劉韻怡，戚建華，王年，郁小娟，何軒灝，劉軒明，宋增福

(上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，國(guó)家水生動(dòng)物病原庫(kù)，水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306)

水霉病是一種以白色或灰黃色蓬松絲狀菌絲斑塊為特征，發(fā)生在魚(yú)類、兩棲動(dòng)物身體上或覆蓋在魚(yú)卵表面的常見(jiàn)疾病[1]，會(huì)對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成較嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，也會(huì)對(duì)兩棲動(dòng)物種群多樣性產(chǎn)生不利影響[2]?，F(xiàn)有研究中已知的致病性水霉有多個(gè)種類，其中，寄生水霉Saprolegniaparasitica是淡水養(yǎng)殖中水霉病的主要病原菌之一[3]。寄生水霉無(wú)宿主選擇性，溫度適應(yīng)范圍廣，抗逆性強(qiáng)，一年四季都可導(dǎo)致魚(yú)體感染發(fā)病[4]。其感染魚(yú)體后會(huì)引起表皮和真皮損傷及細(xì)胞壞死，并可進(jìn)一步導(dǎo)致魚(yú)體滲透壓調(diào)節(jié)失敗，從而致魚(yú)死亡[5]。

孔雀石綠被認(rèn)為是治療水霉病最有效的化學(xué)物質(zhì)[6]。但因孔雀石綠及其代謝產(chǎn)物無(wú)色且孔雀石綠具有高殘留、高致癌、高致畸性的特點(diǎn)，2002年就被中國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部列入水產(chǎn)養(yǎng)殖中禁止使用的藥物[7]。近年來(lái)也相繼出現(xiàn)多種預(yù)防和治療水霉病的藥物，如二硫氰基甲烷、復(fù)合樹(shù)酯酸銅、氯化鈉、中草藥制劑和生化防腐制劑，但防控效果均遠(yuǎn)不及孔雀石綠，且容易出現(xiàn)疾病復(fù)發(fā)、產(chǎn)生耐藥性及藥物急性中毒等情況[8-9]。因此，開(kāi)發(fā)新型綠色防控藥物仍然是當(dāng)前水霉病害防控的重要任務(wù)。

生物表面活性劑是由細(xì)菌、真菌或酵母菌產(chǎn)生于體外具有兩親性的分子化合物，并表現(xiàn)出優(yōu)異的表面活性、結(jié)構(gòu)多樣性和環(huán)境相容性；同時(shí)，還具有抗細(xì)菌、抗真菌、抗病毒和抗黏附等特性，使其在環(huán)境修復(fù)，以及農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域和化妝品等行業(yè)得到廣泛應(yīng)用[8]。鼠李糖脂(rhamnolipid)是生物表面活性劑的一種，由鼠李糖單元通過(guò)β糖苷鍵連接到3-羥基脂肪防酸鏈而組成，也是至今研究最為詳細(xì)的生物表面活性劑[10]。自然發(fā)酵產(chǎn)生的鼠李糖脂是不同同系物的混合物，這些同系物及其獨(dú)特的組合可能在鼠李糖脂對(duì)特定真菌產(chǎn)生的抗真菌活性中發(fā)揮關(guān)鍵作用[11]。已有研究表明，鼠李糖脂是抗植物致病真菌的有效物質(zhì)[12-14]。Stanghellini等[15]在1996年就發(fā)現(xiàn)鼠李糖脂在生物防控方面的潛力，由銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa產(chǎn)生的鼠李糖脂能使瓜果腐霉Pythiumaphanidermatum及辣椒疫霉Phytophoracapsici的游動(dòng)孢子裂解死亡。也有研究發(fā)現(xiàn)，鼠李糖脂能裂解皮膚廯菌、白色念珠菌的細(xì)胞膜，可作為醫(yī)學(xué)抗真菌制劑，用于治療人的真菌病[16-17]。然而，鼠李糖脂對(duì)水霉菌的抑制作用尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究中，通過(guò)進(jìn)行鼠李糖脂對(duì)水霉的體外抑制試驗(yàn)，研究了鼠李糖脂對(duì)寄生水霉的作用，以期為研制新型綠色、安全、有效的防水霉制劑提供數(shù)據(jù)與理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株：寄生水霉菌株SaprolegniaparasiticaATCC200013由上海海洋大學(xué)胡鯤教授課題組惠贈(zèng)。

試劑：鼠李糖脂由國(guó)家水生動(dòng)物病原庫(kù)實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵提??；馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)、馬鈴薯葡萄糖水 (PD水)、孔雀石綠(含量≥95%)、亞甲基藍(lán)均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；甲霜靈購(gòu)自浙江禾本科技有限公司。

主要儀器設(shè)備：掃描電鏡(S3400N，日本日立高新技術(shù)公司)，冷凍干燥儀(EZ550Q，美國(guó)FTS Systems公司)，電導(dǎo)率儀(DDS-307，上海光學(xué)儀器廠)，光學(xué)顯微鏡(Olympus BX53F，上海啟步生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 鼠李糖脂的提取 參考孟令一[18]的方法，將本課題組分離得到的銅綠假單胞菌PseudomonasaeruginosaA39-1菌株(NCBI登錄號(hào)：CP068238)活化，以體積分?jǐn)?shù)為2%的比例接種到100 mL無(wú)菌發(fā)酵培養(yǎng)液中，于37 ℃、180 r/min的恒溫震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)120 h后，將發(fā)酵液以12 000 r/min 離心12 min，留上清液，用濃HCl調(diào)節(jié)上清液的pH至2.0，加入等體積的氯仿甲醇萃取液(氯仿與甲醇體積比為2∶1)，劇烈震蕩混勻后于4 ℃下靜置12 h，棄上清，將下層萃取液裝入燒杯并置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上揮發(fā)，直至出現(xiàn)棕黃色固體，隨后將得到的黃色固體置于60 ℃烘箱中烘干4 h，待樣品冷卻至室溫時(shí)，加入適量pH為8.3的NaHCO3溶液溶解固體，得到粗提產(chǎn)物。通過(guò)薄層色譜試驗(yàn)(TLC)證實(shí)所得產(chǎn)物為鼠李糖脂[19]。

1.2.2 寄生水霉菌株ATCC200013孢子懸浮液的制備 參考張世奇等[4]的方法，將水霉菌種在PDA平板20 ℃下培養(yǎng)后，切取水霉菌塊轉(zhuǎn)接到PDA平板繼續(xù)培養(yǎng)3～4 d至菌絲鋪滿平板。在無(wú)菌條件下，將滅菌的油菜籽放入鋪滿菌絲的平板上，每個(gè)平板30粒，繼續(xù)培養(yǎng)2～3 d至油菜籽上附著菌絲，隨后將油菜籽放入裝有30 mL無(wú)菌水的三角瓶中，20 ℃下以120 r/min培養(yǎng)36 h。待游動(dòng)孢子大量產(chǎn)生后，用6層滅菌紗布過(guò)濾，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整孢子懸液濃度為106～107cfu/mL，備用。

1.2.3 最小抑菌濃度(MIC)與最小殺菌濃度(MFC)的測(cè)定

1)鼠李糖脂對(duì)寄生水霉ATCC200013菌絲體MIC與MFC的影響。參考董平等[20]的倍比稀釋法。在長(zhǎng)滿菌絲的PDA平板上用直徑8 mm的打孔器取菌絲塊接種到24孔板中，孔中加入2 mL含不同鼠李糖脂濃度的馬鈴薯葡萄糖水(PD水)，鼠李糖脂質(zhì)量濃度分別設(shè)置為500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8、3.9 mg/L，以不加鼠李糖脂的孔為對(duì)照組，另以每個(gè)濃度下不加菌塊的孔為空白對(duì)照組用于驗(yàn)證無(wú)菌環(huán)境。每個(gè)處理組設(shè)置3個(gè)平行。20 ℃下培養(yǎng)，以無(wú)菌絲生長(zhǎng)的最低藥物濃度確定為MIC。將顯示無(wú)可見(jiàn)菌生長(zhǎng)的孔中菌塊轉(zhuǎn)移到新的PDA平板上，20 ℃下培養(yǎng)14 d，PDA平板上仍無(wú)可見(jiàn)真菌生長(zhǎng)的藥物濃度視為MFC[21]。

同時(shí)設(shè)置參考藥物亞甲基藍(lán)、甲霜靈質(zhì)量濃度均為400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、0(對(duì)照)mg/L，孔雀石綠質(zhì)量濃度為50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0.39、0(對(duì)照)mg/L。

2)鼠李糖脂對(duì)寄生水霉ATCC200013游動(dòng)孢子MIC與MFC的影響。同樣采用倍比稀釋法，在24孔板中加入2 mL含不同鼠李糖脂濃度的馬鈴薯葡萄糖水(PD水)和等量水霉孢子懸浮液,鼠李糖脂質(zhì)量濃度分別為250、125、62.5、31.25、15.625、7.8、3.9、1.9 mg/L，以不加鼠李糖脂的孔為對(duì)照組，另以每個(gè)濃度下不加水霉孢子懸浮液的孔為空白對(duì)照組用于驗(yàn)證無(wú)菌環(huán)境。每個(gè)處理組設(shè)置3個(gè)平行。20 ℃下培養(yǎng)，以無(wú)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度確定為MIC。將顯示無(wú)可見(jiàn)菌生長(zhǎng)的孔中培養(yǎng)液涂布于新的PDA平板上，20 ℃下培養(yǎng)14 d，PDA平板上仍無(wú)可見(jiàn)真菌生長(zhǎng)的藥物濃度視為MFC。

同時(shí)設(shè)置參考藥物亞甲基藍(lán)、甲霜靈質(zhì)量濃度均為200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0(對(duì)照)mg/L，孔雀石綠質(zhì)量濃度為1.56、0.78、0.39、0.2、0.1、0.05、0.025、0.012、0(對(duì)照)mg/L。

1.2.4 鼠李糖脂對(duì)寄生水霉菌株ATCC200013菌絲生長(zhǎng)的影響 參考張曉波等[22]的生長(zhǎng)速率抑制法。配制PDA培養(yǎng)基，待其冷卻至45 ℃時(shí)分別加入鼠李糖脂后混勻，使各培養(yǎng)基中鼠李糖脂質(zhì)量濃度分別為250、125、62.5、31.25、15.625、7.8、3.9、0(對(duì)照)mg/L。用直徑為8.0 mm的打孔器取水霉菌塊，將菌塊移至含鼠李糖脂的PDA平板中央。每個(gè)處理組設(shè)置3個(gè)平行。置于20 ℃下培養(yǎng)至對(duì)照平板上菌落布滿培養(yǎng)皿2/3左右時(shí)，用游標(biāo)卡尺采用十字交叉法測(cè)量并記錄菌落直徑。生長(zhǎng)抑制率(%)計(jì)算公式為

生長(zhǎng)抑制率=[1-(處理組菌落直徑-菌餅直徑)/(對(duì)照組菌落直徑-菌餅直徑)]×100%。

(1)

以得到的生長(zhǎng)抑制率為縱坐標(biāo)y，鼠李糖脂質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)x，得出毒力回歸方程，計(jì)算生長(zhǎng)抑制率為50%時(shí)的鼠李糖脂濃度(IC50)。

1.2.5 鼠李糖脂對(duì)寄生水霉菌株ATCC200013孢子萌發(fā)的影響 參考樊炳君等[23]的載玻片懸滴法。利用帶有凹槽的玻片，在PD水中加入不同質(zhì)量濃度的鼠李糖脂和等量水霉孢子懸浮液，鼠李糖脂質(zhì)量濃度依此為62.5、31.25、15.625、7.8、3.9、1.9、0(對(duì)照)mg/L。吸取每組樣品滴于玻片的凹槽內(nèi)，將玻片放在空培養(yǎng)皿中。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)平行。置于20 ℃下培養(yǎng)12 h后鏡檢孢子萌發(fā)數(shù)量，隨機(jī)取一個(gè)視野計(jì)數(shù)約100個(gè)孢子，以菌絲芽管長(zhǎng)度大于孢子半徑視為萌發(fā)，計(jì)數(shù)并計(jì)算孢子萌發(fā)率(%)和孢子萌發(fā)抑制率(%)，其計(jì)算公式為

孢子萌發(fā)抑制率=(對(duì)照組萌發(fā)數(shù)-處理組

萌發(fā)數(shù))/對(duì)照組萌發(fā)數(shù)×100%。

(2)

以得到的孢子萌發(fā)抑制率為縱坐標(biāo)y，鼠李糖脂濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)x，得出毒力回歸方程，計(jì)算IC50。

1.2.6 鼠李糖脂對(duì)寄生水霉菌株ATCC200013生長(zhǎng)量的影響 參考菌絲干質(zhì)量法[24]，將鼠李糖脂加入30 mL無(wú)菌的 PD水中，使各培養(yǎng)基中鼠李糖脂質(zhì)量濃度分別為250、125、62.5、31.25、15.625 mg/L，以添加等量滅菌蒸餾水的處理為對(duì)照。接入等量水霉菌孢子懸浮液，20 ℃下以120 r/min震蕩培養(yǎng)7 d，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)平行。將培養(yǎng)后的培養(yǎng)液以4 000 r/min離心10 min，去除上清液，菌絲沉淀用清水離心洗滌3次，100 ℃下烘干，置于天平上稱重(精確至0.000 1 g)。

1.2.7 鼠李糖脂對(duì)寄生水霉菌株ATCC200013細(xì)胞膜通透性的影響 參考夏曉明等[25]的電導(dǎo)率法。將水霉菌塊接種到100 mL PD水中，20 ℃下以120 r/min震蕩培養(yǎng)3 d后，以4 000 r/min離心15 min，去培養(yǎng)液，用無(wú)菌去離子水充分沖洗，稱取0.5 g濕菌絲置于50 mL含不同質(zhì)量濃度(250、125、62.5 mg/L)鼠李糖脂的無(wú)菌去離子水中；將不同質(zhì)量濃度(31.25、15.625、7.8 mg/L)鼠李糖脂加入100 mL濃度為1×108cfu/mL的水霉孢子懸浮液中。均以不加鼠李糖脂的處理為對(duì)照組?？紤]到鼠李糖脂本身對(duì)電導(dǎo)的影響，以只加不同濃度鼠李糖脂不加菌為空白對(duì)照。每個(gè)處理組設(shè)置3個(gè)平行，并置于20 ℃下以120 r/min震蕩培養(yǎng)。采用電導(dǎo)率儀于0、2、4、6、8、10、12、24 h時(shí)分別測(cè)定培養(yǎng)液電導(dǎo)率值。

1.2.8 鼠李糖脂對(duì)寄生水霉菌株ATCC200013菌絲形態(tài)結(jié)構(gòu)影響觀察 取培養(yǎng)在250、125 mg/L鼠李糖脂中24 h后的菌絲，置于載玻片上，利用光學(xué)顯微鏡觀察菌絲變化。

取培養(yǎng)在250、125 mg/L鼠李糖脂中24 h后的菌絲，用2.5%戊二醛(體積分?jǐn)?shù)，下同)于4 ℃下固定，置于冰箱中過(guò)夜。隨后用PBS緩沖液漂洗3次，每次10～15 min，依次用50%、70%、80%、90%乙醇(體積分?jǐn)?shù)，下同)脫水，每次15 min，再用100%乙醇脫水2次，每次15 min，最后置于乙酸異戊酯中置換一次，再將樣品用液氮速凍后置于冷凍干燥箱中干燥，取出噴金置于掃描電鏡觀察并拍照。

取培養(yǎng)在125 mg/L鼠李糖脂中24 h后的菌絲，用2.5%戊二醛于4 ℃下固定4～6 h后，用PBS清洗3次，每次10～15 min，用體積分?jǐn)?shù)1% 的四氧鋨酸再固定；無(wú)水丙酮脫水15 min后，用無(wú)水丙酮和包埋劑逐級(jí)滲透，比例依次為2∶1、1∶1、1∶2；最后放入包埋槽中，用包埋劑填埋后，修整經(jīng)光學(xué)顯微鏡定位，在超薄切片機(jī)上切片，厚度為70～80 nm，經(jīng)醋酸雙氧鈾及枸櫞酸鉛雙重染色5 min后，用透射電鏡觀察并拍照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±S.E.)表示，采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 最小抑菌濃度(MIC)與最小殺菌濃度(MFC)

試驗(yàn)以亞甲基藍(lán)、甲霜靈、孔雀石綠為陽(yáng)性對(duì)照，結(jié)果顯示：鼠李糖脂對(duì)寄生水霉菌絲生長(zhǎng)的MIC為125 mg/L(表1、圖1)，將孔中菌塊轉(zhuǎn)接到PDA平板上無(wú)菌絲生長(zhǎng)時(shí)，確定鼠李糖脂對(duì)寄生水霉菌絲生長(zhǎng)的MFC為125 mg/L，鼠李糖脂對(duì)寄生水霉孢子的MIC為15.625 mg/L，MFC為31.25 mg/L(表2)；甲霜靈對(duì)寄生水霉菌絲和孢子的MIC分別為100、12.5 mg/L；孔雀石綠對(duì)寄生水霉菌絲和孢子的MIC分別為0.39、0.1 mg/L(表1、表2)。

表1 鼠李糖脂對(duì)寄生水霉ATCC200013菌絲的抑制活性Tab.1 Inhibitory activities of rhamnolipid on mycelia of Saprolegnia parasitica ATCC200013

A～H—鼠李糖脂質(zhì)量濃度分別為500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8、3.9 mg/L。A-H—rhamnolipid concentrations are 500，250，125，62.5，31.25，15.625，7.8 and 3.9 mg/L,respectively.圖1 鼠李糖脂對(duì)寄生水霉ATCC200013菌絲的抑制效果Fig.1 Inhibitory effect of rhamnolipid on mycelia of Saprolegnia parasitica ATCC200013

表2 鼠李糖脂對(duì)寄生水霉ATCC200013孢子的抑制活性Tab.2 Inhibitory activities of rhamnolipid on zoospores of Saprolegnia parasitica ATCC200013

2.2 鼠李糖脂對(duì)寄生水霉ATCC200013菌絲生長(zhǎng)的影響

寄生水霉菌絲在含不同濃度鼠李糖脂PDA平板上生長(zhǎng)情況見(jiàn)圖2。由表3可知，鼠李糖脂對(duì)寄生水霉菌絲具有顯著的抑制效果，且抑制效果與其濃度呈正相關(guān)，當(dāng)鼠李糖脂質(zhì)量濃度為31.25 mg/L時(shí)，對(duì)菌絲的抑制率達(dá)到80.54%。以菌絲生長(zhǎng)抑制率為縱坐標(biāo)y，以鼠李糖脂濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)x，得到毒力回歸方程為y=52.896x-11.73(R2=0.901 9)，其IC50=14.69 mg/L。

A～H—鼠李糖脂質(zhì)量濃度分別為250、125、62.5、31.25、15.625、7.8、3.9、0(對(duì)照)mg/L。A-H—rhamnolipid concentrations are 250,125,62.5,31.25,15.625,7.8,3.9 and 0(control)mg/L,respectively.圖2 鼠李糖脂對(duì)寄生水霉ATCC200013菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effects of rhamnolipid on the mycelium growth of Saprolegnia parasitica ATCC200013

表3 鼠李糖脂對(duì)寄生水霉ATCC200013菌絲生長(zhǎng)的抑制率Tab.3 Inhibition rate of rhamnolipid on mycelium growth of Saprolegnia parasitica ATCC200013

2.3 鼠李糖脂對(duì)寄生水霉菌株ATCC200013孢子萌發(fā)的影響

從表4可見(jiàn)：鼠李糖脂對(duì)水霉菌孢子萌發(fā)具有顯著的抑制效果，且抑效果與其濃度呈正相關(guān)；當(dāng)鼠李糖脂質(zhì)量濃度為15.625 mg/L時(shí)，對(duì)孢子萌發(fā)抑制率達(dá)85.70%；質(zhì)量濃度超過(guò)31.25 mg/L時(shí)，則可完全抑制孢子萌發(fā)。以孢子萌發(fā)抑制率為縱坐標(biāo)y，以鼠李糖脂質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)x，得到毒力回歸方程為y=75.656x-10.472(R2=0.931 2)，其IC50=6.30 mg/L。

表4 鼠李糖脂對(duì)寄生水霉ATCC200013孢子萌發(fā)的抑制率Tab.4 Inhibition rate of rhamnolipid on zoospore germination of Saprolegnia parasitica ATCC200013

2.4 鼠李糖脂對(duì)寄生水霉菌株ATCC200013干質(zhì)量的影響

從表5可見(jiàn)：用15.625 mg/L鼠李糖脂處理水霉菌絲后，與未經(jīng)鼠李糖脂處理的組相比，菌絲干質(zhì)量下降了42.79%；隨著鼠李糖脂質(zhì)量濃度的增加，水霉菌絲體干質(zhì)量顯著下降(P<0.05)。

表5 鼠李糖脂對(duì)寄生水霉ATCC200013干質(zhì)量的影響Tab.5 Effects of rhamnolipid on dry weight of Saprolegnia parasitica ATCC200013

2.5 鼠李糖脂對(duì)寄生水霉菌株ATCC200013電導(dǎo)率的影響

從圖3可見(jiàn)：用鼠李糖脂處理寄生水霉菌絲6 h后，與未經(jīng)鼠李糖脂處理的組相比，125 mg/L鼠李糖脂處理的寄生水霉菌絲培養(yǎng)液的電導(dǎo)率升高了68.10%，250 mg/L鼠李糖脂使得菌絲培養(yǎng)液電導(dǎo)率升高了約2.24倍，但在6 h后電導(dǎo)率變化較平穩(wěn)；15.625 mg/L鼠李糖脂處理寄生水霉孢子10 h后，電導(dǎo)率升高了39.57%；低于鼠李糖脂MIC濃度處理的寄生水霉菌絲和孢子的電導(dǎo)率變化均不明顯。

圖3 鼠李糖脂對(duì)寄生水霉ATCC200013菌體電導(dǎo)率的影響Fig.3 Effects of rhamnolipid on the conductivity of Saprolegnia parasitica ATCC200013

2.6 鼠李糖脂對(duì)寄生水霉ATCC200013菌絲形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

寄生水霉菌絲在光學(xué)顯微鏡(40倍)下觀察發(fā)現(xiàn)：未經(jīng)鼠李糖脂處理的組菌絲直挺光滑，分枝連接流暢，菌絲內(nèi)部質(zhì)地均勻(圖4A)；125 mg/L鼠李糖脂處理的菌絲發(fā)生變形扭曲，菌絲內(nèi)部質(zhì)地不均，出現(xiàn)聚集(圖4B)；250 mg/L鼠李糖脂處理的菌絲扁平扭曲斷裂，菌絲出現(xiàn)完全透明現(xiàn)象(圖4C)。掃描電鏡進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)：未經(jīng)鼠李糖脂處理的組菌絲體粗細(xì)一致，表面光滑(圖4D)；125 mg/L鼠李糖脂處理的菌絲粗糙扭曲(圖4E)；250 mg/L鼠李糖脂處理的菌絲扁平皺縮(圖4F)。

透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)(圖5)：未經(jīng)鼠李糖脂處理的寄生水霉菌絲體細(xì)胞中的細(xì)胞膜、細(xì)胞壁、細(xì)胞核、線粒體等超微結(jié)構(gòu)清晰完整(圖片總數(shù)n=30)；用125 mg/L鼠李糖脂處理后的菌絲體，細(xì)胞壁變薄且有溶解現(xiàn)象，形成孔洞，有些出現(xiàn)嚴(yán)重變形彎曲，胞內(nèi)出現(xiàn)大量空泡，細(xì)胞核、細(xì)胞器破裂溶解，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)無(wú)完整的細(xì)胞器和核區(qū)(圖片總數(shù)n=25)。

A～C—光學(xué)顯微鏡拍攝圖；D～F—掃描電鏡拍攝圖；A、D—0 mg/L鼠李糖脂處理組；B、E—125 mg/L鼠李糖脂處理組；C、F—250 mg/L鼠李糖脂處理組。A-C—images of light microscope;D-F—scanning electron microscope；A,D—treated with 0 mg/L rhamnolipid；B,E—treated with 125 mg/L rhamnolipid；C,F—treated with 250 mg/L rhamnolipid.圖4 不同質(zhì)量濃度鼠李糖脂處理的寄生水霉ATCC200013菌絲形態(tài)Fig.4 Images of mycelial morphology of Saprolegnia parasitica ATCC200013 exposed to rhamnolipid

3 討論

3.1 鼠李糖脂對(duì)寄生水霉ATCC200013的抑制活性

目前，防治水霉病的有效措施主要依賴于化學(xué)真菌抑制劑，但化學(xué)殺菌劑在使用中存在安全性不足和環(huán)境污染等問(wèn)題且易產(chǎn)生耐藥性。因此，篩選具有良好抗真菌性能的環(huán)境友好型制劑是水霉防治的重點(diǎn)工作。已有研究顯示，鼠李糖脂對(duì)植物病原菌，如番茄灰霉病菌屬、番茄紅病菌屬、炭疽菌屬、腐霉屬、鐮刀菌屬、疫霉屬等，具有抗真菌活性[26-29]，且抗真菌性能高、使用安全、可生物降解，具有更為明顯的優(yōu)勢(shì)和發(fā)展?jié)摿Γ袭?dāng)前發(fā)展環(huán)境友好型水產(chǎn)業(yè)的要求。本研究中，以寄生水霉ATCC200013作為目標(biāo)病原菌，研究了鼠李糖脂對(duì)水霉菌絲與孢子的抑制作用，并進(jìn)一步探討了鼠李糖脂抑制水霉的作用機(jī)制，為新型綠色水霉病防治制劑的研制提供了科學(xué)依據(jù)。本研究顯示，鼠李糖脂能有效抑制寄生水霉菌絲體和孢子的發(fā)育與生長(zhǎng)，對(duì)寄生水霉菌絲體最小抑菌濃度為125 mg/L，對(duì)寄生水霉游動(dòng)孢子最小抑菌濃度為15.625 mg/L，在15.625 mg/L鼠李糖脂質(zhì)量濃度下，對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制率為59.84%，對(duì)孢子萌發(fā)抑制率為85.70%；鼠李糖脂抗寄生水霉的活性高于亞甲基藍(lán)，與甲霜靈接近，但低于孔雀石綠(表1、表2)，這表明，鼠李糖脂具有開(kāi)發(fā)為水霉防治制劑的可行性，進(jìn)一步證實(shí)了鼠李糖脂的抗真菌特性，拓展了鼠李糖脂的抗真菌范圍。此外，本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，寄生水霉孢子比菌絲體對(duì)鼠李糖脂更為敏感，這與Zhang等[30]研究發(fā)現(xiàn)水霉孢子體對(duì)4種供試藥物的敏感性均高于菌絲體的結(jié)果一致。Khomvilai等[31]研究同樣發(fā)現(xiàn)，次氯酸鈉對(duì)水霉菌絲體的抑制濃度是孢子抑制濃度的10倍，這種現(xiàn)象可能是兩者的細(xì)胞壁組成差異導(dǎo)致[32]。因此，對(duì)于水霉的防治可以考慮從水霉孢子入手，加強(qiáng)水體中水霉孢子的監(jiān)測(cè)與控制，從而既可減少水體用藥劑量，降低環(huán)境污染，也可預(yù)防水霉病的發(fā)生與蔓延。

A～B—0 mg/L鼠李糖脂處理組(圖片總數(shù)n=30)；C～E—125 mg/L鼠李糖脂處理組(圖片總數(shù)n=25)。CM—細(xì)胞膜；CW—細(xì)胞壁；N—細(xì)胞核；M—線粒體；E—空泡。A-B—0 mg/L rhamnolipid (number of pictures n=30);C-E—125 mg/L rhamnolipid (n=25).CM—cell membrane;CW—cell wall;N—nucleus;M—mitochondrion;E—edema vacuole.圖5 透射電鏡觀察鼠李糖脂對(duì)寄生水霉菌絲細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響Fig.5 Transmission electron microscopic observation of effect of rhamnolipid on the ultrastructure of mycelial cells of Saprolegnia parasitica

3.2 鼠李糖脂對(duì)寄生水霉ATCC200013的抑菌機(jī)制

鼠李糖脂作為親脂親水的兩親性分子，對(duì)其抗真 菌的機(jī)制已有些探索性的研究。鼠李糖脂抑制菌絲生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)和游動(dòng)孢子溶解等效應(yīng)被認(rèn)為是與菌膜脂質(zhì)成分相互作用的結(jié)果，通過(guò)誘導(dǎo)孔、離子通道的形成來(lái)干擾菌膜的完整性和通透性[14,33]。Otzen 等[34]通過(guò)差示掃描量熱法、X射線衍射、熒光和紅外光譜法研究發(fā)現(xiàn)，鼠李糖脂分子插入在磷脂雙分子層中，促進(jìn)了磷脂碳?xì)滏湹奈蓙y，達(dá)到破壞菌體細(xì)胞膜的效果；Nalini等[35]報(bào)道顯示，鼠李糖脂生物表面活性劑在真菌防治中的作用方式還包括促使細(xì)胞壁形成通道。本研究中，從菌絲體電導(dǎo)率和顯微觀察的角度，初步研究了鼠李糖脂對(duì)水霉菌絲的抑制機(jī)制。菌體電導(dǎo)率的變化反映了菌體細(xì)胞膜通透性的改變，電導(dǎo)率越大，表明細(xì)胞內(nèi)的導(dǎo)電離子出現(xiàn)外泄越嚴(yán)重，這些離子包括K+、Na+、Mg2+等，對(duì)維持真菌細(xì)胞的滲透平衡、代謝均有重要作用[36-37]。本研究中測(cè)定了鼠李糖脂處理后水霉菌體的電導(dǎo)率，結(jié)果顯示，鼠李糖脂處理后的寄生水霉菌體電導(dǎo)率與未經(jīng)處理的相比顯著提高(圖3)，這表明菌體細(xì)胞內(nèi)容物滲出。細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)的明顯滲漏通常被用作細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)膜嚴(yán)重和不可逆損傷的標(biāo)志[38-39]，因此，從本試驗(yàn)結(jié)果可以推論，鼠李糖脂對(duì)水霉菌體造成了破壞。

本試驗(yàn)進(jìn)一步通過(guò)光學(xué)顯微鏡、掃描電鏡和透射電鏡觀察，證實(shí)了鼠李糖脂對(duì)寄生水霉菌絲體的損傷情況(圖4、圖5)。鼠李糖脂破壞了寄生水霉菌絲細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，并損傷細(xì)胞器，影響了它們正常的功能，因此，可以初步認(rèn)為，鼠李糖脂對(duì)水霉的抑制作用是對(duì)水霉菌體細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞導(dǎo)致的，這與之前報(bào)道的用鼠李糖脂處理后的真菌菌絲完整性受損的觀察結(jié)果一致[40-41]，但具體的細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)如何發(fā)生改變還需進(jìn)一步研究。本研究中用透射電鏡觀察到鼠李糖脂處理的寄生水霉細(xì)胞壁裂解消融。水霉菌屬細(xì)胞壁主要是由纖維素和葡聚糖組成[42]，纖維素是由D-葡萄糖以β-1,4-糖苷鍵連接組成的多聚糖，鼠李糖脂中的鼠李糖環(huán)也以β-1,4-糖苷鍵連接成2或3糖[43]，這種結(jié)構(gòu)的相似性可能會(huì)使鼠李糖脂競(jìng)爭(zhēng)性與水霉細(xì)胞壁多糖結(jié)合，破壞寄生水霉纖維素的合成或鏈接。因此，加強(qiáng)鼠李糖脂組成結(jié)構(gòu)與作用活性關(guān)系的研究，有可能會(huì)幫助提升鼠李糖脂對(duì)水霉抑制作用的有效性，從而為制備更加高效的真菌抑制劑提供理論支持。

4 結(jié)論

1)鼠李糖脂對(duì)寄生水霉具有優(yōu)異的抗菌活性，并能破壞寄生水霉菌體細(xì)胞膜壁結(jié)構(gòu)。

2)鼠李糖脂作為一種環(huán)境友好型的生物表面活性劑，其良好的水霉抑制活性有利于水產(chǎn)動(dòng)物防治真菌感染制劑的研發(fā)，可促進(jìn)水產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。