吳建紹，陸振，楊求華，朱志煌，周宸，葛輝

(1.福建省水產(chǎn)研究所，福建 廈門 361013；2.浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所，浙江 溫州 325005)

海盤蟲(chóng)Haliotremasp.隸屬于扁形動(dòng)物門Platyhelminthes單殖亞綱Monogenea錨首蟲(chóng)科Ancyrocephalidae海盤蟲(chóng)屬Haliotrema，是海水魚類常見(jiàn)的寄生蟲(chóng)[1]，常寄生于石斑魚、真鯛、大黃魚、鱸、東方鲀等海水養(yǎng)殖魚類鰓上，嚴(yán)重感染后會(huì)導(dǎo)致養(yǎng)殖魚類發(fā)病，甚至大量死亡。根據(jù)Boeger等[2]和Kritsky等[3]分類系統(tǒng)描述的海盤蟲(chóng)，種類已超過(guò)100多種，國(guó)內(nèi)已報(bào)道發(fā)現(xiàn)50多種[4]。海盤蟲(chóng)具有一定的宿主特異性，如黑鯛海盤蟲(chóng)H.kurodai寄生于黃鰭鯛Acanthopagruslatus、黑鯛A.schlegelii，約氏海盤蟲(chóng)H.johnii寄生于紫紅笛鯛Lutjanusargentimaculatus、勒氏笛鯛L.russellii、金帶笛鯛L.vaigiensis，鲬海盤蟲(chóng)H.platycephali寄生于鲬Platycephalusindicus等[1]。國(guó)內(nèi)外關(guān)于海盤蟲(chóng)研究主要集中在分類鑒定和宿主方面[5-10]，而相關(guān)海盤蟲(chóng)病病原研究報(bào)道較少，僅張劍英等[11]報(bào)道石斑魚海盤蟲(chóng)H.epinepheli引發(fā)赤點(diǎn)石斑魚Epinephelusakaara和真鯛Pagrusmajor發(fā)生海盤蟲(chóng)病。有關(guān)雙斑東方鲀海盤蟲(chóng)病病原鑒定、流行病學(xué)調(diào)查和組織病理研究等目前尚未見(jiàn)詳細(xì)報(bào)道，因此，有必要對(duì)雙斑東方鲀海盤蟲(chóng)病進(jìn)行系統(tǒng)性研究。

雙斑東方鲀Takifugubimaculatus是一種已在福建沿海規(guī)?；B(yǎng)殖的特色經(jīng)濟(jì)魚類，其肉質(zhì)細(xì)嫩、鮮美，深受消費(fèi)者喜歡[12]。隨著雙斑東方鲀養(yǎng)殖高密度化或管理措施不當(dāng)，易導(dǎo)致海盤蟲(chóng)病暴發(fā)，如果生產(chǎn)上未采取防治措施，會(huì)造成幼魚和成魚大量死亡，給東方鲀養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。為了對(duì)雙斑東方鲀海盤蟲(chóng)病深入了解，本項(xiàng)目組于2016年6月—2019年6月，對(duì)福建省海水魚類苗種繁育科研中試基地池塘養(yǎng)殖的雙斑東方鲀海盤蟲(chóng)病流行情況進(jìn)行調(diào)查，利用蟲(chóng)體形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)檢測(cè)相結(jié)合的方法對(duì)發(fā)生病原進(jìn)行鑒定，并觀察了病魚鰓組織病理變化情況，通過(guò)研究確認(rèn)了雙裂海盤蟲(chóng)H.bilobatus為福建池塘養(yǎng)殖的雙斑東方鲀海盤蟲(chóng)病感染病原，這是雙裂海盤蟲(chóng)引起雙斑東方鲀疾病在國(guó)內(nèi)的首次報(bào)道，該研究成果可為海水魚類海盤蟲(chóng)病病原鑒定和防控提供科學(xué)參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用患病雙斑東方鲀魚取自福建省海水魚類苗種繁育科研中試基地養(yǎng)殖池塘。

主要試劑：DNA試劑盒購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司；PCR擴(kuò)增引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成；固定液購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司；乙醇購(gòu)自西隴科學(xué)股份有限公司；海水細(xì)菌培養(yǎng)基2216E和弧菌培養(yǎng)基(TCBS)購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 流行病學(xué)調(diào)查及臨床檢查 于2016年6月—2019年6月期間調(diào)查池塘養(yǎng)殖的雙斑東方鲀海盤蟲(chóng)病流行發(fā)生、發(fā)病魚大小、病魚感染、發(fā)病期間死亡及病魚活動(dòng)情況，了解發(fā)病時(shí)池塘水溫、鹽度等水質(zhì)理化情況。取臨床典型癥狀的病魚(瀕死)解剖，觀察病魚體表體征、鰓及內(nèi)臟器官，描述體表、鰓絲及臟器典型性表觀病理特征。

每次發(fā)病期間，剪取30尾以上病魚的半鰓，置解剖鏡(Olympus-SZX12)下檢查，并采集蟲(chóng)體和計(jì)數(shù)，按文獻(xiàn)方法確認(rèn)病魚蟲(chóng)體感染強(qiáng)度[13]：輕度感染(半鰓感染量≤10枚，用“+”表示)；中度感染(10<半鰓感染量<50枚，用“++”表示)；重度感染(半鰓感染量≥50枚，用“+++”表示)。

1.2.2 細(xì)菌檢查 無(wú)菌操作條件下，從病魚的鰓、肝臟、脾臟和腎臟等器官組織分離細(xì)菌，劃線接種于2216E平板培養(yǎng)基和弧菌選擇性培養(yǎng)基(TCBS)上,置于恒溫箱(28 ℃)倒置培養(yǎng)24～48 h,觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。

1.2.3 病原蟲(chóng)體形態(tài)學(xué)觀察與特征鑒定 剪取病魚半鰓片置于培養(yǎng)皿，經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為30%的乙醇處理后，在解剖鏡下用解剖針隨機(jī)輕挑撥離30條微麻醉蟲(chóng)體，用吸管吸取蟲(chóng)體置于玻片，制成水浸片置于光學(xué)顯微鏡(Lw200-20T)下觀察并拍照，描述蟲(chóng)體形態(tài)特征，并測(cè)量蟲(chóng)體、交接器、中央大鉤、聯(lián)結(jié)片和邊緣小鉤等分類特征的大小，即平均值和范圍值。

1.2.4 分子生物學(xué)分析

1)蟲(chóng)體DNA提取、模板制備及18S rDNA和28S rDNA序列擴(kuò)增。依形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，隨機(jī)選取用體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇保存的蟲(chóng)體(采集)，清洗，TE 緩沖液(pH 8.0)浸泡過(guò)夜后，分別裝入1.5 mL Eppendorf 管中，用DNA 提取試劑盒(捷瑞GK4002-100)提取蟲(chóng)體DNA，于-20 ℃下保存?zhèn)溆?。以蟲(chóng)體DNA為模板，采用核糖體基因的18S rDNA和28S rDNA序列擴(kuò)增。

18S rDNA序列擴(kuò)增引物[14]：Worm-A，5′GCGAATGGCTCATTAAATCAG 3′；Worm-B，5′CTTGTTACGACTTTTACTTCC 3′。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(50 μL)：DNA模板2 μL，PCRMix 25 μL，上、下游引物(Worm)各2 μL，ddH2O 19 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃下預(yù)變性3 min；94 ℃下變性30 s，52 ℃下復(fù)性30 s，72 ℃下延伸120 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；最后在72 ℃下溫育10 min，4 ℃下保存。

28S rDNA序列擴(kuò)增引物[15]：C1-28S-F，5′ACCCGCTGAATTTAAGCAT 3′；D2-28S-R，5′TGGTCCGTGTTTCAAGAC 3′。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(50 μL)：DNA模板2 μL，PCRMix 25 μL，上、下游引物(C1-28S)各2 μL，ddH2O 19 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃下預(yù)變性5 min；94 ℃下變性30 s，55 ℃下復(fù)性30 s，72 ℃下延伸90 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后在72 ℃下溫育7 min，4 ℃下保存。18S rDNA和28S rDNA序列的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物各自用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

2)擴(kuò)增產(chǎn)物序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建。18S rDNA和28S rDNA 的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至Invitrogen 公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)得的基因序列經(jīng)BLAST程序與核酸數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBank)序列進(jìn)行比對(duì)分析?；?8S rDNA和28S rDNA基因序列從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)選取相似、相近的單殖吸蟲(chóng)序列(含本研究中測(cè)得序列)，利用ClustalX 1.83軟件對(duì)選取序列進(jìn)行多重匹配比對(duì)并聚類分析，用MEGA 7.0軟件鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.5 鰓組織病理觀察 取病魚鰓于波恩氏液中固定，然后將固定后的鰓用梯度乙醇脫水，二甲苯溶液透明，石蠟包埋，經(jīng)連續(xù)切片、脫蠟，蘇木精-伊紅(H.E)染色，干燥后用中性樹(shù)膠封片，最后將封片置于光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 流行病學(xué)調(diào)查及病魚臨床癥狀

2016年6月—2019年6月調(diào)查期間，福建省海水魚類苗種繁育科研中試基地池塘養(yǎng)殖的雙斑東方鲀每年均會(huì)發(fā)生海盤蟲(chóng)病，發(fā)病水溫為23～31 ℃，鹽度為1.019～1.022，發(fā)病時(shí)間多在春末夏初(5—6月)和秋季(9—10月)，幼魚和成魚都會(huì)發(fā)病，該病有時(shí)與車輪蟲(chóng)病并發(fā)(表1)。

發(fā)病期病魚蟲(chóng)體感染情況：幼魚階段(體長(zhǎng)7.6～8.0 cm)，病魚平均半鰓感染量為26枚/尾，感染強(qiáng)度屬于中度感染，發(fā)病情況嚴(yán)重；而成魚階段(19.3～21.5 cm)，病魚嚴(yán)重發(fā)病時(shí)平均半鰓感染量分別為164、176枚/尾，感染強(qiáng)度屬于重度感染；嚴(yán)重發(fā)病時(shí)，幼魚和成魚蟲(chóng)體感染率均為100%(表1)。該病發(fā)病初期，發(fā)病魚少量死亡；發(fā)病高峰期，出現(xiàn)大量死亡；如果未采取防控措施，該病累計(jì)死亡率可達(dá)70%以上。

表1 2016年6月—2019年6月池塘養(yǎng)殖雙斑東方鲀海盤蟲(chóng)病的發(fā)生情況Tab.1 Occurrence of haliotremasis in twin-spot puffer Takifugu bimaculatus cultured in ponds from June 2016 to June 2019

發(fā)病時(shí)病魚活動(dòng)情況：病魚緩游于水面，動(dòng)作異常、遲緩，食欲減退或不攝食。外觀病魚體色蒼白，體形消瘦，尾鰭和臀鰭缺損(圖1A)；解剖內(nèi)臟發(fā)現(xiàn)其肝臟、脾臟充血嚴(yán)重(圖1B)；取鰓鏡檢發(fā)現(xiàn)，鰓絲上有大量單殖吸蟲(chóng)蟲(chóng)體，蟲(chóng)體扁平而長(zhǎng)，用后吸器吸附固著鰓，蟲(chóng)體不斷地伸縮擺動(dòng)，移動(dòng)時(shí)做尺蠖狀動(dòng)作(圖1C)；病魚鰓片黏液多，部分鰓有蟲(chóng)卵，蟲(chóng)卵一端有極絲(圖1D)。除了2017年6月發(fā)生海盤蟲(chóng)病的病魚有拌生車輪蟲(chóng)外，其余幾次發(fā)病時(shí)間顯微鏡檢病魚體表皮膚、鰭條和內(nèi)臟器官等組織，未發(fā)現(xiàn)有其他病原體寄生。

2.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)

取所采病魚的鰓、肝臟、脾臟和腎臟等器官組織病料，接種于2216E平板和TCBS培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng),28 ℃下恒溫培養(yǎng)48 h后，所接種的培養(yǎng)基均未觀察到優(yōu)勢(shì)致病菌。

2.3 病原蟲(chóng)體初步觀察

2016年6月—2019年6月發(fā)病期間采集的病原蟲(chóng)體經(jīng)顯微鏡觀察，蟲(chóng)體大小約1 mm左右，內(nèi)部結(jié)構(gòu)清晰、典型(圖2A)：頭器3對(duì)，前端有眼點(diǎn)2對(duì)，后一對(duì)眼點(diǎn)明顯大于前一對(duì)，咽呈橢圓形；交接器簡(jiǎn)單，基部連接于杯形基座；后吸器與前體部區(qū)分明顯，具2對(duì)中央大鉤、2根聯(lián)結(jié)片和7對(duì)邊緣小鉤；卵黃腺沿腸支分布于身體兩側(cè)，腸支簡(jiǎn)單，明顯地分開(kāi)，但在身體后端匯合。病原蟲(chóng)體符合錨首蟲(chóng)科海盤蟲(chóng)屬特征[1]，確定該寄生蟲(chóng)為海盤蟲(chóng)。結(jié)合病魚特征、感染蟲(chóng)體形態(tài)和鰓蟲(chóng)數(shù)量情況，確認(rèn)雙斑東方鲀感染海盤蟲(chóng)病[11]。

2.4 海盤蟲(chóng)病病原形態(tài)學(xué)鑒定

上述發(fā)病期間，病原經(jīng)形態(tài)學(xué)檢查確認(rèn)為同一種海盤蟲(chóng)蟲(chóng)體，該蟲(chóng)體較大，體長(zhǎng)1.058 mm，中部寬0.225 mm，體長(zhǎng)與體寬比約為4.7，咽直徑0.075 mm(圖2A);后吸器幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)由2對(duì)中央大鉤、2個(gè)聯(lián)結(jié)片和7對(duì)邊緣小鉤組成(圖2B)；腹中央大鉤粗壯，基部膨大，內(nèi)外突分化，腹中央大鉤長(zhǎng)0.048 mm，鉤柄寬0.035 mm，鉤尖長(zhǎng)0.018 mm(圖2B(g))；腹聯(lián)結(jié)片棒狀，近中部具兩突起，兩端稍細(xì)，長(zhǎng)0.068 mm，中間寬0.016 mm(0.014～0.017 mm)(圖2B(h))；背中央大鉤粗壯，基部膨大，外側(cè)有裂刻，內(nèi)外突分化明顯，背中央大鉤長(zhǎng)0.046 mm，鉤柄寬0.036 mm，鉤尖長(zhǎng)0.017 mm(圖2B(i))；背聯(lián)結(jié)片呈“弓”形，兩端膨大分叉，長(zhǎng)0.060 mm，中間寬0.010 mm(0.009～0.011 mm)(圖2B(j))；7對(duì)邊緣小鉤，為形態(tài)相似的胚鉤，鉤尖凸起，長(zhǎng)0.011 mm(圖2B(k))；交接器為細(xì)長(zhǎng)彎管，長(zhǎng)0.085 mm，基部稍膨大，連接于杯形基座，有圓形支持片(圖2C)(表2)。

A—病魚體型消瘦，尾鰭、臀鰭缺損;B—肝臟、脾臟充血;C—鰓上有大量的海盤蟲(chóng)；D—鰓絲分布蟲(chóng)卵及黏液(ⅰ—黏液，ⅱ—蟲(chóng)卵，?！x(chóng)體)。A—sick fish with emaciated body,defect of caudal and anal fins;B—severely hemorrhagic liver and spleen;C—a large number of Haliotrema sp.on the gills;D—worm eggs and mucus on gill filaments(ⅰ—mucus，ⅱ—worm eggs，?！獁orm body).圖1 患海盤蟲(chóng)病的雙斑東方鲀Fig.1 Twin-spot puffer Takifugu bimaculatus with haliotremasis

通過(guò)與已報(bào)道的海盤蟲(chóng)測(cè)量值進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)(表2)，本文描述蟲(chóng)種除了蟲(chóng)體和咽徑稍大外，與文獻(xiàn)[16]描述的雙裂海盤蟲(chóng)最相似，包括幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)(背、腹中央大鉤、聯(lián)接片和邊緣小鉤)形態(tài)和量度相似，背中央大鉤外側(cè)有裂刻，交接器為簡(jiǎn)單細(xì)長(zhǎng)彎管，連接杯形基座，有一圓形支持片。

表2 寄生于不同宿主的海盤蟲(chóng)形態(tài)特征比較Tab.2 Morphological comparison of parasite Haliotrema sp.from different hosts mm

A—蟲(chóng)體整體圖；B—后吸器幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)；C—交接器。a—頭器；b—眼點(diǎn)；c—咽；d—交接器；e—卵黃腺；f—后吸器；g—腹中央大鉤；h—腹聯(lián)結(jié)片；i—背中央大鉤；j—背聯(lián)結(jié)片；k—邊緣小鉤。A—dorsal view of a whole worm;B—chitin structure of haptor;C—copulatory complex.a—head organ;b—eyespot;c—pharynx;d—copulatory complex;e—vitelline gland;f—haptor;g—ventral anchor;h—ventral bar;i—dorsal anchor;j—dorsal bar;k—hooklet.圖2 雙裂海盤蟲(chóng)的顯微觀察Fig.2 Microscopic observation of parasite Haliotrema bilobatus

故認(rèn)為二者是同一蟲(chóng)種，屬于雙裂海盤蟲(chóng)H.bilobatus，而雙斑東方鲀?yōu)槠渌拗餍掠涗洝?/p>

2.5 蟲(chóng)體18S rDNA序列分析

測(cè)得蟲(chóng)體18S rDNA序列長(zhǎng)度為1 282 bp，上傳序列至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(編號(hào)ZL-2019，登錄號(hào)MN309840.1)，通過(guò)BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示,編號(hào)ZL-2019的蟲(chóng)體18S rDNA序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中櫛齒刺尾鯛海盤蟲(chóng)H.ctenochaeti(登錄號(hào)EU836220.1)、絲蝴蝶魚海盤蟲(chóng)H.aurigae(登錄號(hào)AY820610.1)和大棘海盤蟲(chóng)H.macracantha(登錄號(hào)EU836229.1)等基因序列相似，一致性達(dá)97.68%～98.30%，這表明該蟲(chóng)體為海盤蟲(chóng)蟲(chóng)種。

選取18S rDNA序列相似度高的海盤蟲(chóng)蟲(chóng)種繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果顯示，雙裂海盤蟲(chóng)單為獨(dú)立分支，然后與絲蝴蝶魚海盤蟲(chóng)、大棘海盤蟲(chóng)等聚為一支，這表明與他們親緣關(guān)系較近(圖3)。

圖3 基于18S rDNA序列構(gòu)建的海盤蟲(chóng)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of Haliotrema sp.based on the gene sequence of 18S rDNA

2.6 蟲(chóng)體28S rDNA序列分析

測(cè)得蟲(chóng)體28S rDNA(C1～D2區(qū))核酸片段長(zhǎng)度為886 bp，上傳序列至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(編號(hào)ZL-2019，登錄號(hào)MN310381.1)，通過(guò)BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示，編號(hào)ZL-2019的蟲(chóng)體28S rDNA序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中鐮莖海盤蟲(chóng)H.sicklocirrus(登錄號(hào)KJ571015.1)基因序列最相似，但一致性僅為90.28%，而與東沙海盤蟲(chóng)H.dongshaense(登錄號(hào)KJ571014.1)、絲蝴蝶魚海盤蟲(chóng)H.aurigae(登錄號(hào)EU836198.1)一致性分別為88.49%和88.26%，為基因數(shù)據(jù)庫(kù)未登記海盤蟲(chóng)屬蟲(chóng)種。

選取相似或相近的12種單殖吸蟲(chóng)28S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖4)，結(jié)果顯示，蟲(chóng)體ZL-2019首先單為獨(dú)立分支，然后與鐮莖海盤蟲(chóng)、東沙海盤蟲(chóng)、絲蝴蝶魚海盤蟲(chóng)等海盤蟲(chóng)聚為一大支，這表明蟲(chóng)體ZL-2019與他們的親緣關(guān)系相對(duì)較近；而大鉤海盤蟲(chóng)H.magnihamus、大彎管海盤蟲(chóng)H.grossecurvitubus、駝背鱸海盤蟲(chóng)H.cromileptis等海盤蟲(chóng)聚為另一大支，這表明蟲(chóng)體ZL-2019與他們的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖4 基于28S rDNA序列(C1～D2區(qū))構(gòu)建的海盤蟲(chóng)及其他外類群系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of Haliotrema sp.and out groups based on the gene sequence of 28S rDNA (C1-D2 dormain)

2.7 鰓組織病理學(xué)觀察

雙斑東方鲀發(fā)生海盤蟲(chóng)病，病變損害最嚴(yán)重的器官是鰓。通過(guò)病魚鰓組織病理學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)海盤蟲(chóng)蟲(chóng)體依托中央大鉤或邊緣小鉤寄生于鰓絲基部(圖5A)，或鰓絲中部(圖5B)，或次級(jí)鰓絲組織軟骨上(圖5C)，并機(jī)械擠壓導(dǎo)致次級(jí)鰓絲變形，鰓小片傾斜排列且扭曲，破壞了鰓絲組織完整性；寄生周圍區(qū)域的初級(jí)鰓絲上皮組織出現(xiàn)增生或腫脹，甚至造成有的上皮細(xì)胞脫落,引起鰓絲局部損傷(圖5A、B)。感染嚴(yán)重時(shí)，蟲(chóng)體寄生區(qū)域鰓小片上皮細(xì)胞壞死，鰓小片不完整或崩解，鰓小片毛細(xì)血管斷裂、出血，大量黏液浸潤(rùn)鰓絲，鰓絲間彌散解離細(xì)胞和黏液(圖5C～E)；而與蟲(chóng)體寄生處相對(duì)側(cè)的鰓上皮組織增生、增厚嚴(yán)重(圖5E)。

A—感染蟲(chóng)體寄生于鰓絲基部；B—感染蟲(chóng)體寄生鰓絲中部；C—感染蟲(chóng)體寄生于鰓絲軟骨；D、E—蟲(chóng)體嚴(yán)重感染時(shí)，鰓病變嚴(yán)重；F—鰓感染海盤蟲(chóng)和車輪蟲(chóng)。a—蟲(chóng)體；b—中央大鉤；c—鰓小片；d—上皮細(xì)胞；e—鰓絲軟骨；f—黏液；g—紅細(xì)胞；h—毛細(xì)血管；i—車輪蟲(chóng)。A—parasites colonizing on the base of gill filaments;B—parasites colonizing on the middle of gill filaments;C—parasites colonizing on the gill filament cartilage;D and E—the pathological changes in the gill after severe infection with Haliotrema bilobatus;F—gills infected with Haliotrema and Trichodina.a—worm;b—anchor;c—gill lamella;d—epithelial cell;e—gill filament cartilage;f—mucus;g—red blood cell;h—capillary;i—Trichodina.圖5 病魚鰓組織病理切片圖Fig.5 Histological sections (H.E)of gills of the diseased fish

3 討論

3.1 雙斑東方鲀海盤蟲(chóng)病病原鑒定

海盤蟲(chóng)種類繁多，形態(tài)相近，目前種類鑒定和分類主要依據(jù)蟲(chóng)體后吸器和交接器的幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)[4-10]。本研究中，根據(jù)現(xiàn)有蟲(chóng)體形態(tài)學(xué)證據(jù)和幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)特征將雙斑東方鲀海盤蟲(chóng)病病原鑒定為雙裂海盤蟲(chóng)。雙裂海盤蟲(chóng)首次被描述記錄于1953年[18]，于1970年正式確認(rèn)為H.bilobatus，其宿主記錄為斑點(diǎn)雞籠鯧Drepanepunctata[19]，國(guó)內(nèi)學(xué)者于1993年發(fā)現(xiàn)該蟲(chóng)體，并命名為雙裂海盤蟲(chóng)[1]，袁少穎[16]于2006年發(fā)現(xiàn)星點(diǎn)東方鲀T.niphoble為其宿主記錄。本研究中則首次確認(rèn)雙裂海盤蟲(chóng)能引起養(yǎng)殖的雙斑東方鲀發(fā)病，且雙斑東方鲀?yōu)槠湫碌乃拗饔涗洝Ｉa(chǎn)過(guò)程中，作者還發(fā)現(xiàn)同一池塘養(yǎng)殖的菊黃東方鲀T.flavidus也會(huì)感染雙裂海盤蟲(chóng)病，這表明該蟲(chóng)對(duì)東方鲀屬魚類具有高度的宿主特異性。

因單殖吸蟲(chóng)種間幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)細(xì)微、差異小，常因試驗(yàn)方法、觀察角度(顯微)及測(cè)量誤差等因素造成研究者描述形態(tài)有差異[20]，且宿主、地理分布和生活水溫等變化也可造成同一蟲(chóng)種形態(tài)結(jié)構(gòu)變異[21]，故依賴形態(tài)學(xué)進(jìn)行種類鑒別比較煩瑣、困難，單純依靠幾丁質(zhì)形態(tài)結(jié)構(gòu)特征鑒定闡明蟲(chóng)種間親緣關(guān)系也有一定局限性[22]。近年來(lái)，分子生物學(xué)技術(shù)廣泛應(yīng)用于單殖吸蟲(chóng)分類鑒定和系統(tǒng)發(fā)育研究[23-26]，包括利用18S rDNA、28S rDNA和rDNA-ITS等靶基因序列分析，該技術(shù)為海盤蟲(chóng)屬種類鑒別、種間親緣關(guān)系和系統(tǒng)發(fā)育等研究提供有效補(bǔ)充途徑[27]。為了對(duì)雙斑東方鲀海盤蟲(chóng)病病原的了解更加全面,本研究中在形態(tài)學(xué)鑒別基礎(chǔ)上,選用單殖吸蟲(chóng)界常用的核糖體18S rDNA和28S rDNA作為分子標(biāo)記，對(duì)病原進(jìn)行分子生物學(xué)測(cè)定，結(jié)果表明，雙裂海盤蟲(chóng)為NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)未登記海盤蟲(chóng)屬蟲(chóng)種，其18S rDNA序列與櫛齒刺尾鯛海盤蟲(chóng)、絲蝴蝶魚海盤蟲(chóng)等蟲(chóng)體相似，一致性達(dá)97.68%～98.30%；而28S rDNA序列與鐮莖海盤蟲(chóng)最相似，但有9.72%的差異，與鐮莖海盤蟲(chóng)、東沙海盤蟲(chóng)和絲蝴蝶魚海盤蟲(chóng)等親緣關(guān)系較近。

3.2 雙斑東方鲀海盤蟲(chóng)病的發(fā)生

海盤蟲(chóng)病是魚類養(yǎng)殖生產(chǎn)上主要致死性病害之一，主要危害是大量蟲(chóng)體寄生于鰓上，造成養(yǎng)殖魚類鰓黏液增多，呼吸困難，食欲減退而死亡，或?qū)е缕渌≡?包括車輪蟲(chóng)(圖5F)、刺激隱核蟲(chóng)、瓣體蟲(chóng)等)繼發(fā)感染從而造成死亡。鰓是魚類最重要的呼吸器官，是魚體與外界氣體交換的場(chǎng)所，具有參與滲透調(diào)節(jié)和氯化物排泄等功能[28]。從患病魚鰓組織病理學(xué)分析，雙裂海盤蟲(chóng)大量感染導(dǎo)致雙斑東方鲀病魚鰓受損嚴(yán)重，其損傷結(jié)果為蟲(chóng)體用后吸器固著于鰓并做尺蠖式移動(dòng)，造成鰓絲機(jī)械損傷，致使上皮組織增生，大量黏液浸潤(rùn)，甚至引起鰓病變或出血，阻礙鰓組織與外界環(huán)境氣體交換，影響了鰓滲透調(diào)節(jié)、排泄等功能；重度感染，引起鰓組織壞死、崩解，導(dǎo)致病魚呼吸困難，造成魚體缺氧死亡。該研究結(jié)果與李立偉等[13]報(bào)道的花鱸逆轉(zhuǎn)指環(huán)蟲(chóng)病病理學(xué)、李海燕等[29]報(bào)道的叉尾斗魚關(guān)睪蟲(chóng)病鰓組織病理學(xué)、蘇翠蓮[30]報(bào)道的黃鰭鯛鱗盤蟲(chóng)病鰓組織病理學(xué)中多鉤類單殖吸蟲(chóng)病鰓病理的研究結(jié)果基本一致。

不同生長(zhǎng)發(fā)育階段的雙斑東方鲀均可發(fā)生海盤蟲(chóng)病，但海盤蟲(chóng)感染強(qiáng)度不同，幼魚階段中度感染即可嚴(yán)重發(fā)病，成魚階段則需重度感染才能嚴(yán)重發(fā)病，這可能與不同生長(zhǎng)發(fā)育階段宿主魚耐受程度及鰓面積大小有關(guān)。有研究報(bào)道[31-32]認(rèn)為，單殖吸蟲(chóng)平均感染強(qiáng)度與宿主魚體長(zhǎng)呈顯著正相關(guān)，而雙裂海盤蟲(chóng)感染強(qiáng)度是否與雙斑東方鲀體長(zhǎng)呈正相關(guān)還有待進(jìn)一步考證。郝翠蘭等[33]認(rèn)為，單殖吸蟲(chóng)對(duì)宿主魚不同鰓片具有明顯選擇性，而本研究中發(fā)現(xiàn)雙裂海盤蟲(chóng)對(duì)雙斑東方鲀左、右鰓腔的分布無(wú)選擇性，但對(duì)左、右鰓腔的居中鰓片有寄生偏好。作者在2016—2019年常規(guī)調(diào)查期間，福建漳浦東坂、云霄前江等東方鲀池塘養(yǎng)殖主產(chǎn)區(qū)在春末夏初和秋季也時(shí)有發(fā)生由雙裂海盤蟲(chóng)感染引起雙斑東方鲀海盤蟲(chóng)病，這表明雙裂海盤蟲(chóng)感染是池塘養(yǎng)殖雙斑東方鲀發(fā)生海盤蟲(chóng)病的主要病因。劉君[17]研究發(fā)現(xiàn)，黑鯛海盤蟲(chóng)可大量寄生于海區(qū)網(wǎng)箱養(yǎng)殖的雙斑東方鲀鰓上，其交接器呈“S”狀，背聯(lián)結(jié)片呈倒“V”形，腹聯(lián)結(jié)片呈“一”字形，與雙裂海盤蟲(chóng)差異明顯，聯(lián)結(jié)片和中央大鉤度量均比雙裂海盤蟲(chóng)小(表2)。但本研究中在池塘養(yǎng)殖雙斑東方鲀過(guò)程中未發(fā)現(xiàn)有黑鯛海盤蟲(chóng)感染，猜測(cè)發(fā)生海盤蟲(chóng)病病原種類可能與東方鲀養(yǎng)殖環(huán)境相關(guān)。目前生產(chǎn)上可用漁用敵百蟲(chóng)或甲苯咪唑等抗單殖吸蟲(chóng)藥物(敏感魚類慎用)對(duì)海水養(yǎng)殖魚類海盤蟲(chóng)病進(jìn)行有效防治，同時(shí)，還需要伴飼投喂抗生素以防止病魚發(fā)生繼發(fā)性細(xì)菌感染。

國(guó)內(nèi)外對(duì)于海水養(yǎng)殖魚類海盤蟲(chóng)病的流行病學(xué)、病原鑒定和組織病理學(xué)的研究較少，所以本研究中開(kāi)展具有一定的實(shí)踐意義，該研究可為海水養(yǎng)殖魚類海盤蟲(chóng)病的病原鑒定和防控提供技術(shù)參考依據(jù)。

4 結(jié)論

1)本研究中確認(rèn)了雙裂海盤蟲(chóng)為福建池塘養(yǎng)殖雙斑東方鲀海盤蟲(chóng)病的感染病原，這是雙裂海盤蟲(chóng)引起雙斑東方鲀海盤蟲(chóng)病在國(guó)內(nèi)的首次報(bào)道。該病在春末夏初和秋季易發(fā)。

2)從鰓組織病理學(xué)分析，雙裂海盤蟲(chóng)大量感染導(dǎo)致發(fā)生海盤蟲(chóng)病的雙斑東方鲀病魚鰓受損嚴(yán)重。重度感染會(huì)引起鰓組織壞死、崩解，導(dǎo)致病魚呼吸困難而死亡。