盧克祥，許柳雄，錢衛(wèi)國

(1.上海海洋大學 海洋科學學院，上海 201306；2.浙江海洋大學 水產學院，舟山 316022)

斑馬魚Daniorerio是一種生活在緩慢流水水域的上層魚類，其生活的水環(huán)境植物茂盛、地形復雜，生物棲息地具有很大范圍的光亮度和光譜波長分布[1]。復雜水環(huán)境中的日間活動方式，表明斑馬魚具有發(fā)達的視覺能力[2]。斑馬魚是脊椎動物視覺系統(tǒng)研究中一種典型的模式生物，其視網膜具有與其他脊椎動物相同的神經元類別[3-5]。成年斑馬魚視網膜中擁有視覺感知所必需的視感受器，即視錐細胞和視桿細胞。不同類型的視細胞含有不同的感光色素，從而表現出不同的光譜敏感性，如視桿細胞的敏感峰值為500 nm，U-視錐細胞、S-視錐細胞、M-視錐細胞和L-視錐細胞的敏感峰值分別為362、415、480、570 nm[6]。不同類型視細胞共同作用決定了斑馬魚的光譜敏感性[7-8]。

視網膜電圖(ERG)是一種微創(chuàng)性的視覺研究方案，記錄了視網膜組織在光誘導下胞外場電位的變化[9]，可以用于評估動物的視覺感知[10]。Huges等[3]和Saszik等[8]曾利用視網膜電圖技術研究了明適應條件下不同發(fā)育階段斑馬魚的光譜敏感性，發(fā)現斑馬魚的明視光譜敏感性隨著年齡的增加而增加，且明適應條件下斑馬魚光譜敏感性曲線有4個峰值(360、400、500、580 nm)，并且在460、540 nm波長處發(fā)現斑馬魚光譜敏感性出現明顯的下降趨勢。Huges等[3]和Saszik等[8]的研究結果與Robinson等[6]利用分光光度計測試視細胞的光譜敏感性結果一致。Bilotta等[11]曾利用視網膜電圖技術研究了暗適應條件下不同發(fā)育階段斑馬魚的光譜敏感性，發(fā)現斑馬魚的暗視光譜敏感性會隨著年齡變化而變化，且視桿細胞對暗視光譜敏感性的貢獻隨著年齡的增加而增加。暗適應條件下斑馬魚的光譜敏感性主要由暗視視覺主導[12]，而暗視視覺受暗適應狀態(tài)的影響。Bilotta等[11]在試驗設計時暗適應時間設定為60 min，閃光刺激時間間隔設定為15 s，但未考慮斑馬魚暗適應狀態(tài)和ERG試驗中閃光刺激時間間隔對試驗結果的影響。為此，本研究中首先探究了斑馬魚ERG試驗中暗適應時間和閃光刺激時間間隔對ERG記錄的影響，并探究了斑馬魚在暗適應條件下對不同波長刺激光的ERG響應和光譜敏感性，旨在為斑馬魚ERG試驗標準化方案的確定和斑馬魚視覺生態(tài)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗魚購自上海乙諾水族科技有限公司，為體長3.5～4.0 cm的6月齡成年斑馬魚。

1.2 方法

1.2.1 暫養(yǎng)與管理 試驗前，將試驗魚在上海海洋大學海洋科學學院魚類行為實驗室的循環(huán)水槽中暫養(yǎng)兩周，暫養(yǎng)水槽尺寸為500 cm×80 cm×60 cm。暫養(yǎng)用水為曝氣后的自來水，水溫為(28±0.5)℃[13]，pH為7.0～7.5。每周更換一次循環(huán)水槽的過濾棉和30%水體。暫養(yǎng)期間,由4個100 W的全光譜LED燈(上海寸景水族有限公司)提供照明，光照周期為14 h光照(L)∶10 h黑暗(D)(光照時段為8:00—22:00)[14]，每天投喂一次人工配合飼料。

1.2.2 刺激光 采用13組10 W的集成LED燈珠作為刺激光源，波長范圍包含紫外光和可見光，峰值波長分別設定為340、365、380、400、420、440、460、480、500、520、550、585、620 nm，額定功率為10 W，LED光源參數詳見表1。刺激光經液芯光纖傳導至試驗魚眼睛處，光路中設置了電子快門和中性密度濾光片。電子快門由上位機控制，用于控制刺激時長和刺激時間間隔。中性密度濾光片用于產生不同刺激強度的光，本試驗共設置10組中性密度濾光片，光密度(OD)為0～4.5。試驗前，分別利用紫外光功率計(U-20，杭州遠方光電)和可見光功率計(TES132，泰仕)測試刺激光源在額定功率下魚眼處的輻照度。由于不同波長的刺激光在相同輻照度條件下輻射的光子數不同，為了保證不同波長刺激光刺激強度的統(tǒng)一，本文中將輻照度轉換為單位時間內通過單位面積的光子數(photons/(s·cm2))。試驗時，改變光路中的中性密度濾光片以控制魚眼處輻照度大小，刺激光的輻照度由小到大，以0.5個lg單位遞增(表1)。

表1 集成LED光源參數Tab.1 Parameters of integrated LED light source

1.2.3 ERG記錄裝置 ERG記錄裝置主要包括記錄電極、參考電極、前置放大器、帶通濾波器、消噪器、數據采集分析系統(tǒng)、法拉第籠、環(huán)形水槽、微操縱器和上位機等。記錄電極為直徑0.25 mm的鉑金絲電極，參考電極為直徑0.25 mm的醫(yī)用鋼針電極(西安富德醫(yī)療，中國)。ERG記錄時，通過手動微操縱器(KITE-R，WPI，美國)調整和固定記錄電極與參考電極，使記錄電極緊密接觸魚眼，參考電極插入試驗魚顱骨中央處。記錄電極頂端彎曲成“O”形，避免電極尖端緊密接觸魚眼時損傷試驗魚視網膜。試驗時在魚眼處滴入人工淚液以維持魚角膜濕潤，且保證記錄電極與角膜接觸良好。試驗前后均需將電極浸泡于體積分數75%的醫(yī)用乙醇中進行消毒和去除電極上黏附的雜質。

電極記錄的ERG信號經前置放大器(NL 104，CED，英國)進行差分放大后輸入帶通濾波器(NL 125，CED，英國)進行濾波。本試驗中設置帶通濾波器的低頻截止頻率為0.5 Hz，高頻截止頻率為100 Hz。濾波后的ERG信號經消噪器(Humbug，加拿大)濾除信號中50 Hz的工頻噪聲后，傳入生物電信號采集分析系統(tǒng)(Micro3-1401，CED，英國)進行模數轉換和處理。最終ERG信號傳導至上位機進行顯示和保存。上位機軟件采用Spike 2 V8.00(CED)，系統(tǒng)采樣頻率為300 Hz。

1.2.4 試驗魚預處理 試驗時，將完成暗適應的試驗魚浸泡于0.4 g/L MS-222溶液中進行麻醉[2]。待試驗魚鰓蓋停止張合后，迅速在其軀干背部注射0.02 mL濃度為50 mg/kg的戈拉碘銨(加拉碘銨)溶液[2]。將試驗魚一側朝上固定于法拉第籠中圓形水槽內的平臺上，并用富氧的0.1 g/L MS-222溶液進行人工灌流，灌流液水溫為28 ℃[3]。麻醉和注射加拉碘銨溶液的目的是抑制試驗魚的肌肉活動，保障電極的穩(wěn)定接觸和避免肌肉活動所產生電信號干擾。人工灌流的目的是保障試驗期間試驗魚的氧氣供應和維持試驗魚麻醉狀態(tài)。

1.2.5 ERG記錄試驗 試驗在上海海洋大學海洋科學學院魚類電生理實驗室中進行，為了避免晝夜節(jié)律對斑馬魚ERG記錄的影響，試驗在9:00—17:00時段進行。

1)不同暗適應時間下的ERG記錄。隨機選取30尾生長狀態(tài)一致且健康有活力的成年斑馬魚分別置于避光水箱中暗適應10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120 min后，以給定刺激光(波長為500 nm，強度為1.84×1013photons/(s·cm2)，刺激時長為300 ms[8])，記錄30尾斑馬魚在不同暗適應時間下的ERGs。

2)不同閃光刺激時間間隔下的ERG記錄。隨機選取30尾生長狀態(tài)一致且健康有活力的成年斑馬魚，暗適應100 min后，以給定刺激光(光條件同上)，刺激時長為300 ms[8]，分別以10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 s的時間間隔連續(xù)刺激眼睛10次，記錄30尾斑馬魚在不同閃光刺激時間間隔下的ERGs。

3)不同波長刺激光下的ERG記錄。隨機選取30尾生長狀態(tài)一致且健康有活力的成年斑馬魚，暗適應100 min后，記錄其在不同波長(340～620 nm)和不同強度(OD值為0～4.5)光刺激下的ERGs。為了避免系統(tǒng)誤差，同一尾斑馬魚在相同刺激條件下刺激3次(刺激時間間隔60 s)，結果取3次刺激的ERG響應平均值。試驗時，不同刺激波長的順序隨機確定，且在不同波長組之間測試試驗魚對波長500 nm、輻照度1.84×1013photons/(s·cm2)刺激光的標準響應，以進行數據校正。

1.2.6 不同暗適應時間、刺激時間間隔對斑馬魚視網膜電圖的影響試驗 以視網膜電圖的b波振幅作為斑馬魚視網膜對刺激光的響應，記錄不同刺激條件下的視網膜電圖響應。試驗結果數據均以平均值±標準差(mean±S.D.)表示。

1)暗適應時間對ERG的影響。30尾斑馬魚在10～120 min暗適應時間下的ERG b波振幅進行t檢驗(P=0.05)，當ERG b波振幅的組間無顯著性差異時(P>0.05)，則認為暗適應時間對斑馬魚ERG響應不再產生影響。

2)閃光刺激時間間隔的影響。參考Kanmizutaru等[15]方法，刺激時間間隔對ERG響應的影響率(α)計算公式為

α=(R1-R10)/R1×100%。

(1)

其中：α為影響率(%)；R1為第1次刺激的ERG響應；R10為第10次刺激的ERG響應。

對30尾斑馬魚在10～100 s閃光刺激時間間隔下的ERG響應R1和R10進行配對樣本t檢驗，當R1和R10無顯著性差異時(P>0.05)，認為此時的刺激時間間隔對斑馬魚ERG響應無影響。

1.2.7 斑馬魚光譜敏感性的計算 通過繪制斑馬魚的ERG響應和刺激光輻照度二者對數之間的函數關系，找出其線性響應區(qū)間，并在線性范圍內確定斑馬魚的標準響應振幅。參考Demarco等[16]方法，通過插值法計算出每個波長刺激光下產生標準響應的lg(輻照度)值，即為斑馬魚在不同波長下的光譜敏感性。

2 結果與分析

2.1 斑馬魚的ERG

圖1顯示了刺激光波長為500 nm、lg(輻照度)分別為11.0、11.5和12.0時，斑馬魚暗視ERG波形。試驗中刺激時長設為300 ms[8]，圖中on和off代表光刺激的開始和結束。從圖1可見，斑馬魚ERG響應振幅隨著刺激光lg(輻照度)的增加而增加。從圖中還觀察到3種ERG波形成分，包括刺激瞬間出現的a波、隨之出現的振動幅度較大且增勢迅猛的b波以及在刺激結束后才出現的d波。ERG b波振幅明顯，反映了斑馬魚雙極細胞的電活動[17]，代表了其第一層具有顏色分辨能力的視網膜神經元[18]。因此，本文中以ERG b波振幅作為斑馬魚視網膜對刺激光的響應，即ERG響應。

圖1 不同強度光刺激下斑馬魚的視網膜電圖(ERGs)Fig.1 ERGs of zebrafish stimulated by different light intensities

2.2 不同暗適應時間下的ERG響應

圖2顯示了30尾成年斑馬魚暗適應10～120 min時的ERG振幅。從圖2可見，ERG振幅隨著暗適應時間的延長而逐漸增大，并在90 min后趨于穩(wěn)定。t檢驗結果顯示，暗適應時間大于90 min后ERG響應組間無顯著性差異(P>0.05)，表明斑馬魚暗視ERG記錄時至少需要暗適應90 min。

2.3 不同閃光刺激間隔時間下的ERG響應

圖3顯示了暗適應100 min的30尾成年斑馬魚在閃光刺激時間間隔為10～100 s時的ERG響應R1和R10。從圖3可見，R10隨著刺激時間間隔的延長而逐漸增加，并不斷趨于R1值。對30尾斑馬魚的R1和R10兩組數據進行配對t檢驗，發(fā)現閃光刺激間隔時間大于50 s時，30尾斑馬魚的R1和R10兩組數據間無顯著性差異(P>0.05)。這表明，連續(xù)的閃光刺激時間間隔大于50 s不會改變斑馬魚的暗適應狀態(tài)，從而不影響后續(xù)ERG響應。

標有不同字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)，下同。The means with different letters are significantly different in the groups at the 0.05 probability level,and the means with the same letter are not significant differences,et sequentia.圖2 不同暗適應時間下的ERG響應Fig.2 ERG amplitudes at different dark adaptation time

圖3 不同光刺激時間間隔下的EGR響應R1和R10Fig.3 EGR R1 and R10 under different light stimulus intervals

繪制30尾暗適應100 min的成年斑馬魚在閃光刺激時間間隔為10～100 s時的EGR影響率α。從圖4可見：隨著刺激時間間隔的延長EGR影響率呈現遞減的趨勢，并最終趨于0；刺激時間間隔分別為10、20、30、40、50 s時，EGR影響率分別為43.63%、25.32%、10.7%、5.1%、0.98%，刺激時間間隔大于60 s時，影響率趨于0。這表明，連續(xù)的閃光刺激時間間隔大于60 s時影響率趨于0，結合R1和R10兩組數據的配對t檢驗結果分析，發(fā)現斑馬魚ERG試驗中刺激時間間隔大于50 s時連續(xù)閃光刺激并不影響后續(xù)ERG響應。

圖4 不同光刺激時間間隔對EGR響應的影響率Fig.4 ERG effect ratio of different time intervals of light stimulation

2.4 斑馬魚光譜敏感性

為了確定斑馬魚ERG標準響應振幅，對不同刺激條件下的斑馬魚ERG響應取對數，并繪制了ERG響應與輻照度二者對數(lg)間的關系(圖5)，從圖中的離散數據可以判斷二者呈線性相關。利用最小二乘法對二者的數據進行線性回歸分析，結果顯示，13組波長下lg(ERG響應)與lg(輻照度)的數據和最佳擬合線性方程之間擬合程度高，決定系數R2均大于0.95，且其中12組波長擬合方程的剩余標準差均小于0.1，僅420 nm波長組擬合方程的剩余標準差高于0.1，為0.113。紫外光波段(340、365、380 nm)線性擬合方程的斜率分別為0.56、0.52、0.59，可見光波段(400～620 nm)線性擬合方程的斜率為0.67～0.88。不同刺激波長斜率之間的差異未發(fā)現一致的趨勢。

圖5 不同波長下ERG響應與輻照度的關系Fig.5 Function relationship between response and irradiance at different wavelengths

由圖5可以判斷，50 μV(其lg值約1.7)的ERG響應處在線性響應區(qū)間內，且始終高于噪聲水平。因此，本文以50 μV的ERG響應作為標準響應，計算斑馬魚的光譜敏感性。對30尾斑馬魚在13組不同波長下的lg(ERG響應)與lg(輻照度)數據進行插值(R2>0.95)，計算產生50 μV標準響應的lg(輻照度)，并根據該lg(輻照度)值繪制斑馬魚的絕對光譜敏感性函數(圖6)。從圖6可見：斑馬魚暗視光譜敏感性在可見光波段(400～700 nm)峰值出現在500 nm處，在365 nm處(紫外光波段)發(fā)現了斑馬魚第二敏感峰值，365 nm的紫外敏感峰值相較于500 nm可見光敏感峰值低了約0.28個lg單位；斑馬魚的暗視光譜敏感性在可見光波段與視紫紅質的光譜吸收曲線擬合較好，而視紫紅質是斑馬魚視桿細胞的感光色素，說明可見光波段的光譜敏感性由斑馬魚視桿細胞主導。

圖6 斑馬魚的暗視光譜敏感性Fig.6 Scotopic spectral sensitivity of zebrafish

3 討論

3.1 斑馬魚暗視ERG的最佳試驗參數

人類從明亮的環(huán)境進入完全黑暗的環(huán)境，眼睛需要20～30 min完全暗適應，而從黑暗環(huán)境進入明亮的環(huán)境僅需5 min左右就能完全明適應[19]。國際臨床視覺電生理學會(ISCEV)明確規(guī)定，進行人體臨床明視ERG記錄至少需要明適應10 min，進行人體臨床暗視ERG記錄至少需要暗適應20 min[20]。明適應過程耗費時間較短，在一般動物試驗中容易滿足。而暗適應過程耗費時間較長，在試驗設計時過長的暗適應時間將影響試驗進程，而較短的暗適應時間則無法滿足試驗需要，可能導致試驗誤差。在動物ERG試驗中并沒有明確的明、暗適應時間標準，因此，明確斑馬魚ERG試驗的明、暗適應時間有助于增加試驗的準確性，也有助于斑馬魚ERG標準化試驗方案的確定。本研究表明，暗適應時間對ERG影響顯著，ERG振幅隨著暗適應時間的延長而逐漸增大，且暗適應時間為10 min和90 min時的ERG振幅的差異高至260 μV(圖2)。ERG振幅在暗適應時間達到90 min后趨于穩(wěn)定，表明暗適應90 min后，斑馬魚進入完全暗適應狀態(tài)。ERG試驗中需要對暗適應的斑馬魚進行連續(xù)的閃光刺激，而連續(xù)的閃光刺激可能會激活斑馬魚明視視覺系統(tǒng)，從而改變斑馬魚的暗適應狀態(tài)，進而導致ERG響應發(fā)生變化，影響ERG評估的準確性。因此，明確不影響后續(xù)ERG記錄的閃光刺激時間間隔對于增加ERG試驗的準確性也具有重要的意義。本研究中發(fā)現，連續(xù)的閃光刺激時間間隔為50 s時影響率為0.98%，閃光刺激時間間隔大于60 s時影響率趨于0(圖4)，由此可見，斑馬魚暗視ERG試驗中大于50 s的閃光刺激時間間隔是較好的選擇。在斑馬魚ERG試驗中，除了暗適應時間和閃光刺激時間間隔外，晝夜節(jié)律也可能對ERG記錄產生影響[21]。

3.2 暗適應條件下斑馬魚的光譜敏感性

成年斑馬魚擁有發(fā)達的視覺系統(tǒng)[22-23]，其視覺系統(tǒng)可分為視桿視覺系統(tǒng)(暗視)和視錐視覺系統(tǒng)(明視)兩個子系統(tǒng)[12]。暗適應條件下，視桿視覺系統(tǒng)是主導斑馬魚視覺的系統(tǒng)[12]。視桿細胞中含有視紫質和視紫紅質兩種感光色素，視紫質的光譜吸收峰值波長為523 nm，視紫紅質的光譜吸收峰值波長為500 nm[24]。本研究表明，暗適應條件下斑馬魚對可見光的光譜敏感性峰值與視紫紅質光譜吸收峰值波長一致，且斑馬魚在可見光波段的光譜敏感性曲線與視紫紅質的光譜吸收曲線基本吻合，說明暗適應條件下斑馬魚的光譜敏感性主要由視桿細胞中的視紫紅質決定。而溫度和光線會影響魚類視桿細胞中視紫質和視紫紅質的比率[25]，可能會導致不同環(huán)境下的斑馬魚光譜敏感性存在差異。此外，不同發(fā)育階段對斑馬魚的光譜敏感性也有影響，如斑馬魚幼魚在14 dpf(受精時長)時的光譜敏感性峰值為540 nm，而發(fā)育到24 dpf時光譜敏感性峰值向短波遷移，為500 nm[11]。本研究結果顯示，暗適應的斑馬魚成魚對可見光的光譜敏感性峰值也為500 nm，說明斑馬魚視桿細胞在24 dpf時可能已經基本發(fā)育完全。Douglas等[26-27]認為，生活在水深大于200 m的深水魚類對470～490 nm波長的光最敏感，而生活在200 m以內淺水的中上層魚類對490～520 nm的波長最敏感。魚類視覺系統(tǒng)在長期進化過程中具有適應性特征，斑馬魚光譜敏感性可能是其在長期進化過程中適應了其生活的中上層水層光環(huán)境的結果。

3.3 暗適應條件下斑馬魚的紫外敏感性

本研究表明，暗適應狀態(tài)的斑馬魚不僅對可見光敏感，也表現出對紫外光敏感，在斑馬魚的暗視光譜敏感性的紫外光波段發(fā)現了一個敏感峰值(約365 nm處)(圖6)，且該峰值的波長比視紫紅質峰值吸收光譜(500 nm)或視紫質峰值吸收光譜(523 nm)低得多，說明斑馬魚的紫外敏感性并非由視桿細胞介導。而U-視錐細胞視色素的光譜吸收峰值波長為362 nm[6]，紫外波段的光譜敏感峰值(365 nm)與U-視錐細胞的峰值吸收光譜(362 nm)相匹配[6]，表明暗適應條件下的斑馬魚紫外光譜敏感性由U-視錐細胞介導。這一結果表明，暗適應條件下，斑馬魚的U-視錐細胞參與了暗視視覺，因此，可以判斷斑馬魚的短波視覺類型屬于Losey等[28]提出的紫外特化型短波視覺。U-視錐細胞是斑馬魚視覺系統(tǒng)中非常重要的組成成分，占總視細胞數的25%，且U-視錐細胞是最先發(fā)育的視細胞[6,29]。斑馬魚明視視覺中U-視錐細胞的參與有著重要的生態(tài)原因，斑馬魚生活的淺水水域紫外線含量豐富。基于U-視錐細胞的紫外視覺可以增強對獵物的探測能力，有利于斑馬魚生存[30]。而斑馬魚暗視視覺中U-視錐細胞的參與并不意味著斑馬魚在暗適應條件下具有色覺，而是有助于斑馬魚的暗視光譜敏感性功能。暗適應的斑馬魚通過視桿細胞和U-視錐細胞共同作用，擴大了其暗視視覺光譜敏感范圍。此外，視錐細胞相對視桿細胞而言對光更為敏感，暗視視覺中U-視錐細胞的參與也有助于增加斑馬魚暗視視覺的靈敏度[28]。

4 結論

1)斑馬魚暗適應90 min以上，其暗視ERG響應趨于穩(wěn)定。

2)連續(xù)的閃光刺激時間間隔大于50 s時不影響后續(xù)暗視ERG響應的記錄。

3)本試驗條件下，暗適應的斑馬魚對可見光(400～700 nm)的光譜敏感性峰值為500 nm，對UV的光譜敏感性峰值為365 nm。其視網膜中的視桿細胞和U-視錐細胞共同參與了暗視視覺，增加了暗視光譜敏感范圍，提高了暗視視覺的靈敏度。