馬 美，蘇占海，王海燕

(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院)

乳腺癌中內(nèi)分泌依賴性乳腺癌、HER2陽性乳腺癌的抗腫瘤藥物研究進(jìn)展順利，而三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)因其組織學(xué)分級高，較其他乳腺癌亞型更具侵襲性而缺乏有效治療藥物。

余甘子為大戟科葉下珠屬植物(Phyllanthus emblica L)，主治癌癥等，是一味重要的傳統(tǒng)藏藥[1]，1990年首次載入《中國藥典》。既往研究表明，余甘子鞣質(zhì)類成分柯里拉京對人鼻咽癌細(xì)胞KB、卵巢癌細(xì)胞A2780、骨肉瘤細(xì)胞OS-732、結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8、人肺腺癌細(xì)胞A549等有顯著的生長抑制作用[2]。余甘子[3]葉總黃酮對肝癌細(xì)胞株Bel-7404、HepG-2，人宮頸癌細(xì)胞株Hela，人胃癌細(xì)胞株SGC7901，人鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2，人肺癌細(xì)胞株H460，人卵巢癌細(xì)胞株A2780等均有良好的生長抑制作用。余甘子提取物對人肺癌細(xì)胞A549、肝癌細(xì)胞 HepG2 具有抑制作用。余甘子水提物呈劑量依賴性抑制體外培養(yǎng)的L929細(xì)胞的生長。

因此，本研究以人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞為體外模型，研究藏藥余甘子對MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響，并從基因水平探討其對細(xì)胞周期蛋白CyclinG2、細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子p21表達(dá)的影響，分析三陰性乳腺癌病人CyclinG2、p21的表達(dá)與預(yù)后情況，為藏藥余甘子的臨床應(yīng)用提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗藥物

余甘子的干燥果實(購于安徽亳州中藥材交易中心，產(chǎn)地江西，取樣量300g，合格證批號191104)。

1.1.2 細(xì)胞株

人乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞(來自北京協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞庫)。

1.1.3 試劑與儀器

MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒(索萊寶，中國)；Trizol、RNAiso Plus、組織/細(xì)胞總RNA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒(寶日醫(yī)，中國)；細(xì)胞周期與凋亡檢測試劑盒(碧云天，中國)。

旋蒸儀(EYELA，日本)、細(xì)胞培養(yǎng)箱(Forma，美國)、超凈工作臺(Thermo，美國)、酶標(biāo)儀xMark-10483(Bio-rad，日本)、純水儀(默克密理博，德國)、LightCycler OR 96 全自動熒光定量PCR儀(Roche，瑞士)、低溫冷凍離心機(jī)(Eppendrof，德國)、瓊脂糖凝膠電泳成像儀(Azure biosystem，美國)、CKX4型倒置顯微鏡(Olympus，日本)、Nanodrop 2000型超微量分光光度計(Thermo，美國)、流式細(xì)胞儀(BECKMAN，美國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 浸膏制備

取300 g余甘子粉碎，用90%乙醇回流提取3次，每次3 h。將提取液蒸發(fā)后得浸膏。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

在顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁生長情況。當(dāng)富集度達(dá)80%時按 1：2的比例傳代，后續(xù)實驗均采用3代以后貼壁80%的細(xì)胞株。分組參照文獻(xiàn)[4]分為對照組、實驗組。

1.2.3 細(xì)胞抑制率檢測

將對數(shù)期細(xì)胞(富集度達(dá)80%)鋪于96孔板上，每孔加1×105個細(xì)胞，每組細(xì)胞設(shè)置6個平行復(fù)孔，置細(xì)胞培養(yǎng)箱(37℃，5% CO2)培養(yǎng)24 h，取出培養(yǎng)板，去除上清液。對照組加入100 μL新鮮完全培養(yǎng)基，實驗組加入100 μL不等濃度余甘子(320、160、80、40、20μg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，再次去除上清液，每孔加入10 μL MTT溶液，培養(yǎng)4 h。然后吸去上清液，每孔加110 μL Formazan溶解液，低速晃動10 min，用酶標(biāo)儀在 490 nm波長處測光密度(OD)值，根據(jù)OD值繪制細(xì)胞增殖曲線。實驗重復(fù)3次。

1.2.4 細(xì)胞周期檢測

取生長對數(shù)期的細(xì)胞，消化后吹打成單細(xì)胞，均勻鋪于6孔板上；待80%細(xì)胞貼壁后，換無血清培養(yǎng)基做饑餓處置(24h)；對照組(培養(yǎng)基中含0.1% DMSO)、實驗組均設(shè)三個復(fù)孔；培養(yǎng)時間結(jié)束時收集原培養(yǎng)液，用胰酶細(xì)胞消化液消化細(xì)胞，至細(xì)胞變圓后，棄胰酶細(xì)胞消化液，終止消化；重懸細(xì)胞后再次離心沉淀細(xì)胞；加入300 μL預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞(動作輕柔)，再逐滴緩慢加入700 μL預(yù)冷的乙醇中，輕輕吹打混勻，固定24 h(4℃)；離心去除上清液；加入1 mL預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，再次離心去除上清液后加入0.5 mL配置好的碘化丙啶染色液，避光水浴(37℃，30min)；上流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.5CyclinG2，p21表達(dá)檢測

取對數(shù)生長期(富集度達(dá)80%)的MDA-MB-231細(xì)胞，用1×PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，加入1 mL 0.25%胰酶-EDTA消化液，消化3 min左右，加入1 mL完全培養(yǎng)基終止消化，輕柔吹打細(xì)胞使其均勻懸浮。按 1×105個細(xì)胞/孔的密度，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置CO2培養(yǎng)箱(37℃、5% CO2、1% O2)中培養(yǎng)(過夜)。第2日按照實驗分組更換含藥培養(yǎng)基：對照組加入200 μL新鮮完全培養(yǎng)基，實驗組加入200 μL余甘子藥液(c=20μg/mL)，每組設(shè)3個復(fù)孔，繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng) 24 h 后用PBS清洗2次，加入Trizol 裂解，按照總RNA提取試劑盒的操作說明提取各組細(xì)胞的總RNA。測定RNA濃度及純度(A260/280在1.8～2.0之間提示RNA的純度較高)。同時，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。將純度較高、完整性良好的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。按后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)需要取出相應(yīng)所需量的總RNA立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件：37 ℃，15 min×3；85 ℃，5 sec；4 ℃，1 min。設(shè)計和合成PCR的引物序列見表1。PCR反應(yīng)條件：95 ℃，3 min；95 ℃，5 s；60 ℃，30 s；72 ℃，30 s。共 40個循環(huán)。每個樣品重復(fù)3次，反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)Rtime PCR的擴(kuò)增曲線和溶解曲線，用2-ΔΔCt法計算基因相對表達(dá)量。

表1 引物與內(nèi)參序列

Table 1 Sequence of primers and internal parameters

1.2.6 三陰性乳腺癌患者中CyclinG2和p21的表達(dá)與預(yù)后分析

利用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫分析239例三陰性乳腺癌患者CyclinG2的p21 RNA數(shù)據(jù)與預(yù)后情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均通過SPSS 22.0和Grapad Prism 7.0統(tǒng)計軟件處理，均數(shù)之間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 余甘子對乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231增殖的影響

與對照組比較，余甘子組(320、160、80、40、20μg/mL)細(xì)胞活性明顯降低(P<0.05)，呈濃度依賴效應(yīng)。依據(jù)MTT實驗結(jié)果，計算余甘子對MDA-MB-231的IC50(26.65μg/mL)，見圖1。選取20 μg/mL的余甘子行后續(xù)實驗。

圖1 不同濃度作用后的抑制率(%)圖

Figure 1 Inhibition rate detected by MTT after different concentrations(%)

2.2 余甘子對細(xì)胞周期的影響

有關(guān)研究表明，余甘子鞣質(zhì)部位能夠顯著抑制人纖維肉瘤細(xì)胞HT1080的遷移和侵襲[4]。陳靜等[5]發(fā)現(xiàn)余甘子鞣質(zhì)部位對人腫瘤細(xì)胞 A549、BEL-7402的抑制作用機(jī)制，可能與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡及細(xì)胞G2/M 期阻滯有關(guān)。余甘子使癌細(xì)胞發(fā)生S期阻滯，影響細(xì)胞周期正常進(jìn)程，與細(xì)胞凋亡有關(guān)。本實驗為了確定余甘子對MDA-MB-231細(xì)胞的細(xì)胞周期的影響，通過流式細(xì)胞術(shù)分析了余甘子處理細(xì)胞24 h后細(xì)胞周期的變化，見圖2。

圖2 余甘子(20μg/mL)對MDA-MB-231細(xì)胞周期的影響圖

2.3 余甘子對CyclinG2和p21表達(dá)的影響

為了探索余甘子抑制人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231細(xì)胞增殖的機(jī)制，課題組采用qPCR法檢測CyclinG2、p21的表達(dá)水平，與對照組(DMSO組)相比，余甘子(20μg/mL)作用后的CyclinG2、p21在 MDA-MB-231 細(xì)胞系中表達(dá)顯著增高(P<0.05)，見圖3。

圖3 余甘子(20μg/mL)作用后人乳腺細(xì)胞內(nèi)CyclinG2、p21表達(dá)水平圖

Figure 3 Effects of Yuganzi(20μg/mL)on the expression levels ofCyclinG2 andp21 in mammary gland cells

2.4 對三陰性乳腺癌患者CyclinG2和p21的表達(dá)與預(yù)后的分析

前述體外試驗顯示余甘子處理MDA-MB-231細(xì)胞后，CyclinG2、p21表達(dá)水平顯著增高。這兩個基因的表達(dá)量增高和患者的預(yù)后具有相關(guān)性，我們通過KMplot分析了239例臨床三陰性乳腺癌患者CyclinG2、p21的mRNA數(shù)據(jù)與預(yù)后情況，見圖4。高表達(dá)CyclinG2基因的患者與低表達(dá)的患者相比預(yù)后良好，具有顯著性差異(P=0.0037)。高表達(dá)P21基因的患者與低表達(dá)的患者相比預(yù)后沒有顯著性差異(P=0.77)，但從總預(yù)后概率曲線圖中仍能看出，高表達(dá)p21基因的患者預(yù)后較低表達(dá)者好。

圖4CyclinG2、p21基因表達(dá)水平與三陰性乳腺癌患者的預(yù)后關(guān)系圖

Figure 4 Relationship betweenCyclinG2 andp21 gene expression level and prognosis of triple negative breast cancer patients

3 討論

余甘子抗腫瘤作用研究備受關(guān)注，關(guān)于其提取物及相關(guān)成分的抗腫瘤研究較多，從細(xì)胞水平的研究較少且結(jié)論不同。無限增殖是腫瘤的最大特點(diǎn)，細(xì)胞周期紊亂是最直接原因，細(xì)胞周期調(diào)控是細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)的核心環(huán)節(jié)。文獻(xiàn)總結(jié)提示：細(xì)胞增殖與凋亡的雙重假說在腫瘤形成中起主要作用；細(xì)胞周期的調(diào)控與細(xì)胞死亡有關(guān)，在腫瘤發(fā)生過程中意義重大。目前已確認(rèn)，細(xì)胞周期調(diào)控的主要分子基礎(chǔ)是周期蛋白和周期蛋白依賴性激酶復(fù)合體的相互作用。凋亡缺陷是促進(jìn)腫瘤發(fā)生、誘導(dǎo)腫瘤治療失敗的主要原因。本研究結(jié)果顯示，與對照組的MDA-MB-231細(xì)胞比較，余甘子作用后的G1/S期細(xì)胞比例增加。因此得出，余甘子將細(xì)胞周期阻滯在G1/S期，促進(jìn)了三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡。

細(xì)胞周期蛋白是指與真核細(xì)胞的細(xì)胞周期呈同步周期性濃度升降的蛋白質(zhì)，最先是從海膽胚胎中分離出的，為相對分子質(zhì)量為50 000蛋白質(zhì)家族的一員。它們與關(guān)鍵的蛋白質(zhì)激酶(細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶，CycinG2-dependent kinases，CDKs)結(jié)合，并調(diào)節(jié)它們的酶活性，推動和協(xié)調(diào)細(xì)胞周期。G型蛋白是細(xì)胞周期蛋白家族中的新成員，它的結(jié)構(gòu)比較特殊：N端缺少降解所需的“destruction box”氨基酸序列，而C端卻包含有與表皮生長因子受體相似的自主磷酸化位點(diǎn)，這表明它既是一種細(xì)胞周期蛋白，也是細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)因子。并且CyclinG2的C末端存在一個由46個氨基酸組成的擴(kuò)展區(qū)，其中包括PEST(Prototypic protein destabilizing sequences，原型蛋白不穩(wěn)定序列)結(jié)構(gòu)域，在CycinG2的第272～294位氨基酸區(qū)表現(xiàn)得更為明顯，包含一個新近發(fā)現(xiàn)的序列結(jié)構(gòu)域N-X-X-Y，它是信號蛋白shcPTB結(jié)合的潛在位點(diǎn)。CyclinG2主要在細(xì)胞質(zhì)中，與裂殖酵母的cig2及出芽酵母的clb5具有更高的同源性。它的表達(dá)隨細(xì)胞周期時相不同而發(fā)生波動，在S中期達(dá)高峰。目前研究均提示它可能作為負(fù)調(diào)因子參與細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)：CyclinG2高表達(dá)對HeLa細(xì)胞的體外增殖和生長有顯著抑制作用[6]。在腎透明細(xì)胞中，CyclinG2表達(dá)較低，其表達(dá)率高可抑制腫瘤的發(fā)生。CyclinG2高表達(dá)可顯著抑制體外培養(yǎng)胃癌細(xì)胞SGC-7901的增殖[7]。CyclinG2表達(dá)水平的降低和甲狀腺乳頭狀腺癌的惡變關(guān)系緊密[8]。在惡性口腔角化細(xì)胞和口腔癌上皮細(xì)胞中，CyclinG2表達(dá)顯著下降[9]。本研究中，高表達(dá)CyclinG2的人三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231在體外增殖活性下降，提示其在胃癌細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用，具體影響機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

長鏈非編碼RNA p21是p53最重要的下游基因之一[10]，而p53是參與維持基因組完整性的重要腫瘤抑制基因，所以p21可以和p53共同構(gòu)成細(xì)胞周期G1檢查站，即DNA損傷后不經(jīng)過修復(fù)則無法通過，減少了受損DNA的復(fù)制和積累，從而發(fā)揮抑癌作用[11]。細(xì)胞周期素(Cyclin)、細(xì)胞周期素依賴性激酶(CDKs)、細(xì)胞周期依賴性激酶抑制因子(CDKIs)是參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的三大元素。其中CDKs促進(jìn)細(xì)胞增殖，而CDKIs抑制細(xì)胞增殖。p21是CDKIs家族中的重要成員。負(fù)性調(diào)節(jié)因子p21蛋白缺乏可導(dǎo)致細(xì)胞周期正負(fù)調(diào)節(jié)因子失衡，出現(xiàn)細(xì)胞周期紊亂[12]，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[13]。p21介導(dǎo)的Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是腫瘤發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵途徑：正常肝臟組織p21表達(dá)明顯高于肝癌組織，p21是p53的一個主要靶點(diǎn)，在檢測到DNA損傷時，它與細(xì)胞周期阻滯(調(diào)節(jié)G1期向S期的過渡)有關(guān)[14]。胃癌組織p21水平明顯降低，低水平p21與胃腫瘤侵襲情況及TNM分期相關(guān)[15]。p21在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤組織和細(xì)胞系中表達(dá)均下調(diào)，可用于區(qū)分彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤和正常組織[16]。SAHA通過調(diào)控p21啟動子乙?；阶铚?xì)胞周期S期，影響乳腺癌 MCF-7 細(xì)胞周期[17]。p21直接抑制細(xì)胞周期G1/S期來抑制CDK2、CDK4、CDK6的激酶活性[18]。p21激活激酶 4(PAK4)與乳腺癌的非停泊性生長、存活、轉(zhuǎn)移有關(guān)[19]。最近的研究顯示辣椒堿干預(yù)可明顯上調(diào)p21表達(dá)，抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖[20]。與此一致的是本研究結(jié)果顯示，余甘子呈濃度依賴性上調(diào)p21，提示余甘子抑制三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖的分子機(jī)制可能與上調(diào)p21有關(guān)。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，余甘子可抑制MDA-MB-231細(xì)胞體外增殖，將細(xì)胞周期阻滯在G1/S期，從而促進(jìn)三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡，其機(jī)制可能與上調(diào)CyclinG2和p21 mRNA 水平有關(guān)，高表達(dá)CyclinG2、p21基因的患者與低表達(dá)的患者相比預(yù)后較好。

本研究的結(jié)論是在細(xì)胞水平上得出的，并未結(jié)合余甘子干預(yù)后的病例資料分析。