yù)后緩解了這種情況。

a-門水平群落結(jié)構(gòu)分析;b-Bacteroidetes差異性分析；c-Proteobacteria差異性分析；d-Acidobacteria差異性分析；e-Firmicutes差異性分析圖8 鼠李糖乳桿菌對小鼠腸道菌群門水平的影響Fig.8 Effects of Lactobacillus rhamnosus on the Phylum level of microbiota in mice

圖9 LEFSE分析Fig.9 LEFSE analysis

a-Adlercreutzia;b-Bacterodes;c-Bifiobacterium;d-Coprococcus;e-Dorea;f-Fusobaterium;g-mucispirillum;h-Oscillospira;i-Strptococcus圖10 腸道菌群屬水平差異性分析Fig.10 Genus-level changes in the faecal microbiota

2.6 糞球菌屬和短鏈脂肪酸緩解結(jié)腸炎的相關(guān)性分析

乙酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽能夠經(jīng)由轉(zhuǎn)運(yùn)受體MCT1, SMCT1等被結(jié)腸細(xì)胞吸收并通過細(xì)胞表面G蛋白偶聯(lián)受體參與一系列免疫級聯(lián)反應(yīng)中，降低促炎因子TNF-α、IL-6，IL-12、IFN-γ的產(chǎn)生，增加抑炎因子IL-10水平，從而減少炎癥反應(yīng)，維護(hù)腸道屏障功能[28]。此外，研究顯示[8, 10, 29-30]，IBD患者腸道中Coprococcus數(shù)量顯著減少。說明鼠李糖乳桿菌FZJTZ-46L6對于結(jié)腸炎的緩解作用可能主要是通過影響腸道短鏈脂肪酸產(chǎn)生菌的豐度并增加腸道短鏈脂肪酸的產(chǎn)量。為進(jìn)一步確定產(chǎn)短鏈脂肪酸菌屬Coprococcus和短鏈脂肪酸在FZJTZ46L6緩解結(jié)腸炎中的重要作用，本文利用SPSS做了pearson相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，Coprococcus與小鼠體重呈極顯著的正相關(guān)且與DAI評分呈極顯著的負(fù)相關(guān)，此外，Coprococcus與結(jié)腸病理評分、TNF-α以及IL-6的含量也呈強(qiáng)相關(guān)性，說明鼠李糖乳桿菌對于Coprococcus豐度的影響與其緩解結(jié)腸炎疾病癥狀，改善結(jié)腸黏膜損傷和調(diào)節(jié)腸道免疫反應(yīng)密切相關(guān)。丁酸與結(jié)腸IL-6含量呈顯著負(fù)相關(guān)，且與結(jié)腸炎各項(xiàng)疾病指標(biāo)都有強(qiáng)相關(guān)性；乙酸和丙酸均與促炎因子IL-1β、IFN-γ呈顯著負(fù)相關(guān)，此外丙酸與緊密連接蛋白Claudin-3表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)；值得注意的是，整體上6種短鏈脂肪酸與結(jié)腸促炎因子含量表現(xiàn)出明顯的負(fù)相關(guān)性，與結(jié)腸緊密連接相關(guān)蛋白基因表達(dá)水平呈明顯正相關(guān)，說明短鏈脂肪酸與鼠李糖乳桿菌修復(fù)腸道緊密連接和降低促炎因子水平密切相關(guān)。綜上，鼠李糖乳桿菌FZJTZ46L6極可能是通過提高腸道短鏈脂肪酸產(chǎn)生菌的豐度并增加腸道短鏈脂肪酸的含量從而抑制促炎因子產(chǎn)生，上調(diào)緊密連接蛋白表達(dá)水平達(dá)到緩解結(jié)腸炎的效果。

表5 糞球菌屬和短鏈脂肪酸與結(jié)腸炎疾病指標(biāo)的相關(guān)性分析Table 5 Correlation analysis of coprococcus and scfas with disease indexes of colitis

注：*表示P< 0.05,**表示P<0.01

3 結(jié)論

本文使用的2株鼠李糖乳桿菌均能在不同程度上緩解小鼠結(jié)腸炎，但2株菌對于結(jié)腸炎的緩解效果具有明顯差異。鼠李糖乳桿菌FZJTZ46L6的效果優(yōu)于FNMGEL5-1，F(xiàn)ZJTZ46L6不僅顯著抑制了小鼠在DSS造模期間的體重下降，改善糞便性狀和便血情況，還顯著改善了DSS引起的小鼠結(jié)腸黏膜損傷，而FNMGEL5-1雖然在一定程度上緩解了DSS引起的疾病癥狀，但是對于結(jié)腸炎癥浸潤和病理損傷沒有改善作用。本研究中，鼠李糖乳桿菌FZJTZ46L6緩解結(jié)腸炎的途徑主要體現(xiàn)在以下4個(gè)方面：(1)提高腸道菌群多樣性，增加菌群結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性；(2)提升短鏈脂肪酸產(chǎn)生菌屬豐度，提高短鏈脂肪酸水平；(3)增強(qiáng)腸道緊密連接蛋白轉(zhuǎn)錄水平；(4)降低促炎因子水平，減少炎癥反應(yīng)。相比于FNMGEL5-1，菌株FZJTZ46L6能夠更大程度地降低促炎因子IL-1β、IL-6和IFN-γ的含量，且顯著增加糞便中短鏈脂肪酸含量，尤其是乙酸、丙酸和丁酸的含量；而FNMGEL5-1雖然也提高了短鏈脂肪酸產(chǎn)生菌Coprococcus的豐度，并在一定程度上增加糞便中總的短鏈脂肪酸含量，但是并不能顯著提高乙酸，丙酸和丁酸的含量，此外FNMGEL5-1還增加了有害菌屬Dorea和Mucispirillum的豐度。通過進(jìn)一步的相關(guān)性分析，結(jié)果顯示Coprococcus與改善結(jié)腸損傷，緩解結(jié)腸炎癥狀以及降低促炎因子水平顯著相關(guān)；短鏈脂肪酸水平的提高與促炎因子含量的降低及緊密連接蛋白轉(zhuǎn)錄水平的增加強(qiáng)相關(guān)，表明Coprococcus和短鏈脂肪酸在緩解結(jié)腸炎中的重要作用?？梢奆ZJTZ46L6與FNMGEL5-1對于小鼠結(jié)腸炎的緩解效果差異主要與腸道菌群變化、短鏈脂肪酸含量和免疫調(diào)節(jié)相關(guān)，且最關(guān)鍵的是能否通過提高短鏈脂肪酸產(chǎn)生菌屬豐度進(jìn)一步提高腸道內(nèi)短鏈脂肪酸含量。綜上所述，說明鼠李糖乳桿菌緩解結(jié)腸炎的效果存在個(gè)體差異，且鼠李糖乳桿菌FZJTZ46L6對于結(jié)腸炎的改善效果主要與其提高腸道短鏈脂肪酸產(chǎn)生菌豐度，增加短鏈脂肪酸含量有關(guān)。