吉米麗汗·司馬依，買買提明·努爾買買提，季志紅，艾尼瓦爾·吾買爾，買爾旦·玉蘇甫，周文婷*

1新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊 830011；2新疆醫(yī)科大學(xué)維吾爾醫(yī)學(xué)院；3新奇康藥業(yè)股份有限公司

寒喘祖帕顆粒是新疆中醫(yī)藥-民族醫(yī)藥之一，由小茴香、芹菜子、神香草、玫瑰花、蕓香草、蕁麻子、鐵線蕨、胡蘆巴和甘草浸膏等9味藥材組成，載于中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)維吾爾藥分冊(cè)，其功效是鎮(zhèn)咳、化痰、溫肺止喘[1～2]。臨床研究[3～6]報(bào)道，寒喘祖帕顆粒治療毛細(xì)支氣管炎能快速緩解臨床癥狀，提高治療有效率。寒喘祖帕顆粒作為復(fù)方，其藥味多、成分較多、藥理作用復(fù)雜，目前寒喘祖帕顆粒作用于毛細(xì)支氣管炎的藥理作用機(jī)制尚未系統(tǒng)闡明。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是新藥發(fā)現(xiàn)的先進(jìn)途徑，可系統(tǒng)地解釋藥物對(duì)疾病的作用機(jī)制。2019年10月～2012年12月，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法系統(tǒng)地揭示寒喘祖帕顆粒治療毛細(xì)支氣管炎的活性成分及活性成分靶基因，探討寒喘祖帕顆粒治療毛細(xì)支氣管炎靶基因的生物學(xué)功能及相關(guān)信息通路。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)及軟件 TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php，整合Swiss-Prot、TrEMBL和PIR-PSD 三大數(shù)據(jù)庫(kù)的蛋白質(zhì)綜合數(shù)據(jù)庫(kù))； Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)。DAVID(版本：6.8)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/，是全面提供功能注釋、可視化和集成發(fā)現(xiàn)的工具)。DiSGeNET(http://www.disgenet.org/)CTD(http://ctdbase.org/)、TTD(https://db.idrblab.org/ttd/)、DrugBank(https://www.drugbank.ca)數(shù)據(jù)庫(kù)。String(版本：11.0)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org，搜索已知蛋白和預(yù)測(cè)蛋白之間相互作用的系統(tǒng))。PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)(包括有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)的及化學(xué)模組的數(shù)據(jù)庫(kù))。PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.rcsb.org，是蛋白質(zhì)、多糖、核酸、病毒等生物大分子的三維結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)庫(kù))。Cytoscape(版本：3.7.1，是一款圖形化顯示復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行分析和編輯的軟件)。

1.2 寒喘祖帕顆粒藥材活性成分的篩選、活性成分靶基因的預(yù)測(cè)及藥材—活性成分—靶基因網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)收集寒喘祖帕顆粒9味藥材的化學(xué)成分。收集所得的所有化學(xué)成分通過藥物口服生物利用度(OB)、Caco-2 細(xì)胞滲透性、血腦屏障(BBB)等ADME參數(shù)的限制對(duì)其中可能的活性成分進(jìn)行篩選、分析。寒喘祖帕顆粒9味藥材活性成分的篩選標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[7～8]：OB≥30、BBB≥0.3、Caco-2≥-0.4為藥物的生物活性成分。

找到寒喘祖帕顆粒藥材生物活性成分后，通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)收集寒喘祖帕顆粒9味藥材活性成分對(duì)應(yīng)的靶基因。然后，將所有靶基因通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)以“Homo sapiens”(人屬)為關(guān)鍵詞進(jìn)行基因—蛋白名稱轉(zhuǎn)化，即將全部蛋白名稱轉(zhuǎn)換為基因名稱。并將寒喘祖帕顆粒的藥材、活性成分和靶基因通過Cytoscape3.7.1軟件構(gòu)建藥材—活性成分—靶基因網(wǎng)絡(luò)圖(HB-cC-cT Network)。網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)自由度(Degree)代表在蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中與該節(jié)點(diǎn)直接相互作用的節(jié)點(diǎn)的數(shù)目。節(jié)點(diǎn)的大小與度數(shù)成正比。節(jié)點(diǎn)的度越大則其參與的生物功能越多，其生物學(xué)重要性越強(qiáng)[9]。

1.3 毛細(xì)支氣管炎發(fā)病相關(guān)靶基因的篩選及藥物-疾病共同潛在靶基因的篩選 以 “Bronchiolitis” 作為關(guān)鍵詞，對(duì)4大常用數(shù)據(jù)庫(kù)(包括CTD、TTD、DiSGeNET、DrugBank)進(jìn)行已知的毛細(xì)支氣管炎發(fā)病相關(guān)靶基因的檢索及篩選，并刪除檢索結(jié)果中重復(fù)的靶基因，獲得毛細(xì)支氣管炎發(fā)病過程已知的靶基因。然后將毛細(xì)支氣管炎的發(fā)病相關(guān)靶基因通過String數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白—蛋白相互作用分析。對(duì)置信度(Score)得分設(shè)定閾值，對(duì)蛋白相互作用進(jìn)行篩選[10]。以Score≥0.9和“Human Sapiens”為關(guān)鍵詞篩選得到毛細(xì)支氣管炎發(fā)病相關(guān)的主要靶基因，并構(gòu)建成蛋白—蛋白相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖。將毛細(xì)支氣管炎發(fā)病相關(guān)主要靶基因與寒喘祖帕顆?；钚猿煞职谢蜻M(jìn)行交集，得到藥物-疾病共有的潛在靶基因，并用Cytoscape3.7.1軟件構(gòu)建藥材-潛在成分-潛在靶基因網(wǎng)絡(luò)圖(HB-pC-pT Network)。

1.4 寒喘祖帕顆粒—毛細(xì)支氣管炎共同潛在靶基因生物學(xué)功能及信號(hào)通路分析 將寒喘祖帕顆粒-毛細(xì)支氣管炎共同潛在靶基因通過DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO基因功能(P≤0.01)和KEGG通路分析(FDR，錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率≤0.01)。P值和FDR在富集分析中越小，代表富集顯著程度越高。

2 結(jié)果

2.1 寒喘祖帕顆粒9味藥材的成分、活性成分及活性成分靶基因、藥材-活性成分-活性成分靶基因網(wǎng)絡(luò) 寒喘祖帕顆粒的9味藥材收集到240個(gè)成分，分別為甘草115個(gè)、玫瑰花42個(gè)、小茴香26個(gè)、葫蘆巴12個(gè)、蕓香草12個(gè)、神香草12個(gè)、芹菜籽8個(gè)、蕁麻子7個(gè)和鐵線蕨6個(gè)。將240個(gè)成分以O(shè)B≥30、BBB≥0.3、Caco-2≥-0.4為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選得到14個(gè)可能的活性成分，分別為β-谷甾醇(Beta-sitosterol)、槲皮素(Quercetin)、木犀草素(Luteolin)、檸檬烯(Limonene)、咖啡酸(Caffeic acid)、β-胡蘿卜素(Beta-carotene)、山奈酚(Kaempferol)、茴腦(Anethole)、HEX、Heptan、(L)-alpha-Terpineol、3-methylhexane和齊墩果酸(Oleanolic acid)，詳見表1。

表1 寒喘祖帕的可能活性成分

14個(gè)活性成分對(duì)應(yīng)385個(gè)相關(guān)靶基因，刪除重復(fù)的靶基因名稱后得到197個(gè)靶基因。藥材、活性成分和靶基因之間的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)由220個(gè)節(jié)點(diǎn)(9個(gè)藥材、14個(gè)活性成分和197個(gè)活性成分靶基因)和419個(gè)邊緣組成。從靶基因角度分析，PTGS2(Prostaglandin G/H synthase 2)、NCOA2(Nuclear receptor coactivator 2)、CASP3(Caspase-3)、JUN(Transcription factor AP-1)、CASP9(Caspase-9)、PTGS1(Prostaglandin G/H synthase1)、HSP90AA1(Heat shock protein HSP 90 alpha)、GABRA1(Gamma-aminobutyric acid receptor subunit alpha-1)、CHRM1(Muscarinic acetylcholine receptor M1)和HMOX1(Heme oxygenase 1)等靶基因的Degree比較大。從成分角度分析，槲皮素(degree=143)、山奈酚(degree=59)、木犀草素(degree=54)、β-谷甾醇(degree=36)和β-胡蘿卜素(degree=22)等成分的節(jié)點(diǎn)度比較大。

2.2 毛細(xì)支氣管炎發(fā)病相關(guān)的特異性靶基因及藥物-疾病共有潛在靶基因 CTD、TTD、DrugBank、DiSGeNET分別檢索到377、0、2、65個(gè)毛細(xì)支氣管炎發(fā)病過程中相關(guān)的靶基因，刪除重復(fù)靶基因，共檢索到419個(gè)已知的毛細(xì)支氣管炎發(fā)病相關(guān)的靶基因。String數(shù)據(jù)庫(kù)篩選得到214個(gè)毛細(xì)支氣管炎發(fā)病相關(guān)特異性靶基因。將214個(gè)疾病特異性靶基因與靶基因進(jìn)行交集，得到50個(gè)寒喘祖帕顆粒—毛細(xì)支氣管炎共有的潛在靶基因。

2.3 寒喘祖帕顆粒—毛細(xì)支氣管炎疾病共有潛在靶基因 寒喘祖帕9味藥材的8個(gè)潛在成分作用于50個(gè)毛細(xì)支氣管炎發(fā)病相關(guān)特異性靶基因。50個(gè)潛在毛細(xì)支氣管炎發(fā)病相關(guān)特異性靶基因中VEGF、BCL2、TNF、IL2、TGFB1、HMOX1、MMP2、CASP3、RELA、NFKB1A等靶基因可能是寒喘祖帕顆粒發(fā)揮治療毛細(xì)支氣管炎作用的潛在靶基因。HB-pC-pT網(wǎng)絡(luò)見圖1。

注：八角形代表9味藥材；四角形代表8個(gè)潛在成分；圓形代表50個(gè)潛在靶基因

圖1 HB-pC-pT 網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 寒喘祖帕顆粒-毛細(xì)支氣管炎共同潛在靶基因生物學(xué)功能及信號(hào)通路 50個(gè)寒喘祖帕顆粒-毛細(xì)支氣管炎共同潛在靶基因 GO基因功能分析結(jié)果顯示，前10個(gè)基因功能包括RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、凋亡過程、ERK1和ERK2級(jí)聯(lián)的正調(diào)節(jié)、體液免疫反應(yīng)、上皮細(xì)胞增殖的正向調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)的陽(yáng)性調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)磷酸化、細(xì)胞因子分泌的正向調(diào)節(jié)。

共收集21條主要信號(hào)通路。包括HIF-1信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、cAMP信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、NF-κB 信號(hào)通路、T和B細(xì)胞信號(hào)通路、P53信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡、Jak-STAT信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路、RIG-I樣受體信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路和Toll樣受體信號(hào)通路等15條與產(chǎn)生炎性免疫反應(yīng)有關(guān)的信號(hào)通路，催乳素信號(hào)通路、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素信號(hào)通路、鞘脂信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路和GnRH信號(hào)通路等6條神經(jīng)、內(nèi)分泌相關(guān)的通路。其中NF-κB信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、Toll 樣受體信號(hào)通路、JAK/STAT信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路、NOD 樣受體信號(hào)通路等7條信號(hào)通路與毛細(xì)支氣管炎密切相關(guān)。

3 討論

毛細(xì)支氣管炎是常見的兒童下呼吸道感染，由病毒感染引起的，最常見的病原體為呼吸道合胞體病毒(RSV)[11]。RSV病毒通過破壞氣道上皮細(xì)胞間緊密連接，促進(jìn)黏膜蛋白的分泌，影響氣道上皮細(xì)胞的屏障功能[12]。氣道上皮細(xì)胞間的頂端連接復(fù)合物與其表面的黏液層構(gòu)成了抵御病原微生物入侵的屏障。參與黏附連接的主要有上皮鈣黏蛋白(E-cadherin)、β- 連環(huán)蛋白(β-catenin)及α-連環(huán)蛋白(α-catenin)[13]。

為尋找寒喘祖帕顆粒治療毛細(xì)支氣管炎活性成分、靶基因，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)[TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)為公開的中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)]篩選寒喘祖帕顆粒的活性成分及其靶基因，同時(shí)通過CTD、TTD、DiSGeNET、DrugBank (收集了多種疾病相關(guān)基因的數(shù)據(jù)庫(kù))等四大疾病數(shù)據(jù)庫(kù)收集毛細(xì)支氣管炎相關(guān)靶基因，收集寒喘祖帕顆粒-毛細(xì)支氣管炎共同的潛在靶基因，構(gòu)建寒喘祖帕顆粒藥材-潛在活性成分-潛在靶基因網(wǎng)絡(luò)，找出了寒喘祖帕顆粒治療毛細(xì)支氣管炎活性成分、靶基因，并采用生物信息學(xué)分析了靶基因的生物學(xué)功能。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果表明，寒喘祖帕顆粒中的活性成分槲皮素、山奈酚、木犀草素、β-谷甾醇、β-胡蘿卜素、咖啡酸、茴腦和齊墩果酸等在網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)度比較大，意味著參與的生物功能多，其生物學(xué)重要性越強(qiáng)，是寒喘祖帕顆粒治療毛細(xì)支氣管炎的潛在成分。RSV感染氣道上皮細(xì)胞后下調(diào)E-cadherin的表達(dá)，致緊密連接相關(guān)蛋白易位，導(dǎo)致氣道黏膜屏障功能受損。最新研究[14]報(bào)道證明，VEGFR磷酸化和TGF-β1是導(dǎo)致E-cadherin介質(zhì)的屏障功能受損的重要因素。其中TGF-β1是誘導(dǎo)上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過程的關(guān)鍵靶基因[15]。研究[16]證明，山奈酚抑制TGF-β1mRNA 的表達(dá)，槲皮素抑制 TGF-β1誘導(dǎo)下A549細(xì)胞 E-cadherin的表達(dá)[17]，木犀草素對(duì)肝纖維化進(jìn)程中TGF-β1誘導(dǎo)的肝細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化有抑制作用[18]。而VEGF是表皮生長(zhǎng)因子受體，可參與上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)、修復(fù)和瘤變，在黏蛋白的分泌、細(xì)胞間緊密連接的調(diào)控中起重要作用[19～20]。最新研究[14]報(bào)道，RSV感染氣道上皮細(xì)胞可活化VGFR，下調(diào)氣道上皮細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白E-cadherin的表達(dá)，從而破壞氣道黏膜的屏障功能。由此推測(cè)，寒喘祖帕顆粒的潛在成分主要阻止RSV與氣道上皮細(xì)胞的E-cadherin結(jié)合，從而在毛細(xì)支氣管炎治療中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

毛細(xì)支氣管炎與哮喘免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制相似，主要是細(xì)胞因子的變化，即細(xì)胞因子趨化內(nèi)皮細(xì)胞在肺部聚集使之激活并釋放炎癥介質(zhì)和病毒蛋白損傷氣道黏膜上皮，導(dǎo)致呼吸困難及喘憋[21]。研究[22]報(bào)道，血清中可溶性IL-2受體升高，使T細(xì)胞和NK細(xì)胞活性受阻，對(duì)RSV的清除能力降低。由此推測(cè)，寒喘祖帕顆?？赡芡ㄟ^IL-2對(duì)毛細(xì)支氣管炎癥反應(yīng)過程產(chǎn)生影響。

NF-κB信號(hào)通路和MAPK參與氣道上皮細(xì)胞高分泌與炎癥反應(yīng)。Toll 樣受體信號(hào)通路與RSV誘導(dǎo)氣道炎癥相關(guān)[23]。JAK/STAT信號(hào)通路和FoxO信號(hào)通路調(diào)控氣道黏蛋白高分泌[24～25]。NOD 樣受體信號(hào)通路和TNF信號(hào)通路與毛細(xì)支氣管炎氣道炎癥反應(yīng)的發(fā)生有關(guān)[26]。研究發(fā)現(xiàn)，TLR4/NF-κB信號(hào)通路的激活在氣道上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，而槲皮素可以通過下調(diào)氣道上皮 TLR4/NF-κB 表達(dá)，減輕氣道的炎癥反應(yīng)。β-谷甾醇能夠抑制炎癥因子TNF-α和IL-6的表達(dá)，且可以下調(diào)NF-κB信號(hào)通路的活化[27]。本研究結(jié)果表明，以上的NF-κB、MAPK、JAK/STAT、FoxO、TNF和NOD 樣受體信號(hào)通路均符合FDR≤0.01，這與前期報(bào)道相符合。

綜上所述，寒喘祖帕顆粒9味藥材共收集到14個(gè)活性成分β-谷甾醇、槲皮素等及197個(gè)活性成分靶基因，寒喘祖帕顆粒-毛細(xì)支氣管炎共有的潛在靶基因50個(gè)。藥物疾病共有潛在靶基因主要參與炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、凋亡過程等生物學(xué)功能，主要信號(hào)通路有JAK/STAT信號(hào)通路、NOD 樣受體信號(hào)通路和TNF信號(hào)通路等。寒喘祖帕顆粒的槲皮素、山奈酚、木犀草素、β-谷甾醇、β-胡蘿卜素、咖啡酸、茴腦和齊墩果酸等活性成分可能作用于TGF-β1、VGFR、TNF-β、IL-6、IL-2，抑制氣道黏膜上皮細(xì)胞屏障和肺內(nèi)炎癥介質(zhì)的釋放而發(fā)揮治療毛細(xì)支氣管炎的作用，但其具體的藥理作用仍需要通過臨床實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。