吳小可，張玉佩，王 秀，吳 楠，王衛(wèi)東，梅麗娟，陶燕鐸，楊小兵，于瑞濤*

(1.中國科學(xué)院藏藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青海省藏藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國科學(xué)院西北高原生物研究所，青海 西寧 810008；2. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3. 東莞金美濟(jì)藥業(yè)有限公司，廣東 東莞 523000)

菊科約1000屬，25000～30000種，主要分布于溫帶地區(qū)，是被子植物第一大科，也是植物界演化地位最高的科。我國的菊科植物約有230屬，2323種，全國各地均有分布。菊科植物最大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值為藥用，我國藥用菊科植物有155屬，778種[1-2]，屬數(shù)和種數(shù)分別占我國菊科植物總數(shù)的67.39%和33.49%。其中，蒿屬68種，風(fēng)毛菊屬53種，橐吾屬35種，紫菀屬34種，香青屬18種，蟹甲草屬16種，垂頭菊屬13種[3]。菊科主要化學(xué)成分有多糖類、生物堿類、甙類、黃酮類、香豆素類、萜類等。黃酮類化合物是廣泛存在于自然界中的一類化合物，種類眾多，其生理生化活性多種多樣，大多具有擴(kuò)張冠狀血管、降血脂、止血、雌激素樣作用、抗抑郁、抗菌、抗病毒、抗腫瘤等活性[4-7]。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，使用HPLC法測定總黃酮醇苷含量的方法多應(yīng)用于銀杏及其提取物或成藥，對(duì)菊科植物總黃酮醇苷含量進(jìn)行測定未見報(bào)道[8-14]。本研究采用HPLC法對(duì)青海產(chǎn)18種菊科植物進(jìn)行總黃酮醇苷的含量進(jìn)行分析，以期為菊科植物的進(jìn)一步研究開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

本研究選取的18種菊科植物分別為：牛蒡子、絹毛菊、掌葉橐吾、蛛毛蟹甲草、臭蒿、垂頭菊、黃帚橐吾、美麗風(fēng)毛菊、水母雪蓮、多花亞菊、川西小黃菊、冷蒿、箭葉橐吾、柔軟紫菀、乳白香青、狗娃花、珠光香青、紫菀木。

1.1.2 試劑

槲皮素(批號(hào)117395)對(duì)照品(如吉生物科技，含量>98%)、山柰素(批號(hào) 1108612200606)對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所，含量>98%)、異鼠李素(批號(hào)1108612200407)對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所，含量>98%)，HCl含量36%～38%鹽酸(甘肅省鹽鍋峽化工總廠)，分析純甲醇(天津市凱通化學(xué)試劑有限公司)，色譜用超純水(優(yōu)普超純水機(jī)自制)，色譜甲醇、甲酸(天津康科德科技公司) 。

1.2 儀器與設(shè)備

FZ102型微型植物試樣粉碎機(jī)(北京市永光明醫(yī)療儀器廠)，F(xiàn)A1204電子分析天平(力辰科技寧波市鄭州華豐電子儀器廠)，KQ5200E超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，優(yōu)普超純水機(jī)(四川成都超純科技有限公司)，恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)，Agilent 1260高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件

1.3.2 樣品溶液制備

1.3.2.1 甲醇-25%鹽酸溶液(4∶1)混合溶液制備 HCl含量36%～38%的鹽酸溶液與純水按照7∶3進(jìn)行混合，配置成HCl含量25%的鹽酸溶液。HCl含量25%的鹽酸溶液與甲醇按照1∶4進(jìn)行混合，配置成甲醇-25% 鹽酸溶液(4∶1)混合溶液。

1.3.2.2 樣品溶液制備 將藥用植物用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎。稱取植物粉末1 g，置于250 mL平底燒瓶中，加入甲醇-25%鹽酸溶液(4∶1)混合溶液50 mL。80℃水浴回流1 h，靜置至室溫。用注射器吸取，0.45 μm微孔濾膜過濾至液相小瓶，HPLC測定。

1.3.3 對(duì)照品溶液制備

1.3.3.1 槲皮素單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)液制備 精確稱取槲皮素10.6 mg，于燒杯中用少量甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶，用少量甲醇洗滌燒杯數(shù)次，轉(zhuǎn)移洗滌液至容量瓶，用甲醇定容至刻度，配置成212 μg/mL單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)液。于4℃冰箱保存。

圖1 對(duì)照品與樣品的HPLC分析色譜圖Fig. 1 HPLC chromatogram of reference and sample注：A 對(duì)照品(Reference substance);B 紫菀木樣品(Asterothamnus alyssoides (Turcz.) Novopokr.);1 槲皮素(Quercetin)；2 山柰素(Kaempferol)；3 異鼠李素(Kaempferol)

1.3.3.2 山柰素單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)液制備 精確稱取山柰素10.6 mg，于燒杯中用少量甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶，用少量甲醇洗滌燒杯數(shù)次，轉(zhuǎn)移洗滌液至容量瓶，用甲醇定容至刻度。存在少量未溶沉淀，超聲5 min使其溶解。配置成212 μg/mL單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)液。于4℃冰箱保存。

1.3.3.3 異鼠李素單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)液制備 精確稱取槲皮素9.3 mg，于燒杯中用少量甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶，用少量甲醇洗滌燒杯數(shù)次，轉(zhuǎn)移洗滌液至容量瓶，用甲醇定容至刻度。存在少量未溶沉淀，超聲5 min使其溶解。配置成186 μg/mL單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)液。于4℃冰箱保存。

水解大麥蛋白具乳化能力，有抗氧性能，適合用作護(hù)膚調(diào)理性原料；也用于護(hù)發(fā)制品，在洗發(fā)燙發(fā)卷發(fā)劑等中作護(hù)理劑。

1.3.3.4 混標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)液制備 分別用移液槍吸取三種單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)液5 mL轉(zhuǎn)移至另一50 mL容量瓶，甲醇定容至刻度，配置成混標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)液，槲皮素、山柰素、異鼠李素濃度分別為21.2 μg/mL、21.2 μg/mL、18.6 μg/mL。于4℃冰箱保存。

1.3.4 線性關(guān)系考察

將槲皮素、山柰素、異鼠李素單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)液分別稀釋為1、2.5、5、10、20、200倍，HPLC測定，分別以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程。

1.3.5 精密度試驗(yàn)

將混標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)液用移液槍吸取1 mL至液相小瓶，平行6次，HPLC測定。

1.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

稱取植物粉末1 g，置于250 mL平底燒瓶中，加入甲醇-25%鹽酸溶液(4∶1)混合溶液50 mL。80℃水浴回流1 h，靜置至室溫。用注射器吸取，有機(jī)濾膜過濾至液相小瓶，分別于0、2、4、6、8、10、12 h時(shí)HPLC測定。

1.3.7 重復(fù)性試驗(yàn)

平行6次，稱取植物粉末1 g，置于250 mL平底燒瓶中，加入甲醇-25%鹽酸溶液(4∶1)混合溶液50 mL。80℃水浴回流1 h，靜置至室溫。用注射器吸取，有機(jī)濾膜過濾至液相小瓶，HPLC測定。

1.3.8 樣品含量測定

將藥用植物用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎。稱取植物粉末1 g，置于250 mL平底燒瓶中，加入甲醇-25%鹽酸溶液(4∶1)混合溶液50 mL。80℃水浴回流1 h，靜置至室溫。用注射器吸取，有機(jī)濾膜過濾至液相小瓶，HPLC測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系結(jié)果

結(jié)果如表1，槲皮素、山柰素和異鼠李素的濃度分別在線性范圍1.06～212 μg/mL、1.06～212 μg/mL和0.93～186 μg/mL內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果(n=6)

2.2 精密度結(jié)果

結(jié)果如表2，槲皮素、山柰素、異鼠李素峰面積的RSD分別為1.05%、1. 06%、0. 91%，表明本方法精密度良好。

2.3 穩(wěn)定性結(jié)果

結(jié)果如表3，槲皮素、山柰素、異鼠李素的RSD分別為0.75%、0.84%、0.33%，表明樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 重復(fù)性結(jié)果

總黃酮醇苷含量=(槲皮素含量+山柰素含量+異鼠李素含量)×2.51，結(jié)果如表4，計(jì)算得總黃酮醇苷平均含量為1.23%，RSD為1.86%，表明本方法重復(fù)性良好。

表2 精密度試驗(yàn)測定結(jié)果(n=6)

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)測定結(jié)果(n=7)

表4 重復(fù)性試驗(yàn)測定結(jié)果(n=6)

2.5 樣品含量結(jié)果

總黃酮醇苷含量=(槲皮素含量+山柰素含量+異鼠李素含量)×2.51，計(jì)算總黃酮醇苷品均含量，結(jié)果如表5。所測18種菊科植物中，總黃酮醇苷含量在0.1278～12.1721 mg/g之間，從小到大依次為牛蒡子、絹毛菊、掌葉橐吾、蛛毛蟹甲草、臭蒿、垂頭菊、黃帚橐吾、美麗風(fēng)毛菊、水母雪蓮、多花亞菊、川西小黃菊、冷蒿、箭葉橐吾、柔軟紫菀、乳白香青、狗娃花、珠光香青、紫菀木。

表5 樣品總黃酮醇苷含量測定結(jié)果

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)考察了不同流動(dòng)相和洗脫時(shí)間條件下的出峰效果，結(jié)果表明，采用流動(dòng)相甲醇-0.2%甲酸溶液(48∶52)，洗脫時(shí)間40 min，各峰峰形完整無拖尾，分離效果好。3種黃酮醇苷在紫外360 nm處有較強(qiáng)紫外吸收，因此確定HPLC檢測波長360 nm[15]。甲醇-25%鹽酸溶液(4∶1)混合溶液作用下，供試品中的黃酮類化合物充分水解為黃酮苷元[16]。水浴加熱80℃，回流1 h的方法，能有效提高黃酮醇苷的提取率，回流時(shí)間過長會(huì)導(dǎo)致部分黃酮苷元分解從而降低提取率[17-19]。綜合考慮，提取方法最終確定為，甲醇-25%鹽酸溶液(4∶1)混合溶液，水浴加熱80℃，回流1 h。檢測條件選取，HPLC檢測波長360 nm，流動(dòng)相甲醇-0.2%甲酸溶液(48∶52)，洗脫時(shí)間40 min。

所測18種菊科植物進(jìn)行不同屬之間的對(duì)比可知，紫菀木屬、香青屬、狗娃花屬、紫菀屬等植物總黃酮醇苷含量較高，可作為總黃酮醇苷類化合物提取分離純化的來源；而牛蒡?qū)?、菊苣屬、蟹甲草屬等植物中含量較低，建議開發(fā)其他應(yīng)用價(jià)值。另外，在同屬不同種植物之間進(jìn)行對(duì)比，蒿屬中，冷蒿含量高于臭蒿；橐吾屬中，箭葉橐吾含量高于黃帚橐吾，黃帚橐吾含量高于掌葉橐吾；香青屬中，珠光香青高于乳白香青，同屬植物之間總黃酮醇苷含量相差較大，不具有分類學(xué)上的統(tǒng)一性。

本研究以槲皮素、山柰素和異鼠李素為對(duì)照品，應(yīng)用高效液相色譜法，測定青海產(chǎn)多種菊科植物的總黃酮醇苷含量。該方法準(zhǔn)確穩(wěn)定，重復(fù)性好，可用于菊科植物的質(zhì)量控制，也可為更深入地研究菊科植物、開發(fā)其應(yīng)用價(jià)值奠定理論基礎(chǔ)。