姜博璠，張耀剛，沙長(zhǎng)青，高瑞雪，楊海山，曹得萍

(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，西寧 810001；2.青海大學(xué)附屬醫(yī)院包蟲病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810001；3.桂林醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，桂林 541101)

泡型包蟲病幾乎100%原發(fā)于肝臟，常伴有纖維組織增生和鈣化。有研究發(fā)現(xiàn)hsa-miR-125b-5p在一些肝臟相關(guān)疾病中異常表達(dá)[1]，并在活化的肝星狀細(xì)胞中表現(xiàn)為增加顯著[2]。肝星狀細(xì)胞活化又是肝發(fā)生纖維化的主要原因[3]。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于泡型包蟲病患者血清miRNA差異表達(dá)的研究方向不同。本研究試圖驗(yàn)證hsa-miR-125b-5p在泡型包蟲病患者組與健康對(duì)照組血清之間的相對(duì)表達(dá)量的差異。同時(shí)通過生物信息學(xué)的方法預(yù)測(cè)其靶基因可能參與的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，為今后泡型包蟲病分子標(biāo)志物的篩選提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血清樣本

實(shí)驗(yàn)用血清樣本均來自青海大學(xué)附屬醫(yī)院包蟲病樣本庫。血清在病人未行任何治療時(shí)抽取(排除影響本研究結(jié)果的醫(yī)療行為)。

1.1.2 引物

實(shí)驗(yàn)所使用的引物及內(nèi)參購于生工生物工程(上海)股份有限公司。引物及內(nèi)參的序列見表1。

表1 引物及內(nèi)參基因的序列

Table 1 Sequence of primers and internal reference gene

1.1.3 主要試劑和儀器

總RNA提取試劑盒(RNAiso Plus，Takara，Cat#9108)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(MiR-XTM miRNA First-Strand Synthesis Kit，Takara，Code.638313)，熒光定量試劑盒(TB GreenTM Premix Ex TaqTMⅡ，Takara，RR820A)；反轉(zhuǎn)錄PCR儀(GeneAmp?PCR System 9700，ABI)，實(shí)時(shí)熒光定量?jī)x器(LightCycler?480Ⅱ，Roche)和超微量核酸蛋白測(cè)定儀(NanoDrop 2000c，Thermo)。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

每份血清取0.5 mL按照Takara試劑盒說明書步驟提取總RNA。取1 μL總RNA在超微量核酸蛋白測(cè)定儀上檢測(cè)其濃度及純度，取兩次測(cè)量的平均值。當(dāng)A260 nm/A280 nm的比值符合反轉(zhuǎn)錄要求時(shí)方可進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。反轉(zhuǎn)錄依照Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行操作，按要求配制10 μL反應(yīng)液[mRQ Buffer(2×)5μL，RNA sample(0.25～8μg)3.75μL，mRQ Enzyme1.25μL]，配置好反應(yīng)液后按如下反應(yīng)條件反轉(zhuǎn)錄：37 ℃，60 min；85 ℃，5 min。反轉(zhuǎn)所得cDNA加90 μL無酶水稀釋后置-20 ℃冰箱。

1.2.2 q-PCR及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

1.2.3 hsa-miR-125b-5p基因的生物信息學(xué)分析

靶基因篩選所用數(shù)據(jù)庫為starBase(http：//starbase.sysu.edu.cn/index.php)、miRDB(http：//mirdb.org/)、miRwalk(http：//mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)、miRTarBase(http：//miRtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php)數(shù)據(jù)庫。將starBase、miRDB、miRwalk三個(gè)數(shù)據(jù)庫所預(yù)測(cè)的靶基因交集，與miRTarBase數(shù)據(jù)庫提供的已經(jīng)取得實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的靶基因取合集。GO分析和KEGG的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分析所用數(shù)據(jù)庫為Enrichr(http：//amp.pharm.mssm.edu/Enrichr/)、KEGG(https：//www.kegg.jp/)數(shù)據(jù)庫。以P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選通路。用STRING數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)靶基因所編碼的蛋白之間的相互作用，可信度最高的相互作用分?jǐn)?shù)為0.900?？尚哦纫蕾嚳疾彀ㄎ谋就诰?、實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證等7個(gè)方面。

2 結(jié)果

2.1 qPCR結(jié)果及統(tǒng)計(jì)分析

患者組和對(duì)照組擴(kuò)增曲線明顯，溶解曲線無雙峰。數(shù)據(jù)見表2。

表2 qPCR數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

Table 2 qPCR data

hsa-miR-125b-5p在泡型包蟲病患者組血清中的表達(dá)量高于健康對(duì)照組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。柱狀圖見圖1。

Control組為健康對(duì)照組，Treated組為泡型包蟲病患者組

圖1 hsa-miR-125b-5p在健康對(duì)照組和泡型包蟲病患者組中的相對(duì)表達(dá)量圖

Figure 1 Relative expression of hsa-miR-125b-5p in healthy controls and alveolar echinococcosis in patients

2.2 靶基因預(yù)測(cè)

hsa-miR-125b-5p在starBase、miRDB、miRwalk數(shù)據(jù)庫中預(yù)測(cè)靶基因數(shù)分別為219、925、10 879個(gè)。取交集后獲得靶基因163個(gè)。miRTarBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)到由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持的靶基因134個(gè)。為保證本實(shí)驗(yàn)靶基因預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，我們將兩組靶基因合并，得到靶基因267個(gè)(兩個(gè)集合含有30個(gè)相同靶基因)。見圖2。

圖2 hsa-miR-125b-5p靶基因預(yù)測(cè)流程圖

Figure 2 Flow chart of hsa-miR-125b-5p target gene prediction

2.3 靶基因的GO分析和KEGG通路分析

將所預(yù)測(cè)的267個(gè)靶基因經(jīng)Enrichr、KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行富集分析和通路分析。富集分析顯示三個(gè)部分，分別為生物過程部分、分子功能部分和細(xì)胞組分部分。具體富集功能見圖3。其中對(duì)細(xì)胞凋亡(在生物過程中的，P<0.05)、MAP激酶激酶活性(在分子功能中的，P<0.05)的調(diào)節(jié)可能調(diào)控了肝臟的細(xì)胞凋亡和纖維化，與泡型包蟲病患者肝臟病變相符合。通路分析總共分析出228個(gè)通路，其中參與調(diào)控的靶基因數(shù)大于15的通路見表3。在這些通路中，hsa-miR-125b-5p的部分靶基因發(fā)揮重要作用。與肝臟纖維病變關(guān)聯(lián)密切的通路有肝細(xì)胞癌通路、MAPK信號(hào)通路等，見圖4、5。

圓圈的大小代表靶基因數(shù)目，顏色深淺代表對(duì)P值再統(tǒng)計(jì)后的q值

圖3 GO分析散點(diǎn)圖

Figure 3 GO analysis scatter plot

表3 KEGG分析的主要通路及其參與基因

Table 3 Main pathways of KEGG analysis and their participating genes

黃色標(biāo)記基因?yàn)閔sa-miR-125b-5p的靶基因

The yellow marker genes are the target genes of hsa-miR-125b-5p

圖4 肝細(xì)胞癌通路中的TGF-β通路圖和MAPK通路圖

Figure 4 TGF-β pathway map and MAPK pathway map in hepatocellular carcinoma pathway

黃色標(biāo)記基因?yàn)閔sa-miR-125b-5p的靶基因

2.4 靶基因所編碼蛋白間的作用

將hsa-miR-125b-5p所預(yù)測(cè)的靶基因合集分別輸入String數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建蛋白之間相互作用網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建顯示共有275個(gè)節(jié)點(diǎn)和284個(gè)邊緣，并確定了6個(gè)關(guān)鍵基因(degree>20)：TP53、AKT1、EGFR、MAPK14、SMAD4、STAT3，見圖6。這些關(guān)鍵基因在蛋白相互作用網(wǎng)中處于主要節(jié)點(diǎn)位置，相互之間緊密關(guān)聯(lián)，其在肝細(xì)胞的增殖、分化及腫瘤突變中發(fā)揮重要作用。

圓圈大小和顏色代表靶基因的可信度，連接線的粗細(xì)和顏色代表連接分?jǐn)?shù)

圖6 hsa-miR-125b-5p靶基因編碼蛋白TP53網(wǎng)絡(luò)相互作用圖

Figure 6 Interaction map of hsa-miR-125b-5p target gene encoding protein TP53 network

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)肝臟中的miRNA水平與許多血清中的miRNA水平相關(guān)[4]。來自肝臟的miRNA可以通過細(xì)胞凋亡和壞死方式被動(dòng)地進(jìn)入血清，或通過外泌體和病毒顆粒的分泌積極地進(jìn)入血清[5]。它們可以作為肝損傷和癌癥的生物標(biāo)志物[6]。

本課題組前期通過基因芯片檢測(cè)了泡型包蟲病患者組與健康對(duì)照組血清中miRNA的表達(dá)情況。其中表達(dá)差異明顯的基因主要有hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-377-5p、hsa-miR-937-5p、hsa-miR-4725-3p、hsa-miR-3165等。此外有相似研究指出，泡型包蟲病患者肝臟病變組織與邊緣帶組織存在差異的miRNA有hsa-miR-1237-3p、hsa-miR-33b-3p、hsa-miR-483-3p、hsa-miR-4306等[7]。目前研究表明，血清中hsa-miR-125b-5p的升高與肝臟損害的嚴(yán)重程度有關(guān)聯(lián)，其可能是慢性乙肝合并肝功能衰竭預(yù)后不良的預(yù)測(cè)指標(biāo)[8]，而泡型包蟲病患者肝臟病變以纖維組織增生和鈣化為主，對(duì)肝臟的損害程度極大。因此本課題組首先選取了基因芯片結(jié)果中表達(dá)差異明顯的hsa-miR-125b-5p做進(jìn)一步驗(yàn)證及研究。

q-PCR驗(yàn)證得出hsa-miR-125b-5p在泡型包蟲病患者血清中呈高表達(dá)。GO分析和KEGG通路分析顯示，hsa-miR-125b-5p主要調(diào)節(jié)的靶基因集中在癌癥通路及MAPK信號(hào)通路中。hsa-miR-125b-5p調(diào)節(jié)的癌癥通路中的重要靶基因Smad4是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)/Smad途徑的重要成員之一，該途徑參與了肝臟的纖維化[9]。Smad2、Smad3被激活后與Smad4結(jié)合形成異源三聚體進(jìn)入細(xì)胞核與DNA結(jié)合，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的增殖[10，11]。此外，MAPK通路也是參與肝臟纖維化的重要通路之一。有研究表明[12]，肝纖維化時(shí)主要參與的細(xì)胞是活化的肝星狀細(xì)胞，而阻斷MAPK通路中的p38可以促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的增殖，p38可以對(duì)肝星狀細(xì)胞的增殖發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用。應(yīng)用p38通路抑制劑(SB202190和ML3403)阻斷蟲體P38信號(hào)通路，可以有效抑制體外多房棘球絳蟲的存活率，并且對(duì)人正常細(xì)胞無影響[13]。在hsa-miR-125b-5p的靶基因所調(diào)節(jié)的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中，主要參與基因有MAPK14、SMAD4、TP53、AKT1、EGFR、STAT3。這些基因在肝臟的病變及細(xì)胞的增殖和代謝中發(fā)揮著重要作用。比如AKT1在肝細(xì)胞癌細(xì)胞中異常表達(dá)，并且與細(xì)胞行為高度相關(guān)，包括增殖、存活、新陳代謝和腫瘤發(fā)生[14]。研究表明在肝細(xì)胞癌中EGFR常常表現(xiàn)為過表達(dá)，并發(fā)揮關(guān)鍵作用，突出了EGFR在肝臟疾病發(fā)展中的重要性[15]。

生物信息學(xué)分析結(jié)果表明hsa-miR-125b-5p的靶基因及其調(diào)控蛋白涉及多種生物學(xué)功能，符合泡型包蟲病患者肝臟病變尤其是肝臟纖維化的特點(diǎn)。在樣本收集時(shí)排除患者其他并發(fā)癥的基礎(chǔ)上，本研究所預(yù)測(cè)的信號(hào)通路和重要靶基因與泡型包蟲病的發(fā)病可能有關(guān)聯(lián)。下一步研究將會(huì)在體外肝細(xì)胞培養(yǎng)中將hsa-miR-125b-5p過表達(dá)，觀察其對(duì)肝細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期及細(xì)胞活力等方面的影響。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)hsa-miR-125b-5p在泡型包蟲病患者組血清中的含量相對(duì)于健康對(duì)照組是增加的。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示hsa-miR-125b-5p的靶基因調(diào)控的肝細(xì)胞癌通路及MAPK通路在肝臟纖維化的病變中發(fā)揮著重要作用。MAPK14、SMAD4、TP53、AKT1、EGFR、STAT3這6個(gè)關(guān)鍵靶基因參與了肝細(xì)胞纖維化、增殖及腫瘤病變發(fā)展的過程，其中SMAD4、MAPK14所涉及的TGF-β1/Smad信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路更是直接促進(jìn)了肝包蟲病患者肝纖維化的改變。hsa-miR-125b-5p或許可以作為泡型包蟲病生物標(biāo)志物之一，但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究與驗(yàn)證。