魏艷利 許蓮蓉

骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndrome，MDS)系由造血干細(xì)胞惡性克隆引起的血液系統(tǒng)疾病，可引起造血功能衰竭，嚴(yán)重者可能轉(zhuǎn)化為急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)，預(yù)后差[1]。目前尚未明確MDS發(fā)病機(jī)制，多認(rèn)為造血干細(xì)胞基因突變、細(xì)胞免疫缺陷參與在MDS發(fā)病過(guò)程，主要表現(xiàn)在造血干細(xì)胞惡性克隆、逃離免疫監(jiān)視方面[2]。T細(xì)胞免疫球蛋白黏液素3(T cell immunoglobulin mucin 3，TIM-3)系細(xì)胞表面糖蛋白成分，表達(dá)于樹(shù)突細(xì)胞、T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell，NK)等免疫細(xì)胞表面，同時(shí)為免疫負(fù)性調(diào)節(jié)因子，參與腫瘤免疫調(diào)控，抑制部分免疫細(xì)胞分子表達(dá)[3]。報(bào)道發(fā)現(xiàn)，TIM-3高度表達(dá)于大部分亞型AML患者造血干細(xì)胞，但在正常造血干細(xì)胞基本無(wú)表達(dá)，認(rèn)為其與惡性血液病發(fā)生有關(guān)[4]。但對(duì)MDS患者TIM-3表達(dá)及意義尚少見(jiàn)報(bào)道。為探討TIM-3在MDS中的表達(dá)及其意義，現(xiàn)對(duì)75例MDS及20例非MDS進(jìn)行了研究，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2016年8月至2018年8月山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院血液科收治的MDS患者共75例。均符合血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)中MDS診斷及分型標(biāo)準(zhǔn)[5]；經(jīng)骨髓形態(tài)學(xué)、活檢確診；完成骨髓細(xì)胞免疫表型測(cè)定；患者及家屬均自愿簽署研究同意書(shū)，均可配合完成隨訪調(diào)查。其中男性41例，女性34例；年齡20～75歲，平均(56.8±7.1)歲；其中MDS伴單系發(fā)育異常(myelodysplastic syndrome-single-lineage dysplasia，MDS-SLD)21例，MDS伴多系發(fā)育異常(myelodysplastic syndrome-multiple-lineage dysplasi，MDS-MLD)15例，MDS伴原始細(xì)胞增多-1(MDS-excess blasts-1，MDS-EB-1)12例，MDS-EB-2 26例，MDS伴環(huán)狀鐵粒幼紅細(xì)胞(myelodysplastic syndrome-ring sideroblasts，MDS-RS)1例；核型：較好核型35例，中等核型23例，差核型12例，極差核型5例；國(guó)際預(yù)后積分系統(tǒng)修訂評(píng)分(revised international prognostic scoring system，IPSS-R)[6]：低危(<3分)21例，中危(3～4.5分)20例，高危(4.5～6分)15例，極高危(>6分)19例。選擇同期收治的20例非MDS但需穿刺抽取骨髓液篩查者作為對(duì)照組，其中男性12例，女性8例；年齡21～73歲，平均(55.9±6.9)歲；均自愿采集骨髓標(biāo)本。研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)。

1.2 方法

消毒鋪巾，2%利多卡因局麻，髂后上棘穿刺提取骨髓液5 ml，肝素抗凝并過(guò)濾，渦旋振蕩器混合均勻，室溫避光孵育15 min，加入1 ml溶血素，渦旋振蕩器混勻，室溫避光孵育10 min，低速離心(1 500 r/min)10 min，棄上清液，加入磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)1 ml，振蕩均勻，低素離心10 min，棄上清，加300 μl重懸，應(yīng)用美國(guó)BD PharMingen公司Aria Ⅱ流式細(xì)胞儀分選TIM-3+干細(xì)胞(TIM-3+CD34+CD38-Lin細(xì)胞群)，檢測(cè)管內(nèi)預(yù)先加入多甲藻黃素葉綠素蛋白(peridinin-chlorophyll-protein complex，PerCP)標(biāo)記鼠抗人CD34單克隆抗體/別藻藍(lán)蛋白(allophycocyanin，APC)標(biāo)記鼠抗人CD38單克隆抗體/藻紅蛋白(P-phycoerythrin，PE)標(biāo)記TIM-3單克隆抗體/Lin異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記鼠抗人Lin單克隆抗體及同型對(duì)照單克隆抗體各20 μl，試劑盒均購(gòu)自美國(guó)BD公司，4 ℃避光孵育0.5 h，加紅細(xì)胞裂解液2 ml，混合均勻，繼續(xù)室溫閉光孵育10 min，PBS洗滌2次，濾網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞懸液，收集過(guò)濾液，上機(jī)測(cè)定，每管收集500 000細(xì)胞，測(cè)定CD34+CD38-Lin-TIM-3+細(xì)胞比例。參照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行骨髓染色體核型分析，核型異常均參照人類細(xì)胞遺傳學(xué)的國(guó)際命名體制[8]。所有MDS均從確診MDS隨訪至2019年4月1日或患者死亡，通過(guò)電話、門(mén)診隨訪形式，明確其生存狀況及是否轉(zhuǎn)化為AML，統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)白率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用SPSS 21.0軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料行χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料組間比較t檢驗(yàn)，多組比較采用方差分析，組內(nèi)LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MDS、非MDS骨髓TIM-3表達(dá)情況比較

MDS患者骨髓液CD34+CD38-Lin-TIM-3+細(xì)胞比例高于非MDS(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 MDS、非MDS骨髓TIM-3表達(dá)情況比較

注：①為與非MDS比較，P<0.05。

2.2 不同染色體核型MDS患者骨髓TIM-3表達(dá)情況比較

不同染色體核型MDS患者骨髓TIM-3比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=16.257，P<0.05)，隨核型變差TIM-3表達(dá)水平上升，見(jiàn)表2。

表2 不同染色體核型MDS患者骨髓TIM-3表達(dá)情況比較

注：①為與較好核型比較，P<0.05；②為與中等核型比較，P<0.05；③為與差核型比較，P<0.05。

2.3 不同IPSS-R評(píng)分MDS患者骨髓TIM-3表達(dá)情況比較

不同IPSS-R評(píng)分MDS患者骨髓TIM-3表達(dá)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=14.364，P<0.05)，隨著IPSS-R評(píng)分上升，骨髓TIM-3表達(dá)增加，見(jiàn)表3。

表3 不同IPSS-R評(píng)分MDS患者骨髓TIM-3表達(dá)情況比較

注：①為與低危比較，P<0.05；②為與中危比較，P<0.05；③為與高危比較，P<0.05。

2.4 不同亞型MDS患者骨髓TIM-3表達(dá)情況比較

不同亞型MDS患者骨髓TIM-3表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.154，P<0.05)，隨MDS亞型進(jìn)展，TIM-3表達(dá)增加，見(jiàn)表4。

表4 不同亞型MDS患者骨髓TIM-3表達(dá)情況比較

注：①為與MDS-SLD/MDS-RS比較，P<0.05；②為與MDS-MLD比較，P<0.05；③為與MDS-EB-1比較，P<0.05。

2.5 MDS患者骨髓TIM-3表達(dá)與轉(zhuǎn)白率及生存率的關(guān)系

本組75例MDS患者均隨訪至死亡或隨訪截止日，其中轉(zhuǎn)化為AML 24例，轉(zhuǎn)白率為32.00%；隨訪結(jié)束生存68例，死亡7例，MDS轉(zhuǎn)白患者骨髓TIM-3表達(dá)水平高于未轉(zhuǎn)白組，隨訪死亡組骨髓TIM-3表達(dá)水平高于生存組(P<0.05)，見(jiàn)表5。

表5 MDS患者骨髓TIM-3表達(dá)與轉(zhuǎn)白率及生存率的關(guān)系

注：①為與轉(zhuǎn)白組比較，P<0.05；②為與生存組比較，P<0.05。

3 討論

MDS系造血干細(xì)胞異質(zhì)、克隆分化后產(chǎn)生惡性克隆細(xì)胞呈現(xiàn)無(wú)效或病態(tài)造血，導(dǎo)致造血功能衰竭的血液病，最終可轉(zhuǎn)化為AML，威脅患者生命安全[9]。目前對(duì)MDS發(fā)病機(jī)制的研究主要集中于體內(nèi)免疫監(jiān)視系統(tǒng)失衡、造血干細(xì)胞遺傳變異方面，以細(xì)胞免疫缺陷為主[10]。文獻(xiàn)報(bào)道CD123、CD25、CD96及TIM-3均優(yōu)先表達(dá)于腫瘤干細(xì)胞，可能為惡性克隆重要標(biāo)志物[11]。也有分子學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，TMI僅在腫瘤干細(xì)胞呈高表達(dá)，有較高的特異性[12]。

TIM-3屬TIM家族關(guān)鍵成員，可與磷脂酰絲氨酸結(jié)合，促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞及巨噬細(xì)胞清除凋亡體，誘導(dǎo)細(xì)胞免疫耐受，是免疫調(diào)控負(fù)分子，在腫瘤免疫逃逸中有重要作用。TIM-3配體為半乳凝集素9，在免疫球蛋白可變區(qū)其可與TIM-3分子寡聚糖結(jié)合，產(chǎn)生免疫負(fù)調(diào)控作用，導(dǎo)致Th1細(xì)胞凋亡及干擾素-γ釋放減少，誘導(dǎo)骨髓來(lái)源的抑制性細(xì)胞增殖，引起免疫抑制。徐良靜等[13]發(fā)現(xiàn)，TIM-3+白血病細(xì)胞可重建于免疫缺陷小鼠體內(nèi)，但無(wú)法在正常小鼠體內(nèi)重建，認(rèn)為T(mén)IM-3+白血病細(xì)胞含白血病干細(xì)胞功能。MDS為白血病前狀態(tài)，但目前對(duì)其造血干細(xì)胞TIMI3表達(dá)及功能尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，MDS患者骨髓液TIMI3在造血干細(xì)胞表達(dá)情況明顯高于非MDS，且MDS患者骨髓液TIMI3在造血干細(xì)胞上表達(dá)情況與患者染色體核型、預(yù)后評(píng)分、亞型均呈現(xiàn)一定的正性相關(guān)關(guān)系，染色體核型異質(zhì)性、惡性程度高，預(yù)后評(píng)分高危及亞型進(jìn)展MDS患者骨髓液TIMI3在造血干細(xì)胞上表達(dá)率較高；且隨訪生存及未轉(zhuǎn)白MDS患者TIMI3在造血干細(xì)胞上表達(dá)率較隨訪死亡、轉(zhuǎn)白者低，提示TIM-3可能為MDS造血干細(xì)胞惡性克隆的標(biāo)志物，參與MDS惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程，且與疾病預(yù)后呈密切相關(guān)。但對(duì)TIM-3在AML造血干細(xì)胞高表達(dá)率機(jī)制尚未明確，考慮增多TIM-3可能為白血病干細(xì)胞分子突變所產(chǎn)生的結(jié)果，調(diào)節(jié)髓系分化轉(zhuǎn)錄因子突變可能直接對(duì)TIM-3轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生影響，促進(jìn)TIM-3+細(xì)胞呈長(zhǎng)生存。

綜上，TIM-3可能為AML前狀態(tài)標(biāo)志物，在MDS骨髓造血干細(xì)胞呈高表達(dá)，但在非MDS造血干細(xì)胞表達(dá)率極低，且MDS患者骨髓干細(xì)胞TIM-3隨病情進(jìn)展增加，且與患者不良預(yù)后存在密切關(guān)聯(lián)，推測(cè)TIM-3+干細(xì)胞可能為MDS病程中惡性克隆性細(xì)胞，參與病情進(jìn)展過(guò)程。