胡惠玲，汪志文，黎源，魯義善*，簡紀(jì)常

(1.廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088；2.廣東海洋大學(xué)深圳研究院，廣東省水生動(dòng)物健康評估工程技術(shù)研究中心，深圳市海水經(jīng)濟(jì)動(dòng)物種苗健康評價(jià)公共技術(shù)平臺(tái)，廣東 深圳 518120)

Scara3(scavenger receptor class a member 3)是清道夫受體家族的一員，該基因編碼巨噬細(xì)胞清道夫受體樣蛋白[1]。該蛋白已被證明能消耗活性氧且氧化應(yīng)激能誘導(dǎo)Scara3的表達(dá)，因此，Scara3也被稱為細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)蛋白(CSR)[2]。1998年，從人類胎兒腦中克隆得到Scara3全長基因,并確定該基因位于8p21染色體[3]。人Scara3 cDNA編碼606個(gè)氨基酸，含有3個(gè)不同結(jié)構(gòu)域，即膠原(Collagen)結(jié)構(gòu)域、α-螺旋線圈結(jié)構(gòu)域和跨膜區(qū)，其N端跨膜區(qū)與4個(gè)亮氨酸拉鏈重疊，還有多個(gè)磷酸化和糖基化位點(diǎn)[3-4]。對哺乳動(dòng)物研究表明，Scara3與脂質(zhì)代謝有關(guān)，通過與聚陰離子配體結(jié)合，有助于樹突細(xì)胞和巨噬細(xì)胞獲取脂肪酸[4-5]。Scara3與骨髓瘤[1]、手足口病[6]、肥胖癥[7]、肝癌[8]和前列腺癌[9]等的診斷和治療有關(guān)。對肝癌研究發(fā)現(xiàn)，Scara3導(dǎo)致HPIP蛋白失活并抑制PI3K/AKT通路的激活,從而抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[8]。對前列腺癌研究發(fā)現(xiàn)，Scara3的C末端可與裂解和聚腺苷酸化特異性因子3(CPSF3)結(jié)合，抑制CPSF3活性和成熟的mRNA，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[9]。在人類癌癥中,Scara3可由紫外線、X光照射或活性氧物質(zhì)誘導(dǎo)，在誘導(dǎo)時(shí)以高親和力結(jié)合XIAP，干擾XIAP與半胱天冬酶的相互作用，抑制其活性，從而導(dǎo)致Scara3表達(dá)的細(xì)胞凋亡[10]。

目前，已鑒定出Scara3的硬骨魚類有大黃魚Larimichthyscrocea[11]、鯉Cyprinuscarpio[12]、大鱗大馬哈魚Oncorhynchustshawytscha[13]和虹鱒O.mykiss[14]，其中，大黃魚被溶藻弧菌感染后Scara3表達(dá)上調(diào)，鯉在整個(gè)發(fā)育階段Scara3表現(xiàn)出高表達(dá)且被嗜水氣單胞菌感染后表達(dá)顯著上調(diào)，Scara3作為大鱗大馬哈魚CHSS細(xì)胞表面受體促進(jìn)其與dsRNA結(jié)合介導(dǎo)的先天免疫，Scara3在虹鱒上皮細(xì)胞系結(jié)合LDL和dsRNA(Poly I:C)。這些研究均表明，Scara3在魚類的機(jī)體免疫中具有重要作用。

目前，尼羅羅非魚已成為重要的養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)水產(chǎn)品，2019年中國羅非魚產(chǎn)量約占全球總產(chǎn)量的四分之一，位居全球第一，國際市場需求量也逐年增加[15]。羅非魚蛋白質(zhì)含量高，必需氨基酸種類豐富，是營養(yǎng)全面的優(yōu)質(zhì)蛋白來源。近年來，由于鏈球菌病的暴發(fā)，造成了羅非魚較高的死亡率，并嚴(yán)重威脅到羅非魚產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[16]。Scara3作為一種重要的模式識(shí)別受體(PRRs)，在機(jī)體免疫中發(fā)揮重要功能，但有關(guān)羅非魚Scara3基因研究目前尚未見報(bào)道。為了更好地控制羅非魚疾病，本研究中通過對尼羅羅非魚Scara3基因的克隆、序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化分析，比較該基因在健康尼羅羅非魚組織，以及在細(xì)菌和病毒感染后的表達(dá)情況，并進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，以期為探究Scara3在尼羅羅非魚病菌防控及免疫反應(yīng)中的作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用尼羅羅非魚購自廣東省湛江市某魚類養(yǎng)殖場，體質(zhì)量為(100±10)g。在廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(28±2)℃、24 h循環(huán)水系統(tǒng)中暫養(yǎng)備用。

試驗(yàn)試劑：克隆感受態(tài)細(xì)胞Trans1-T1，以及RNA提取試劑盒(TransZol Up Plus RNA)、cDNA合成試劑盒、qRT-PCR試劑盒(TransStart Green qPCR SuperMix)均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Primer STAR Max、克隆質(zhì)粒 pMD18-T載體、HindIII、XhoI限制性內(nèi)切酶和反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Reverse Transcriptase M-MLV)均購自TaKaRa公司(大連)；PCR 產(chǎn)物純化試劑盒和RNAlater購自Thermo公司。HEK-293T來自廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司廣州分公司合成。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室的羅非魚轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，預(yù)測尼羅羅非魚Scara3基因序列，利用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)Scara3引物，并根據(jù)Scara3的開放閱讀框(ORF)區(qū)設(shè)計(jì)熒光定量PCR和亞細(xì)胞定位特異性引物。試驗(yàn)所用引物見表1。

表1 試驗(yàn)引物Tab.1 Primers used in the experiment

1.2.2 尼羅羅非魚總RNA的提取及cDNA合成 尼羅羅非魚在實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)4周后，取健康羅非魚6尾，收集其血液、頭腎、腦、胸腺、鰓、脾臟、肝臟、皮膚、腸道和肌肉共10個(gè)組織樣品各10～20 mg，用液氮速凍后置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

選取規(guī)格較大的羅非魚，取頭腎組織，分離尼羅羅非魚頭腎白細(xì)胞后立即開始刺激，將細(xì)胞分為4組，第1組添加終濃度為5 μg/mL的無乳鏈球菌Streptococcusagalactiae，第2組添加終濃度為5 μg/mL的脂多糖(LPS)，第3組添加終濃度為5 μg/mL的聚肌胞苷酸(Poly I:C)，第4組添加等量磷酸鹽緩沖液(PBS)作為對照組，每組設(shè)3個(gè)平行。分別在刺激后 6、12、24、48 h 時(shí)收集細(xì)胞培養(yǎng)液于1.5 mL離心管中，離心后棄上清液；加入1 mL Trizol UP，吹打混勻后，于-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

取健康尼羅羅非魚6尾，2個(gè)試驗(yàn)組分別通過腹腔注射濃度為1×107cfu/mL的無乳鏈球菌0.1 mL和濃度為0.2 mg/mL的Poly I:C 0.1 mL，對照組注射滅菌的PBS 0.1 mL，每組設(shè)3個(gè)平行。分別在感染后6、12、24、48、72、96 h時(shí)，取其腸道、脾臟和頭腎組織各10～20 mg，迅速置入2.0 mL去RNA離心管中，于RNAlater中浸泡，用液氮速凍后于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

按照RNA提取試劑盒(TransZol Up Plus RNA)說明書提取羅非魚各組織RNA，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Reverse Transcriptase M-MLV)說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，再按照cDNA合成試劑盒(TransScript First-Strand cDNA Synthesis super mix)說明書合成cDNA。

1.2.3 尼羅羅非魚Scara3基因克隆 以羅非魚腸道cDNA為模板，利用引物Scara3-475F與Scara3-2380R(表1)對羅非魚Scara3基因的編碼序列片段進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(20 μL)：5×Primer STAR Max(Premix)10 μL，cDNA 模板(腸道組織)0.5 μL，Scara3基因上、下游引物各1 μL，ddH2O 7.5 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃下預(yù)變性5 min；94 ℃下循環(huán)變性15 s，55 ℃下退火復(fù)性30 s，72 ℃下延伸1 min 50 s，共進(jìn)行33個(gè)循環(huán)；最后在72 ℃下再延伸5 min，4 ℃下保存。反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物用凝膠電泳檢測，獲得單一目的條帶大小的片段后，擴(kuò)大擴(kuò)增體系，用電泳檢測，PCR產(chǎn)物純化回收后連接pMD-18T載體，然后轉(zhuǎn)化到Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中，涂板挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR檢測，挑取陽性菌送生工生物工程(上海)股份有限公司廣州分公司進(jìn)行測序。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 利用NCBI的ORFfinder查找ORF，采用PSITE進(jìn)行蛋白功能位點(diǎn)分析，采用ExPASy進(jìn)行蛋白理化性質(zhì)及親疏水性分析，采用Phobius和SMART分別進(jìn)行氨基酸序列的跨膜結(jié)構(gòu)域分析和結(jié)構(gòu)域預(yù)測，采用SOPMA和SWISS-MODEL分別預(yù)測蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)，并用PyMOL軟件進(jìn)行分析，采用ClustalX和Genedoc軟件進(jìn)行多序列比對分析，采用MEGA 6軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.5 亞細(xì)胞定位試驗(yàn) 構(gòu)建 pEGFP-N1-Scara3真核表達(dá)載體，限制性酶切位點(diǎn)為XhoI和HindIII。真核表達(dá)去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取參見E.Z.N.A.Endo-Free Plasmid DNA Mini Kit說明書。

將HEK-293T細(xì)胞接種到24孔板，培養(yǎng)18 h后分別轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pEGFP-N1和重組質(zhì)粒pEGFP-N1-Scara3。孵育48 h 后，經(jīng) PBS 洗滌2次的細(xì)胞采用體積分?jǐn)?shù) 4%的多聚甲醛固定，用PBS洗滌2次。滴加1 μg/mL 4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)進(jìn)行細(xì)胞核染色。最后用PBS 清洗 2次，加入抗熒光猝滅封片劑封片，于激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量分析 根據(jù)尼羅羅非魚Scara3序列的保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物(表1)，以β-actin作為內(nèi)參基因，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)平行復(fù)孔。用qRT-PCR分析Scara3在健康尼羅羅非魚各組織的分布，以及經(jīng)不同刺激物刺激頭腎白細(xì)胞后的相對表達(dá)量和經(jīng)無乳鏈球菌和PolyI:C感染后的腸道、頭腎和脾臟組織表達(dá)情況。

PCR反應(yīng)體系(10 μL)：Super Mix 5 μL，cDNA 模板(原始模板稀釋10倍)0.3 μL，正、反向引物各0.2 μL，ddH2O 4.3 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃下預(yù)變性300 s；95 ℃下循環(huán)變性10 s，60 ℃下退火復(fù)性15 s，72 ℃下延伸15 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后用2-△△Ct法計(jì)算基因的相對表達(dá)量，組織表達(dá)以肝臟為基線(1.0)，病原微生物刺激后的基因表達(dá)以對照組為基線(1.0)。使用 GraphPad Prism進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及圖表處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 尼羅羅非魚Scara3基因的克隆及生物信息學(xué)分析

2.1.1Scara3基因克隆及蛋白理化性質(zhì)預(yù)測 克隆得到尼羅羅非魚Scara3基因(GenBank登錄號：XM_005475068.4)cDNA全長3 889 bp，ORF長度為1 827 bp，可編碼608個(gè)氨基酸(圖1)。預(yù)測編碼的Scara3蛋白理論相對分子質(zhì)量為66 740，等電點(diǎn)為6.69，分子式為C2883H4622N852O922S24，其中，甘氨酸(Gly)含量最高(10.2%)，亮氨酸(Leu)次之(8.9%)，色氨酸(Trp)含量最低(0.5%)，帶正電荷的氨基酸(Arg+Lys)68個(gè)，帶負(fù)電荷的氨基酸(Asp+Glu)71個(gè)。該蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為35.22，歸為不穩(wěn)定蛋白；該蛋白的脂溶指數(shù)(aliphatic index)為73.27，平均親水值(GRAVY)為-0.660，屬親水性蛋白。用SoftBerry-Psite預(yù)測該蛋白的功能位點(diǎn)，表明其氨基酸序列具有11個(gè)N-糖基化位點(diǎn)、9個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)、9個(gè)微體細(xì)胞C端靶信號、7個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、5個(gè)N-豆蔻酰化位點(diǎn)、1個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)、1個(gè)cAMP和cGMP依賴的蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)和2個(gè)亮氨酸拉鏈。通過SMART分析保守結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)其存在跨膜結(jié)構(gòu)域、螺旋結(jié)構(gòu)域和膠原(Collagen)結(jié)構(gòu)域。

* 終止子 terminator。

2.1.2 蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)預(yù)測 分析發(fā)現(xiàn)，Scara3蛋白的二級結(jié)構(gòu)中，由206個(gè)氨基酸組成無規(guī)則卷曲，占33.88%；由386個(gè)氨基酸組成α-螺旋，占63.49%；由11個(gè)氨基酸組成β折疊結(jié)構(gòu)，占1.81%；由5個(gè)氨基酸組成延伸鏈，占0.82%。該蛋白的二級結(jié)構(gòu)中有超過半數(shù)的氨基酸參與形成α-螺旋結(jié)構(gòu)，說明該蛋白整體處于一個(gè)以α-螺旋為主的二級結(jié)構(gòu)中。利用SWISS-MODLE對Scara3進(jìn)行同源建模，然后使用PyMOL進(jìn)行3D結(jié)構(gòu)可視化，并和人的Scara3三維結(jié)構(gòu)圖進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)羅非魚與哺乳動(dòng)物的Scara3蛋白三維結(jié)構(gòu)相似(圖2)。

圖2 尼羅羅非魚與人類Scara3蛋白的三維結(jié)構(gòu)Fig.2 Three-dimensional structures of Scara3 in Nile tilapia Oreochromis niloticus and Homo sapiens

2.1.3 氨基酸序列的同源性及系統(tǒng)進(jìn)化分析 采用ClustalX軟件將尼羅羅非魚Scara3與其他物種進(jìn)行多序列比對，結(jié)果顯示，尼羅羅非魚與大黃魚、鯉、河鱸、大鼠及人類的Scara3氨基酸序列一致性分別為79.87%、67.38%、81.59%、47.54%、47.01%，其中與人類的同源性最低(圖3)。利用MEGA 6軟件構(gòu)建尼羅羅非魚與其他物種Scara3氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹，包括人類、家鼠、斑馬魚、羅非魚、鸚鵡、矛隼、蜥蜴、蛙等19個(gè)物種，結(jié)果顯示，尼羅羅非魚與其他多數(shù)硬骨魚類聚為一支，而鳥類、爬蟲類、兩棲動(dòng)物和哺乳動(dòng)物各聚為一支(圖4)。

圖3 尼羅羅非魚與其他物種Scara3氨基酸的多重序列比對Fig.3 Comparison of multi-alignment of Scara3 amino acid sequence of Nile tilapia Oreochromis niloticus with other species

圖4 尼羅羅非魚與其他物種Scara3氨基酸序列的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 NJ Phylogenetic tree of Scara3 amino acid sequences of Nile tilapia Oreochromis niloticus and other species

2.2 Scara3蛋白的亞細(xì)胞定位

構(gòu)建真核表達(dá)重組質(zhì)粒pEGFP-N1-Scara3，通過在HEK-293T細(xì)胞中表達(dá)pEGFP-N1-Scara3質(zhì)粒，產(chǎn)生該質(zhì)粒的融合蛋白，確定Scara3蛋白的亞細(xì)胞定位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Scara3蛋白在HEK-293T細(xì)胞的全細(xì)胞中均分布有綠色熒光，這表明Scara3蛋白在全細(xì)胞中表達(dá)(圖5)。

圖5 Scara3蛋白在HEK-293T中的亞細(xì)胞定位Fig.5 Subcellular localization of Scara3 in HEK-293T cells by fluorescence microscopy

2.3 尼羅羅非魚Scara3基因的組織分布

通過羅氏LightCycler96定量PCR儀進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)分析，檢測健康尼羅羅非魚各個(gè)組織中Scara3基因的表達(dá)量，結(jié)果表明，Scara3基因在羅非魚各個(gè)組織中均能廣泛表達(dá)，在血液組織中表達(dá)量最高(P<0.05)，其次是腸道、皮膚、胸腺、腦、肝臟和肌肉，在脾臟、鰓和頭腎中表達(dá)量較少(P<0.05)(圖6)。

標(biāo)有不同字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)。The means with different letters are significantly different in the groups at the 0.05 probability level,and the means with the same letter are not significant differences.圖6 Scara3在不同組織中的表達(dá)量Fig.6 Expression level of Scara3 in different tissues

2.4 不同刺激物刺激羅非魚頭腎白細(xì)胞后Scara3的表達(dá)模式

采用Percoll分離法分離獲得羅非魚頭腎白細(xì)胞，采用 LPS、Poly I:C和滅活后的無乳鏈球菌孵育細(xì)胞，然后檢測6、12、24、48 h時(shí)細(xì)胞中Scara3基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示：LPS刺激羅非魚頭腎白細(xì)胞后，Scara3在6 h時(shí)極顯著上調(diào)(P<0.01)，12 h后逐漸下降；Poly I:C刺激頭腎白細(xì)胞后Scara3表達(dá)量呈上升趨勢，在48 h時(shí)達(dá)到高峰(P<0.01)；滅活的無乳鏈球菌刺激頭腎白細(xì)胞后Scara3表達(dá)量逐漸上調(diào)，在24 h時(shí)達(dá)到峰值(P<0.01)，48 h后緩慢下降(圖7)。

*表示與對照組有顯著性差異(P<0.05)；**表示與對照組有極顯著性差異(P<0.01),下同。*means significant difference compared with the control (P<0.05)；**means very significant difference compared with the control(P<0.01),et sequentia.圖7 不同刺激物孵育頭腎白細(xì)胞后Scara3的時(shí)序表達(dá)Fig.7 Temporal expression of Scara3 in head kidney leukocyte of immunized Nile tilapia Oreochromis niloticus

2.5 無乳鏈球菌和Poly I:C刺激后Scara3的組織表達(dá)模式

經(jīng)滅活的無乳鏈球菌感染尼羅羅非魚后，在頭腎中,Scara3基因表達(dá)量6 h時(shí)出現(xiàn)表達(dá)高峰(P>0.05)，而后逐漸降低；在脾臟中，表達(dá)量持續(xù)上升，在24 h時(shí)達(dá)到最大值(P<0.01),而后迅速恢復(fù)到正常水平；在腸道中,剛開始刺激時(shí)表達(dá)量上調(diào)，12 h時(shí)達(dá)到最大值(P<0.01)，而后恢復(fù)到正常水平(圖8(a))。

經(jīng)Poly I:C病毒類似物感染尼羅羅非魚后，腸道、頭腎、脾臟組織中Scara3表達(dá)量在24 h時(shí)均有極顯著上調(diào)(P<0.01)(圖8(b))。

圖8 滅活無乳鏈球菌和Poly I:C刺激后Scara3在3個(gè)組織中的時(shí)序表達(dá)Fig.8 Temporal expression of Scara3 stimulated by inactivated Streptococcus agalactiae and Poly I:C in three tissues

3 討論

3.1 尼羅羅非魚Scara3基因的結(jié)構(gòu)特征

在前期羅非魚全長轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)中克隆鑒定得到尼羅羅非魚Scara3 cDNA全長序列3 889 bp，ORF區(qū)為1 827 bp，編碼608個(gè)氨基酸。多序列比對結(jié)果顯示，尼羅羅非魚Scara3序列與河鱸的同源性較高(81.59%)，在構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹中，尼羅羅非魚Scara3與奧利亞羅非魚親緣關(guān)系最近，聚為一支。此外，推導(dǎo)的Scara3氨基酸序列具有Collagen結(jié)構(gòu)域(位于483 aa～547 aa)，通過對比發(fā)現(xiàn)，Collagen結(jié)構(gòu)域在不同物種中均較保守，只是長度、位置有所差異，但Collagen結(jié)構(gòu)域均與受體三螺旋結(jié)構(gòu)的形成相關(guān)[17]。Collagen結(jié)構(gòu)域是重復(fù)的G-X-Y序列，多肽鏈形成一個(gè)三重螺旋，參與形成細(xì)胞外結(jié)構(gòu)蛋白，可指引跨膜結(jié)構(gòu)的形成[18]。重復(fù)序列中G位置總為甘氨酸，X、Y位置為任何殘基，常見的三聯(lián)體Gly-Pro-Hyp，膠原被脯氨酸羥化酶修飾形成羥基脯氨酸殘基，羥基化缺陷可導(dǎo)致維生素C缺乏病[19-20]。Collagen結(jié)構(gòu)域具有較高的序列及功能一致性，羅非魚和智人的三維結(jié)構(gòu)也表現(xiàn)出較高的相似性，說明Scara3在魚類與哺乳類進(jìn)化上高度保守。

3.2 尼羅羅非魚Scara3基因的組織表達(dá)模式

本研究表明，Scara3在健康尼羅羅非魚各組織及器官中均有表達(dá)，但其在血液、腸道、皮膚和肝臟等先天性免疫組織中的表達(dá)量較高，最低表達(dá)量出現(xiàn)在頭腎中，這與對鯉[12]、虹鱒[14]的研究結(jié)果類似，但與大黃魚[11]研究中的腎、腸表達(dá)量較高的結(jié)果相反。Scara3基因在羅非魚、大黃魚、鯉和虹鱒中的研究結(jié)果存在差異，可能是Scara3基因表達(dá)存在物種特異性，大菱鲆Scophthalmusmaximus[21]、大黃魚[11]和虹鱒[14]中清道夫受體基因scara5中也存在這種現(xiàn)象。本研究中，Scara3在羅非魚血液中表達(dá)量最高，可能是因?yàn)檠菏囚~體的重要免疫場所，在魚類免疫中發(fā)揮著重要的作用，血細(xì)胞是重要的免疫細(xì)胞，白細(xì)胞直接參與免疫應(yīng)答及其相關(guān)的免疫應(yīng)答過程[22-24]，由此推測，Scara3基因參與羅非魚的免疫應(yīng)答過程。皮膚和腸道是羅非魚重要的黏膜免疫組織，且均附著有淋巴組織，分布著大量的淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞等，皮膚還作為一個(gè)重要的屏障，可防止水分損失和外來分子及病原體的進(jìn)入[25-26]。本研究中，Scara3基因在羅非魚皮膚和腸道組織中的表達(dá)量較高，說明其在宿主抵御病原微生物侵襲的免疫應(yīng)答過程中具有重要的作用。

3.3 3種不同刺激物刺激頭腎白細(xì)胞后Scara3基因的表達(dá)特征

本研究中，通過 LPS、Poly I:C和滅活后的無乳鏈球菌孵育刺激尼羅羅非魚頭腎白細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)LPS刺激后Scara3迅速顯著上調(diào)并于6 h時(shí)達(dá)到表達(dá)高峰，無乳鏈球菌和Poly I:C刺激后Scara3也在發(fā)生上調(diào)，但是明顯滯后，分別在24 h和48 h時(shí)才達(dá)到表達(dá)高峰，表明Scara3對LPS的刺激更為敏感[27]。LPS可以觸發(fā)魚白細(xì)胞產(chǎn)生炎癥介質(zhì)，對青斑、河豚Tetraodonnigroviridis的試驗(yàn)表明，清道夫受體基因SR參與清除魚類宿主防御中的LPS識(shí)別分子[28]。無乳鏈球菌刺激后Scara3的表達(dá)上調(diào)，與小鼠試驗(yàn)中清道夫受體基因SR-A抵御金黃色葡萄球菌和其他革蘭氏陽性菌結(jié)果一致[29]。對大鱗大馬哈魚試驗(yàn)證明，SR-A促進(jìn)細(xì)胞和dsRNA的結(jié)合[13]，dsRNA作為病毒的病原分子模式，Poly I:C與其結(jié)構(gòu)類似[30]。綜上，說明Scara3在對抗微生物感染中具有重要的免疫作用。

3.4 無乳鏈球菌和Poly I:C感染后Scara3基因的組織表達(dá)變化

腸道是主要的外周淋巴器官，具有免疫屏障的作用，細(xì)菌感染后通過產(chǎn)生抗菌蛋白來識(shí)別清除病原。本研究中，無乳鏈球菌感染后，羅非魚腸道、頭腎、脾臟組織中Scara3的表達(dá)量呈現(xiàn)先上調(diào)后下降趨勢，腸道中該基因在12 h時(shí)表達(dá)量顯著上升，脾臟中該基因在后一個(gè)時(shí)間段24 h時(shí)達(dá)峰值，這與鯉對嗜水氣單胞菌感染表現(xiàn)類似[12]。以往研究也表明，無乳鏈球菌主要攻擊的靶器官是脾臟和頭腎，這主要是由于脾臟和頭腎是魚類主要的造血器官[31-32]，因此，本研究中尼羅羅非魚脾臟和頭腎在無乳鏈球菌感染后Scara3表達(dá)量先上調(diào)后下降。這表明，Scara3可能參與羅非魚多種免疫應(yīng)答過程。本研究中，經(jīng)Poly I:C病毒類似物刺激后，尼羅羅非魚腸道、頭腎和脾臟組織的Scara3表達(dá)量，在感染后的前6 h較對照組有增加，在24 h時(shí)顯著上調(diào)，然后逐漸恢復(fù)正常，可能與魚類先天抗病毒免疫有關(guān)[33]，48 h下調(diào)后再次上調(diào)，可能是病原入侵后,激活細(xì)胞內(nèi)抗病毒反應(yīng)導(dǎo)致機(jī)體紊亂，Scara3的表達(dá)暫時(shí)被抑制。大鱗大馬哈魚Scara3起著dsRNA細(xì)胞表面受體的作用，結(jié)合dsRNA并介導(dǎo)IFN表達(dá)[13]。與大黃魚CRFB13(IFN-y受體的亞型)頭腎中表達(dá)相似[34]，本研究中尼羅羅非魚頭腎Scara3表達(dá)量明顯高于腸道和脾臟，頭腎是免疫的關(guān)鍵器官，也是造血的主要部位，其中含有粒細(xì)胞、B細(xì)胞和T細(xì)胞，說明在感染病菌時(shí)，Scara3在頭腎組織中表現(xiàn)出重要的免疫反應(yīng)[35]。目前，針對Poly I:C刺激其他物種后Scara3的研究較少。本研究顯示，Scara3可能在不同的免疫器官參與魚類的抗病毒免疫應(yīng)答過程，但對于病毒感染的轉(zhuǎn)錄意義有待進(jìn)一步探索。細(xì)菌和病毒刺激后尼羅羅非魚Scara3表達(dá)轉(zhuǎn)錄表現(xiàn)出不同的原因，反映了細(xì)菌和病毒感染所遇信號通路不同及各組織內(nèi)Scara3活化的水平不同。這些結(jié)果表明，無乳鏈球菌感染和Poly I:C刺激均可引起Scara3基因在機(jī)體免疫反應(yīng)中表達(dá)發(fā)生改變，表明Scara3參與了羅非魚對細(xì)菌和病毒相關(guān)的免疫應(yīng)答反應(yīng)。

4 結(jié)論

1)本研究中成功克隆鑒定了尼羅羅非魚Scara3的cDNA序列,預(yù)測的Scara3氨基酸序列具有與其他物種Scara3相似的結(jié)構(gòu)特征。

2)Scara3在尼羅羅非魚血液、腸道、皮膚和肝臟等先天性免疫組織中的表達(dá)量較高，表明該基因在免疫應(yīng)答中起重要作用。

3)在無乳鏈球菌、LPS和Poly I:C刺激頭腎細(xì)胞后Scara3表達(dá)量均上調(diào)。腸道、頭腎和皮膚3個(gè)組織受到無乳鏈球菌感染和Poly I:C刺激后，表達(dá)量呈現(xiàn)顯著變化，表明Scara3基因在羅非魚抵御病原微生物入侵過程中有著重要作用。