王雪蕊 徐霄龍 黃 坡 哈雁翔 張 瑞 郭玉紅 劉清泉 △

（1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京 100010；2.中醫(yī)感染性疾病基礎(chǔ)研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100010；3.北京市中醫(yī)研究所，北京 100010）

膿毒癥是指宿主應(yīng)對(duì)微生物感染的應(yīng)答反應(yīng)失調(diào)進(jìn)而導(dǎo)致的危及生命的多器官功能障礙[1]。膿毒癥是重癥監(jiān)護(hù)病房（ICU）內(nèi)死亡的主要原因，約占ICU死亡率的10%～50%[2]。膿毒癥心功能不全是膿毒癥的嚴(yán)重并發(fā)癥，其發(fā)生率為40%～50%，病死率高達(dá)70%～90%，與未合并心功能障礙的膿毒癥患者相比，此類患者病死率增加20%[3]。膿毒癥心功能不全屬于可逆性的心臟損傷，因此早期對(duì)其進(jìn)行干預(yù)治療對(duì)于降低膿毒癥的病死率具有重要的意義[4]。課題組根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)，總結(jié)出益氣溫陽、活血利水的中藥復(fù)方強(qiáng)心一號(hào)，發(fā)現(xiàn)其對(duì)于膿毒癥患者心臟功能具有改善作用。前期基礎(chǔ)研究也證實(shí)，該復(fù)方顯著降低盲腸結(jié)扎打孔（CLP）膿毒癥小鼠的死亡率，并顯著改善其射血分?jǐn)?shù)和縮短分?jǐn)?shù)等心功能指標(biāo)[5]。本研究旨從心肌細(xì)胞凋亡和心臟凋亡相關(guān)蛋白調(diào)節(jié)的角度，探討強(qiáng)心一號(hào)復(fù)方對(duì)膿毒癥小鼠的心臟保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用C57BL/6J北京小鼠，雄性，10周齡，體質(zhì)量20～23 g，均為SPF級(jí)飼養(yǎng)，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2014-0004，使用許可證號(hào)：SCXK（京）2015-0023，由北京中醫(yī)醫(yī)院中醫(yī)研究所按純系動(dòng)物要求專人飼養(yǎng)。各組小鼠自由進(jìn)水進(jìn)食，保持室溫恒定，實(shí)驗(yàn)方案通過北京市中醫(yī)研究所動(dòng)物倫理委員會(huì)認(rèn)可，實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置符合有關(guān)善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的規(guī)定。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 參照《中華人民共和國藥典》，所有藥物由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院中藥房提供。強(qiáng)心一號(hào)復(fù)方組成：水紅花籽30 g，黃芪30 g，茯苓20 g，丹參20 g，五味子10 g。按原方比例，110 g藥材加水400 mL浸泡30 min，沸騰后煎煮30 min，濃縮至110 mL，以質(zhì)量濃度1 g/mL作為實(shí)驗(yàn)用藥劑量，并放于冰箱4℃冷藏備用。

1.3 儀器和試劑 光學(xué)顯微鏡（BX51型，日本Olympus），臺(tái)式離心機(jī)（Allegra X-30R 型，美國 BECKMAN），酶標(biāo)儀（ELx808型，美國Biotek），Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)（Odyssey CLX，美國Odyssey）。WGA 工作液（批號(hào)L4895，美國Sigma），TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（ab206386，美國abcam），BCA蛋白測(cè)定試劑盒（23225，美國Thermo），蛋白酶抑制劑（78429，美國Thermo），戊巴比妥鈉（批號(hào)57-33-0，上海榕柏生物技術(shù)有限公司），抗B細(xì)胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）抗體（ab182858，美國abcam），抗Bcl-2相關(guān) X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗體（ab32503，美國abcam），抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase3）抗體（ab13847，美國abcam），抗裂解的caspase3（Cleaved caspase3）抗體（ab2302，美國abcam），抗GAPDH抗體（TA309157，北京中杉金橋）。

1.4 分組與造模 采取隨機(jī)數(shù)字表法將動(dòng)物分為對(duì)照組、模型組、強(qiáng)心組，每組12只。模型組、強(qiáng)心組小鼠進(jìn)行CLP造模。模型制備方法：1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉小鼠，固定，消毒，于腹中線開口，輕柔取出盲腸，結(jié)扎1/2長度盲腸，使用5 mL注射器針頭于結(jié)扎段貫穿盲腸1次。對(duì)照組小鼠麻醉后進(jìn)行假手術(shù)操作，不進(jìn)行結(jié)扎和穿刺。術(shù)畢小鼠背部皮下注射生理鹽水2 mL防治休克。

1.5 干預(yù)方法 強(qiáng)心組于造模后2 h給予1 g/kg強(qiáng)心一號(hào)復(fù)方灌胃，灌胃體積1 mL。模型組與假手術(shù)組于造模術(shù)后2 h給予1 mL生理鹽水灌胃。各組均每日干預(yù)1次，持續(xù)48 h。

1.6 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1）膿毒癥小鼠臨床評(píng)分。CLP術(shù)后6 h及24 h，根據(jù)SHIRPA協(xié)議[6-7]，基于以下參數(shù)對(duì)膿毒癥小鼠進(jìn)行臨床評(píng)分測(cè)定。每一項(xiàng)參數(shù)如有變化得1分，最多12分。觀察參數(shù)包括腹部扭動(dòng)，立毛，糞便變化（如腹瀉），流淚，瞼閉合，運(yùn)動(dòng)活性低，體溫低（低于35℃計(jì)1分），反射性逃避觸摸，自發(fā)活動(dòng)變化，握力降低和呼吸頻率變化（換氣過度）。2）心臟組織病理切片制備及染色。各組小鼠CLP術(shù)后48 h進(jìn)行麻醉，用含有肝素的0.9%氯化鈉注射液灌注心臟，剪下心臟組織，4%多聚甲醛中固定過夜，然后進(jìn)行常規(guī)脫水包埋制作石蠟切片。3）采用WGA染色檢測(cè)心肌細(xì)胞面積。切片經(jīng)二甲苯和梯度乙醇脫蠟至水，檸檬酸抗原修復(fù)90 s，PBS緩沖液洗3遍，用血清封閉液室溫封閉30 min，WGA工作液10 μg/mL 37℃孵育60 min，PBS緩沖液洗3遍，DAPI封片。使用Nikon ECLIPSE 90i顯微鏡進(jìn)行病理圖像采集，使用NIS Br 4.0軟件對(duì)心肌細(xì)胞面積進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。4）心臟組織TUNEL細(xì)胞凋亡測(cè)定。根據(jù)試劑盒說明書，將石蠟切片脫蠟至水。由20 μg/mL蛋白酶K溶液通透，室溫孵育8～10 min，PBS泡洗。3%過氧化氫溶液室溫孵育20 min后PBS泡洗。制備rTdT孵育緩沖液并進(jìn)行室溫孵育60 min后終止反應(yīng)。配制Streptavidin-HRP工作液和DAB顯色液進(jìn)行顯色，可見TUNEL染色陽性（棕色）的凋亡細(xì)胞。采用Nikon ECLIPSE 90i顯微鏡進(jìn)行切片觀察，NIS Br 4.0軟件對(duì)陽性細(xì)胞百分比進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。5）Western blotting法檢測(cè)。各組小鼠取心臟組織勻漿后，使用蛋白提取試劑盒提取總蛋白，BCA法檢測(cè)總蛋白的濃度。配制凝膠，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)，血清封閉等步驟。加入Bcl-2抗體、Bax抗體、Caspase3抗體、Cleaved caspase3抗體、GAPDH一抗（1∶1 000）孵育，4℃過夜。第2天室溫平衡，TBST洗滌后加入對(duì)應(yīng)熒光二抗孵育。采用Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)對(duì)硝酸纖維膜上的蛋白進(jìn)行量化測(cè)定，Bcl-2和Bax以GAPDH作為參比蛋白，Cleaved caspase3以Caspase3作為參比蛋白，Image J對(duì)灰度進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)以（）表示，組間比較采用單因素方差分析，并用Turkey法（方差齊時(shí)）或Dunnett′s T3（方差不齊時(shí)）作組間多重比較。當(dāng)檢驗(yàn)變量不服從正態(tài)分布時(shí)，采用非參數(shù)統(tǒng)計(jì)中的Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠臨床評(píng)分比較 見表1。與對(duì)照組相比，模型組6 h和24 h的臨床評(píng)分值均顯著升高（P＜0.05）。與模型組相比，強(qiáng)心組的臨床評(píng)分在24 h顯著下調(diào)（P＜0.05），6 h時(shí)無顯著差異。提示強(qiáng)心一號(hào)復(fù)方對(duì)CLP術(shù)后小鼠的大體狀態(tài)具有一定改善作用。

表1 各組小鼠臨床評(píng)分比較（分，±s）

表1 各組小鼠臨床評(píng)分比較（分，±s）

與對(duì)照組比較，?P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。下同

組別對(duì)照組模型組強(qiáng)心組24 h 0.0±0.2 7.0±1.2*5.0±1.5#6 h 0.0±0.5 6.0±3.0*5.0±3.0

2.2 各組小鼠心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)比較 見圖1，表2。結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)照組心肌細(xì)胞排列規(guī)律，大小一致。與對(duì)照組相比，模型組小鼠心肌細(xì)胞面積顯著增大（P＜0.05），排列不規(guī)律。與模型組相比，強(qiáng)心組心肌細(xì)胞面積顯著下降（P＜0.05）。說明強(qiáng)心一號(hào)復(fù)方對(duì)膿毒癥小鼠心肌細(xì)胞代償性肥大具有一定改善作用。

圖1 各組小鼠心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)（WGA染色，400倍）

表2 各組小鼠心肌細(xì)胞面積比較（μm2，±s）

表2 各組小鼠心肌細(xì)胞面積比較（μm2，±s）

項(xiàng)目心肌細(xì)胞面積對(duì)照組263.74±9.47模型組429.23±10.65*強(qiáng)心組298.53±16.72#

2.2 各組小鼠心肌細(xì)胞凋亡比較 見圖2，表3。采用TUNEL染色評(píng)價(jià)CLP術(shù)后48 h對(duì)照組、模型組、強(qiáng)心組小鼠心臟組織凋亡情況，并統(tǒng)計(jì)各組TUNEL陽性細(xì)胞的百分比。結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)照組心臟組織幾乎沒有凋亡細(xì)胞。與對(duì)照組相比，模型組小鼠心肌細(xì)胞凋亡顯著增多（P＜0.05）。與模型組相比，強(qiáng)心組心肌細(xì)胞凋亡顯著減少（P＜0.05）。說明強(qiáng)心一號(hào)復(fù)方對(duì)膿毒癥術(shù)后小鼠心臟組織的凋亡具有改善作用。

圖2 各組小鼠心臟組織凋亡情況（TUNEL染色，100倍）

表3 各組小鼠心臟TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)比較（%，±s）

表3 各組小鼠心臟TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)比較（%，±s）

項(xiàng)目心臟TUNEL陽性細(xì)胞對(duì)照組0.268±0.098模型組4.387±0.676*強(qiáng)心組0.960±0.327#

2.3 各組小鼠心臟組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的比較 見表4。與對(duì)照組相比，模型組小鼠心臟組織促凋亡蛋白Cleaved Caspase3的蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05），Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)變化無顯著性差異。與模型組相比，強(qiáng)心組心臟組織中Bcl-2蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05），Bax和Cleaved Caspase3蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05）。提示強(qiáng)心一號(hào)復(fù)方對(duì)CLP術(shù)后心臟組織凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用。

表4 各組小鼠心臟組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的比較（±s）

表4 各組小鼠心臟組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的比較（±s）

組別Bcl-2/GAPDH Bax/GAPDH Cleaved Caspase3/Caspase3對(duì)照組模型組強(qiáng)心組1.044±0.024 0.883±0.080 1.990±0.206#1.024±0.036 1.082±0.078 0.426±0.042#1.030±0.035 2.072±0.112*0.624±0.127#

3 討 論

膿毒癥心功能障礙可歸屬于中醫(yī)學(xué)“心水”“喘證”“水腫”等范疇[8]。此類患者心氣陽虛，兼具水飲及血瘀等邪實(shí)互擾，多為本虛標(biāo)實(shí)、虛實(shí)夾雜證，病位涉及肺、脾、肝、腎諸臟的功能失調(diào)，治宜益氣溫陽、活血利水。強(qiáng)心一號(hào)配方是本團(tuán)隊(duì)根據(jù)本院國家級(jí)名老中醫(yī)黃麗娟教授多年中西醫(yī)結(jié)合防治心血管病的臨床觀察，在結(jié)合古代文獻(xiàn)及中醫(yī)經(jīng)典理論的指導(dǎo)下形成的有效方劑。方中黃芪補(bǔ)氣升陽、益衛(wèi)固表、利水消腫，補(bǔ)而不滯，為君藥；茯苓、丹參、水紅花籽可健脾、利水、滲濕、活血，為臣藥；五味子養(yǎng)陰收斂，可收斂心氣，防止益氣溫陽藥辛溫傷陰散氣，為佐使藥。前期基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)證實(shí)該方能顯著降低膿毒癥小鼠死亡率，對(duì)心臟射血分?jǐn)?shù)和縮短分?jǐn)?shù)等心功能指標(biāo)也有顯著的改善作用[5]。本研究根據(jù)SHIRPA協(xié)議對(duì)CLP術(shù)后小鼠進(jìn)行臨床評(píng)分測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與模型組相比，強(qiáng)心一號(hào)對(duì)CLP術(shù)后24 h小鼠的臨床評(píng)分具有顯著的改善作用，進(jìn)一步證明了該復(fù)方對(duì)于膿毒癥小鼠的療效。

膿毒癥患者出現(xiàn)的心功能障礙屬于可逆性的，患者早期出現(xiàn)血流動(dòng)力學(xué)變化，心室收縮、舒張能力輕微改變，隨著病情的發(fā)展，到后期出現(xiàn)心輸出力和容量反應(yīng)性下降、心肌收縮能力下降、射血功能減退等，并可見以左心室為主的心室擴(kuò)張重構(gòu)[3，9-10]。由于心肌收縮力的改變，心肌細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)代償性的心肌肥大，從而維持心功能。本研究發(fā)現(xiàn)CLP術(shù)后心肌細(xì)胞出現(xiàn)代償性肥大，與模型組相比強(qiáng)心一號(hào)復(fù)方可顯著降低心肌細(xì)胞面積，說明該復(fù)方對(duì)于CLP術(shù)后心臟重構(gòu)具有一定改善作用。

細(xì)胞凋亡是膿毒癥發(fā)生器官功能損傷的主要病理機(jī)制之一[11-12]，膿毒癥發(fā)生時(shí)心肌細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)信號(hào)通路激活，包括由Caspase-9激活介導(dǎo)的內(nèi)源性細(xì)胞凋亡途徑、Caspase-8激活介導(dǎo)的外源性細(xì)胞凋亡途徑以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等激活的凋亡相關(guān)途徑[13-14]。Caspase-3是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者，是外源性凋亡途徑、線粒體凋亡途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑的交匯點(diǎn)[15]。其活化形式是Cleaved Caspase-3，可通過識(shí)別和切割抗凋亡蛋白氨基酸序列、水解DNA核酸內(nèi)切酶抑制因子，增強(qiáng)DNA內(nèi)切酶的活性從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[16]。Bcl-2家族主要包括抗凋亡基因（如Bcl-2、Bcl-xl等）和促凋亡基因（如Bax、Bid等），主要激活線粒體凋亡途徑[17]。其中Bcl-2和Bax和作為Bcl-2基因家族的代表成員，通過影響線粒體跨膜電位的穩(wěn)定性和線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開放，介導(dǎo)凋亡的發(fā)生[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比模型組心臟組織TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量顯著增加，Cleaved Caspase3表達(dá)顯著上調(diào)，說明膿毒癥可促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生。強(qiáng)心一號(hào)復(fù)方可顯著下調(diào)心臟組織TUNEL陽性細(xì)胞的數(shù)量，上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)Bax和Cleaved Caspase3的表達(dá)，說明強(qiáng)心一號(hào)復(fù)方對(duì)膿毒癥的心臟保護(hù)作用可能與調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞凋亡和心臟凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)強(qiáng)心一號(hào)復(fù)方可顯著改善CLP小鼠術(shù)后的臨床評(píng)分，改善心肌代償性肥大和凋亡情況，其機(jī)制可能與上調(diào)Bcl-2、下調(diào)Bax和Cleaved Caspase3蛋白表達(dá)有關(guān)。