林建 林淑芳 戴志松 趙永 魏淑貞 周銀發(fā)

非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculosis mycobacteria, NTM)是一種重要的條件致病菌, 是指除結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和麻風(fēng)分枝桿菌以外的分枝桿菌，目前已鑒定出170余種[1]。其廣泛存在于自然環(huán)境中，也可生長在人為環(huán)境中；可定植、感染人體或?qū)е翹TM病的發(fā)生，主要危害慢性肺部疾病患者、免疫力低下患者及醫(yī)院感染人群[2-4]。根據(jù)全國及福建省結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，福建省NTM的檢出率高于2010年全國流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果，并呈上升趨勢[4-5]。NTM具有種類多及天然多耐藥等特點(diǎn)，導(dǎo)致NTM病診治較為困難，而目前尚未建立公認(rèn)的兼?zhèn)淞畠r、快速、敏感度和特異度較高等特點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化診斷技術(shù)[6]，因此了解 NTM菌種分布及流行病學(xué)特征對于NTM病早期防治具有重要指導(dǎo)意義。筆者通過對福建省各耐藥監(jiān)測點(diǎn)收集的疑似NTM病患者的標(biāo)本進(jìn)行菌種鑒定和流行病學(xué)分析，為福建省制定NTM病防治策略提供科學(xué)依據(jù)。

資料和方法

一、一般資料

菌株來源于福建省9個省級耐藥監(jiān)測點(diǎn)(每個地市1個縣作為監(jiān)測點(diǎn))以及2個國家級耐藥監(jiān)測點(diǎn)(漳州市龍海市與龍巖市長汀縣)。共收集2016—2018年11個監(jiān)測點(diǎn)發(fā)現(xiàn)的190例疑似NTM病的菌株標(biāo)本。本研究患者基本信息和資料來自于《全國結(jié)核病耐藥性監(jiān)測實(shí)施方案》中提供的《結(jié)核病耐藥性監(jiān)測患者信息表》，以及中國疾病預(yù)防控制中心的《結(jié)核病管理信息系統(tǒng)》。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1. 初步菌種鑒定：采用對硝基苯甲酸(P-nitrobenzoic acid, PNB)試驗(yàn)進(jìn)行初步菌種鑒定。嚴(yán)格按照《結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序及質(zhì)量保證手冊》[7]要求，將監(jiān)測點(diǎn)收集的痰標(biāo)本分離培養(yǎng)的陽性產(chǎn)物，在中性固體培養(yǎng)基上傳代，取3周的亞培養(yǎng)物經(jīng)磨菌及稀釋到最終濃度為10-1mg/ml，接種到含PNB的固體培養(yǎng)基上，并設(shè)立陽性(堪薩斯分枝桿菌)與陰性對照(結(jié)核分枝桿菌H37RV)。培養(yǎng)基采用珠海貝索生物科技有限公司生產(chǎn)的中性及含PNB的改良羅氏培養(yǎng)基。

2. 熒光PCR熔解曲線法：將初步鑒定為NTM的190例感染者的菌株標(biāo)本，采用熒光PCR熔解曲線法進(jìn)行菌種鑒定。試劑盒采用廈門致善生物科技股份有限公司生產(chǎn)的分枝桿菌鑒定試劑盒，該試劑盒可覆蓋19種分枝桿菌。嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，對樣品進(jìn)行提取和擴(kuò)增，并設(shè)立陰性與陽性對照，根據(jù)檢測樣品各通道中熔解曲線的熔點(diǎn)組合來判斷分枝桿菌類型。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

通過Excel 2016軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及患者信息進(jìn)行整理，采用SPSS 24.0軟件對感染NTM患者的信息進(jìn)行描述性分析。采用非參數(shù)檢驗(yàn)分析不同特征患者感染的NTM菌種分布特征，采用卡方檢驗(yàn)比較感染胞內(nèi)分枝桿菌與非胞內(nèi)NTM患者特征，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、菌種鑒定結(jié)果

190例疑似NTM病菌株標(biāo)本中，12例未檢出分枝桿菌(6.3%)，17例僅檢出結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)(9.0%)，其余161例均檢出NTM(84.7%)，其中8例不在試劑盒所涵蓋的19種分枝桿菌范圍內(nèi)，鑒定結(jié)果為其他分枝桿菌。除其他分枝桿菌外，共檢出8種NTM。98例檢出胞內(nèi)分枝桿菌，占60.9%(98/161)，膿腫分枝桿菌占19.9%(32/161)。其中2例為NTM間混合感染，6例為MTB與NTM混合感染(表1)。

二、NTM感染者基本情況

161例感染NTM患者中，最小年齡22歲，最大年齡84歲，平均年齡(57.3±13.0)歲，主要集中在45～60歲間，占60.9%(98/161)；男113例，占70.2%；本地戶籍140例，占87.0%；農(nóng)民工117例，占72.7%；漢族157例，占97.5%；125例患者現(xiàn)住址在沿海城市，占77.6%。非參數(shù)檢驗(yàn)結(jié)果表明不同性別、年齡及民族患者感染的NTM菌種分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；除<30歲外，其他年齡段均是胞內(nèi)分枝桿菌占比最高；男性患者不僅例數(shù)較多且菌種類別也較多，4例偶然分枝桿菌中有3例為女性患者感染；少數(shù)民族患者僅4例且均為非胞內(nèi)NTM感染(表2)。

表1 190例疑似NTM病患者標(biāo)本的菌種鑒定結(jié)果

表2 患者各類社會人口學(xué)特征在161例不同NTM感染者中的分布

注a：序號代表的菌種參照表1

表3 各類社會人口學(xué)特征在胞內(nèi)分枝桿菌與非胞內(nèi)分枝桿菌感染患者中的分布

三、感染胞內(nèi)分枝桿菌患者的臨床特征及其與非胞內(nèi)分枝桿菌間的比較

98例胞內(nèi)分枝桿菌感染患者，年齡最小24歲，最大84歲，平均年齡(58.23±11.70)歲，主要集中在45～60歲之間，占63.3%；男性占71.4%，農(nóng)民工占76.5%，本地戶籍占88.8%，現(xiàn)住址為沿海者占74.5%。感染胞內(nèi)分枝桿菌與非胞內(nèi)分枝桿菌患者間性別、年齡、職業(yè)、戶籍以及現(xiàn)住址是否沿海差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.185、4.202、1.879、0.731、1.431，P值均>0.05)；另外，研究中發(fā)現(xiàn)感染胞內(nèi)分枝桿菌患者均為漢族，而感染非胞內(nèi)分枝桿菌患者有4例為少數(shù)民族(χ2=4.029,P<0.05)(表3)。

討 論

福建省161例NTM病患者主要為本地戶籍，并且以漢族、男性、中老年人、農(nóng)民工居多，且不同性別、年齡、民族間NTM菌種分布差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；本地戶籍及漢族人群基數(shù)較大，而男性、農(nóng)民工和中老年人有喝酒、抽煙等不良習(xí)慣較多，存在呼吸道基礎(chǔ)疾病，或由于其經(jīng)常在戶外的工作性質(zhì)易接觸到水和土壤中的NTM有關(guān)[8-10]。因此，具有本地戶籍、漢族、男性、中老年或農(nóng)民工這些社會人口學(xué)特征的人群是NTM病防治的重點(diǎn)人群，在防治過程中需有針對性地采取相應(yīng)的措施。值得關(guān)注的是，研究中發(fā)現(xiàn)偶然分枝桿菌感染者4例，其中3例是女性患者；少數(shù)民族患者僅4例且均是感染非胞內(nèi)分枝桿菌，由于樣本量較少，部分NTM是否存在易感人群，需進(jìn)一步增大樣本量進(jìn)行深入研究。

既往研究表明，NTM菌種分布存在地域特點(diǎn)，不同國家或同一個國家不同地區(qū)都會存在明顯不同的分布特點(diǎn)[11-12]。我國NTM主要以胞內(nèi)分枝桿菌和膿腫分枝桿菌為主，但以何種居多，又存在不同的地域特點(diǎn)。北京和上海等地區(qū)主要以胞內(nèi)分枝桿菌分布居多，而廣東及重慶等省份以膿腫分枝桿菌居多[10,13-15]。本研究結(jié)果顯示，福建省的NTM主要以胞內(nèi)分枝桿菌為主，其次是膿腫分枝桿菌，但現(xiàn)住址為內(nèi)陸和沿海的NTM菌種分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。目前，尚未明確NTM這種地域分布是何種原因或何種機(jī)制導(dǎo)致的，仍需進(jìn)一步收集數(shù)據(jù)開展相應(yīng)的研究。通過比較感染胞內(nèi)分枝桿菌和非胞內(nèi)分枝桿菌患者的特征，結(jié)果表明雖然感染胞內(nèi)分枝桿菌的患者占絕大多數(shù)，但其年齡、性別、職業(yè)、戶籍，以及現(xiàn)住址是否沿海等社會人口學(xué)特征卻與感染非胞內(nèi)分枝桿菌患者間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明不同特征的患者對于胞內(nèi)分枝桿菌與非胞內(nèi)分枝桿菌的易感性無明顯的差別。另外，研究中發(fā)現(xiàn)感染胞內(nèi)分枝桿菌的患者均為漢族，而感染非胞內(nèi)分枝桿菌患者中有4例為少數(shù)民族，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但由于少數(shù)民族患者例數(shù)較少，因此這是否與患者的居住環(huán)境及易感性有關(guān)，仍需進(jìn)一步收集資料進(jìn)行研究。

本研究存在一定的局限性：(1)研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過含PNB的培養(yǎng)基初篩的190例疑似NTM病患者中，通過熒光PCR熔解曲線法有9.0%僅檢出結(jié)核分枝桿菌，表明PNB試驗(yàn)對于區(qū)分結(jié)核分枝桿菌與NTM存在一定的局限性。既往研究表明，存在部分結(jié)核分枝桿菌對PNB耐藥，從而可在含PNB培養(yǎng)基上生長, 同時PNB還會對部分NTM有抑制作用，導(dǎo)致其無法在培養(yǎng)基上生長[16]；因此，本研究初篩使用PNB試驗(yàn)，存在部分NTM無法在PNB培養(yǎng)基上生長的可能，從而未納入本研究中。(2)熒光PCR熔解曲線法僅能識別19種NTM，研究中存在部分菌種超出試劑盒識別范圍，但是未采用其他方法進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定，直接將上述菌種納入其他分枝桿菌中，對結(jié)果分析會造成一定的影響。(3)本研究收集的NTM病患者例數(shù)也較少，且未收集統(tǒng)計(jì)分離的結(jié)核分枝桿菌及其患者情況，無法通過對比分析NTM病與結(jié)核感染患者間的特征提供更多的科學(xué)依據(jù)。

綜上所述，福建省NTM病患者主要以漢族、本地戶籍、男性、中老年人、農(nóng)民工居多；菌種分布以胞內(nèi)分枝桿菌為主，其次為膿腫分枝桿菌；不同性別、年齡、民族間NTM菌種分布差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在NTM病防治過程中需根據(jù)既往感染患者的社會人口學(xué)及菌種分布特征，并結(jié)合當(dāng)?shù)貙?shí)際情況制定更有針對性的防治策略與措施。

志謝福建省疾病預(yù)防控制中心陳代權(quán)對本研究中的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法和結(jié)果進(jìn)行了審核。