謝錦明,趙秀芳,袁江蘭,康旭
(湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院,湖北 武漢,430068)
中國是食醋釀造大國,有幾千年的釀醋歷史。傳統(tǒng)的食醋發(fā)酵工藝為固態(tài)發(fā)酵[1],但隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展,液態(tài)深層發(fā)酵法因生產(chǎn)周期短、產(chǎn)品穩(wěn)定、產(chǎn)量高、成本低等優(yōu)點(diǎn)[2-3]受到眾多食醋企業(yè)的青睞[4]。醋酸菌菌種是影響液態(tài)深層發(fā)酵醋品質(zhì)的主要因素[5],目前中國釀醋工業(yè)常用的醋酸菌為巴氏醋酸桿菌(Acetobacterpasteurianus),如 AS1.41和滬釀1.01[6],但是它們的產(chǎn)酸能力不高且條件耐受性不強(qiáng),影響了液態(tài)深層發(fā)酵醋的品質(zhì)[7]。因此,篩選產(chǎn)酸能力強(qiáng)且條件耐受性好的醋酸菌,對促進(jìn)我國食醋產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義[8]。
從中國民間或工業(yè)醋醅中篩選優(yōu)良醋酸菌,是當(dāng)前研究熱點(diǎn)之一[9],近年來,關(guān)于這方面的研究報(bào)道較多。劉陽[10]等從保寧醋曲篩選出1株產(chǎn)酸量為54.28 g/L、乙醇和乙酸耐受性較好的醋酸桿菌。CHEN等[11]從工業(yè)醋醅中篩選出1株產(chǎn)酸量高達(dá)61.2 g/L的巴氏醋酸桿菌,并且可以耐受體積分?jǐn)?shù)為12%的乙醇和42 ℃的高溫,具有潛在應(yīng)用價(jià)值。
中國陜西民間有釀醋的習(xí)俗,因此民間醋醅資源豐富,是篩選醋酸菌的良好來源,但這方面鮮有研究報(bào)道。本研究采集到一種評價(jià)良好的陜西民間醋醅,通過初篩和復(fù)篩從中篩選高產(chǎn)酸醋酸菌,并與應(yīng)用廣泛的醋酸菌菌種AS1.41進(jìn)行深層發(fā)酵特性比較,然后將比較得到的最優(yōu)菌株進(jìn)行16S rDNA同源序列分析鑒定。本研究旨在獲得高產(chǎn)醋酸且具有較好耐受性的醋酸菌菌株,為推進(jìn)醋酸行業(yè)的發(fā)展提供參考。
醋醅樣品,取自陜西民間。菌株為巴氏醋酸桿菌(Acetobacterpasteurianus)AS1.41,湖北工業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。
CaCO3(輕質(zhì),99%),上海麥克林;酵母提取物(YEAST EXTRACT),Oxid; 葡萄糖、無水乙醇、NaOH、酚酞、FeCl3等(均為分析純)、瓊脂條(BR),國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
LDZX-50FB立式壓力蒸汽滅菌器,上海申安醫(yī)療器械廠;SW-CJ-1FD潔凈工作臺,蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司; HNY恒溫培養(yǎng)振蕩器,天津市歐諾儀器儀表有限公司;303電熱培養(yǎng)箱,上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司;TGL-18M臺式高速冷凍離心機(jī),上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司;T6紫外可見分光光度計(jì),北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。
富集培養(yǎng)基(GYa):10 g/L葡萄糖、10 g/L酵母提取物、體積分?jǐn)?shù)為2%的無水乙醇。
分離培養(yǎng)基(GYb):10 g/L葡萄糖、110 g/L酵母提取物、20 g/L CaCO3、20 g/L瓊脂、體積分?jǐn)?shù)為3%的無水乙醇。
種子培養(yǎng)基(GYc):10 g/L葡萄糖、10 g/L酵母提取物、體積分?jǐn)?shù)為3.6%的無水乙醇。
發(fā)酵培養(yǎng)基(GYd):10 g/L葡萄糖、10 g/L酵母提取物。使用前,根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)添加不同體積分?jǐn)?shù)的無水乙醇。
以上培養(yǎng)基使用前,均在0.1 MPa、121 ℃條件下蒸汽滅菌20 min。
1.3.1 醋醅中醋酸菌的富集培養(yǎng)
采集新鮮的陜西民間醋醅,于4 ℃下保存。首先富集醋醅中醋酸菌。在250 mL搖瓶中,醋醅與GYa培養(yǎng)基按1∶20的質(zhì)量比稀釋至100 mL, 30 ℃、 180 r/min富集培養(yǎng)48 h,使醋酸菌快速增殖。
1.3.2 醋酸菌的初篩
在滅菌后熱的GYb培養(yǎng)基添加體積分?jǐn)?shù)為3%的無水乙醇,倒平板。用無菌生理鹽水將富集的醋醅醋酸菌培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋,分別取 10-5、10-6和10-7稀釋度培養(yǎng)液200 μL涂布于篩選平板上,30 ℃培養(yǎng)72 h。挑取透明圈直徑比大的單菌落進(jìn)行劃線分離,4 ℃下斜面保存。
1.3.3 醋酸菌的復(fù)篩
斜面保藏的分離菌株進(jìn)行革蘭氏染色試驗(yàn)[12]和產(chǎn)酸定性試驗(yàn)[13]。產(chǎn)酸定性試驗(yàn)操作為將分離菌株接種于GYc培養(yǎng)基中,30 ℃、180 r/min搖瓶培養(yǎng)72 h。然后取10 mL培養(yǎng)液5 000 r/min離心10 min,取5 mL 上清液用0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0,然后煮沸,加入5滴0.1 mol/L FeCl3溶液,產(chǎn)生紅褐色沉淀者初步確認(rèn)為醋酸菌。
1.3.4 醋酸菌種子活化
斜面保藏的分離菌株接種至GYc中,30 ℃、180 r/min 搖瓶活化24 h。
1.3.5 高產(chǎn)酸醋酸菌的復(fù)篩
以AS1.41菌株作為對照。將各活化菌株培養(yǎng)液按10%接種量接種于含體積分?jǐn)?shù)5%乙醇的GYd培養(yǎng)基中,30 ℃、180 r/min搖瓶培養(yǎng)5 d,測定產(chǎn)酸量。
1.3.6 醋酸菌耐受性試驗(yàn)
1.3.6.1 乙醇耐受性
在乙醇體積分?jǐn)?shù)為1.8%、3.6%、5.4%、7.2%、9%、10%、11%的GYd培養(yǎng)基中分別接入體積分?jǐn)?shù)10%的活化菌液,培養(yǎng)基裝液量均為100 mL/250 mL三角瓶,30 ℃、180 r/min搖瓶培養(yǎng),每隔24 h測定OD600和產(chǎn)酸量,直至穩(wěn)定。
1.3.6.2 溫度耐受性
在乙醇體積分?jǐn)?shù)為3.6%的GYd培養(yǎng)基中接入體積分?jǐn)?shù)10%的活化菌液,裝液量同上,180 r/min搖瓶培養(yǎng),溫度分別設(shè)定為26、30、34、37、40、42 ℃,取樣測定同上。
1.3.6.3 乙酸耐受性
在乙醇體積分?jǐn)?shù)為3.6%,乙酸體積分?jǐn)?shù)分別為0、1%、2%、3%、4%、5%的GYd培養(yǎng)基中接入體積分?jǐn)?shù)10%的活化菌液,裝液量、培養(yǎng)條件和取樣測定同1.3.6.1。
1.3.6.4 鹽耐受性
在乙醇體積分?jǐn)?shù)為3.6%,鹽質(zhì)量濃度分別為0、3.0、6.0、9.0、12.0、14.0、16.0、18.0 g/L的GYd培養(yǎng)基中接入體積分?jǐn)?shù)10%的活化菌液,裝液量、培養(yǎng)條件和取樣測定同1.3.6.3。
1.3.7 菌種鑒定
選擇產(chǎn)酸量和條件耐受性最優(yōu)的分離菌株進(jìn)行菌種鑒定?;蚪MDNA提取按參考文獻(xiàn)操作[14-15]。利用16S rDNA兩端引物和聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增目的菌株16S rRNA基因[16],引物序列分別為:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和5′-TACGGCTACCTTGTTACG-ACTT-3′。DNA電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果,然后對擴(kuò)增的16S rRNA基因進(jìn)行測序。最后將測序結(jié)果與GenBank中的已知序列進(jìn)行同源比對,判定細(xì)菌種類,將細(xì)菌劃分到屬或種[17]。利用MEGA 5.0軟件采用相鄰法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[18]。
1.3.8 指標(biāo)測定方法
菌體生物量用分光光度計(jì)測定波長600 nm處的光密度,用OD600值來表示菌體的生物量;產(chǎn)酸量測定參照GB/T 12456—2008食品中總酸的測定指示劑法。
2.1.1 醋酸菌的初篩
由圖1可知,在富集培養(yǎng)液稀釋度為10-5篩選平板上,有32個(gè)單菌落產(chǎn)生了透明圈。從中挑取3個(gè)透明圈直徑比明顯較大的單菌落,進(jìn)行劃線分離,最后從篩選分離平板上挑取單菌落進(jìn)行斜面保藏,編號分別為JM1、JM2、JM3。
圖1 菌株篩選平板Fig.1 Screening plate of strains
2.1.2 醋酸菌定性
由于固態(tài)醋醅中菌相較為復(fù)雜,僅從篩選特征和菌落形態(tài)難以確認(rèn)為符合要求的醋酸菌,因此對初篩菌株JM1、JM2、JM3進(jìn)行革蘭氏染色和產(chǎn)酸定性實(shí)驗(yàn),結(jié)果如表1所示。由表1可知,3個(gè)初篩菌株均為G-,均為醋酸產(chǎn)生菌。
表1 醋酸菌初步鑒定結(jié)果Table 1 Preliminary identification of acetic acid bacteria
注:-為陰性;+為陽性
2.1.3 高產(chǎn)酸醋酸菌的復(fù)篩
將所有試驗(yàn)菌株分別接種于乙醇體積分?jǐn)?shù)為5%的GYd培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d,產(chǎn)酸結(jié)果如圖2所示。JM1、JM2、JM3、AS1.41產(chǎn)酸量分別為37.0、42.0、38.5、26.0 g/L。篩選菌株的產(chǎn)酸量均顯著高于AS1.41(P<0.05)。
圖2 各菌株發(fā)酵5 d的產(chǎn)酸量Fig.2 Acid-producing yield of the strains after fermented for 5 days
2.2.1 乙醇耐受性
試驗(yàn)菌株在乙醇體積分?jǐn)?shù)不同的發(fā)酵液中生長和產(chǎn)酸情況如圖3所示。所示由圖3可知,乙醇體積分?jǐn)?shù)從1.8%增加至11%的過程中,各醋酸菌生物量均呈現(xiàn)下降趨勢,而產(chǎn)酸量均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢,表明試驗(yàn)體積分?jǐn)?shù)的乙醇對各醋酸菌的生長均有一定程度的抑制作用,而一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇對產(chǎn)醋酸有利。乙醇體積分?jǐn)?shù)為3.6%時(shí),AS1.41產(chǎn)酸量最大,達(dá)到30.6 g/L;而JM1、JM2、JM3在乙醇體體積分?jǐn)?shù)為5.4%時(shí)產(chǎn)酸量均最大,其中JM2產(chǎn)酸量最高,可達(dá)49.8 g/L。在乙醇體積分?jǐn)?shù)為3.6%~7.2%,JM1、JM2、JM3的產(chǎn)酸較強(qiáng)且穩(wěn)定。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)增至10%以上時(shí),所有試驗(yàn)菌株生長和產(chǎn)酸均明顯受抑制,AS1.41甚至停止產(chǎn)酸,這與乙醇抑制細(xì)菌生長和代謝的作用有關(guān)[19-20]。比較可知,JM2具有相對較好的乙醇耐受性,產(chǎn)酸能力也明顯高于AS1.41。
A-菌體生物量;B-產(chǎn)酸量圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對菌體生物量和產(chǎn)酸量的影響Fig.3 Effect of ethanol volume fraction on bacterial biomass and acid production
2.2.2 溫度耐受性
溫度耐受性試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。在26~37℃,所有試驗(yàn)菌株生長和產(chǎn)酸均較穩(wěn)定,37~40 ℃時(shí),生長和產(chǎn)酸均趨于停滯狀態(tài)。JM1、JM2、JM3最適培養(yǎng)和產(chǎn)酸溫度為30 ℃左右,且在26~37 ℃產(chǎn)酸能力均較強(qiáng),其中JM2的產(chǎn)酸量最高,達(dá)38.9 g/L。AS1.41適宜的培養(yǎng)溫度為30~34 ℃,適宜的產(chǎn)酸溫度30~37 ℃,產(chǎn)酸達(dá)到32 g/L。在一定的培養(yǎng)溫度范圍內(nèi),溫度上升會(huì)有利于醋酸菌的生長和代謝,而溫度過高會(huì)導(dǎo)致醋酸菌產(chǎn)酶能力降低,因此產(chǎn)酸下降[21]。綜合分析可知,JM2具有更好的溫度耐受性。
A-菌體生物量;B-產(chǎn)酸量圖4 溫度對菌體生物量和產(chǎn)酸量的影響Fig.4 Effect of temperature on bacterial biomass and acid production
2.2.3 乙酸耐受性
試驗(yàn)菌株的乙酸耐受性結(jié)果如圖5所示。乙酸對4株醋酸菌的生長均具有一定抑制作用,而體積分?jǐn)?shù)1%的乙酸似乎可以促進(jìn)醋酸菌的產(chǎn)酸,使JM1、JM2和AS 1.41的產(chǎn)酸量均達(dá)到最高,此時(shí)JM2的產(chǎn)酸量最高為40.5 g/L,而AS1.41產(chǎn)酸量為32.7 g/L;當(dāng)乙酸體積分?jǐn)?shù)增加至4%以上時(shí),醋酸菌的生長和產(chǎn)酸均受到明顯抑制,因?yàn)檫^酸的環(huán)境會(huì)影響醋酸菌的生長[22]。過酸和堿性的環(huán)境都會(huì)導(dǎo)致相關(guān)酶活性的下降,從而影響醋酸菌的生長和產(chǎn)酸能力[23]。綜合分析,在相同乙酸濃度下,AS1.41的生長情況好于3株分離醋酸菌菌株,而JM2在乙酸為體積分?jǐn)?shù)為0%~2%的條件下,乙酸耐受性最強(qiáng)。
A-菌體生物量;B-產(chǎn)酸量圖5 乙酸體積分?jǐn)?shù)對菌體生物量和產(chǎn)酸量的影響Fig.5 Effect of acetic acid volume fraction on bacterial biomass and acid production
2.2.4 鹽耐受性
由圖6可知,在鹽質(zhì)量濃度為0~16.0 g/L時(shí),3個(gè)篩選菌株表現(xiàn)出較好的耐鹽性,其中JM2耐鹽能力最強(qiáng)。在低于質(zhì)量濃度為3.0 g/L的鹽溶液中,鹽對JM1、JM2、JM3的生長和產(chǎn)酸均沒有顯著影響,而AS1.41的產(chǎn)酸有明顯降低;當(dāng)鹽質(zhì)量濃度從3.0 g/L增至14.0 g/L,AS1.41的生長及產(chǎn)酸量呈現(xiàn)明顯下降的趨勢,并且在質(zhì)量濃度為14.0 g/L時(shí),幾乎停止產(chǎn)酸;而當(dāng)鹽質(zhì)量濃度從3.0 g/L增至12.0 g/L,JM1、JM2、 JM3的生長及產(chǎn)酸量所受影響較小,當(dāng)鹽質(zhì)量濃度從12.0 g/L增至18.0 g/L,JM1、JM2、JM3生長和產(chǎn)酸量呈現(xiàn)明顯的下降趨勢,其中JM2產(chǎn)酸量一直高于JM1和JM3。低鹽質(zhì)量濃度對醋酸菌生長影響較小,但隨著鹽質(zhì)量濃度的增加,醋酸菌的生長受到嚴(yán)重抑制,并且影響其產(chǎn)酸能力[24]。綜合分析,JM2的鹽耐受性最好。
A-菌體生物量;B-產(chǎn)酸量圖6 鹽濃度對菌體生物量和產(chǎn)酸量的影響Fig.6 Effect of salt concentration on bacterial biomass and acid production
對耐受性試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行綜合分析可知,在各試驗(yàn)條件下,AS1.41的生長適應(yīng)能力較強(qiáng),而JM1、JM2、JM3的產(chǎn)酸能力卻明顯高于AS1.41。以滬釀1.01為對照菌株時(shí),文獻(xiàn)報(bào)道也有類似規(guī)律發(fā)生[25]。最終試驗(yàn)確定JM2產(chǎn)酸能力最強(qiáng)、條件耐受性最好,需要進(jìn)一步對JM2進(jìn)行菌種鑒定。
2.3.1 DNA的提取及其PCR擴(kuò)增
以JM2菌株的DNA為模板,采用特定的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測,結(jié)果如圖7所示,基因擴(kuò)增的產(chǎn)物大小約為1 500 bp,結(jié)合參考文獻(xiàn)[26]可知,實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合預(yù)期。
圖7 JM2醋酸菌的16S rDNA擴(kuò)增電泳圖Fig.7 Electrophoresis pattern of 16S rDNA amplification of acetic acid bacteria JM2
2.3.2 同源序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建
將JM2菌株的16S rDNA序列放入NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對,結(jié)果表明菌株JM2與熱帶醋酸桿菌(Acetobactertropicalis)的16S rDNA序列相似度達(dá)到100%,結(jié)合文獻(xiàn)[27]可以確認(rèn)JM2為熱帶醋酸菌。然后采用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果如圖8所示。
圖8 采用NJ法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.8 Phylogenetic tree constructed by neighbor-joining method
由圖8可知,菌種JM2顯示與熱帶醋酸桿菌(AcetobactertropicalisSCMA19)具有最親近的關(guān)系。結(jié)合16S rDNA序列同源性和系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果,確定JM2菌株為熱帶醋酸桿菌(Acetobactertropicalis)。
陜西民間有釀醋的傳統(tǒng),有豐富的醋醅資源,因此陜西民間醋醅是優(yōu)良醋酸菌菌種的寶庫。本研究從新鮮的陜西民間醋醅中篩選到3株醋酸菌JM1、JM2、JM3,與AS1.41進(jìn)行產(chǎn)酸和條件耐受性比較,發(fā)現(xiàn)JM2的條件耐受性和產(chǎn)酸能力相對較強(qiáng),在其他條件適宜的情況下,可耐受的乙醇體積分?jǐn)?shù)、乙酸體積分?jǐn)?shù)、鹽質(zhì)量濃度分別為9%、3%和16.0 g/L,在26~37 ℃具有較強(qiáng)而穩(wěn)定的產(chǎn)酸能力。經(jīng)16S rDNA基因測序和分析,確定JM2為熱帶醋酸桿菌(Acetobactertropicalis)。JM2是1株高產(chǎn)酸且耐受性較好的醋酸菌,具有很好的工業(yè)應(yīng)用前景。