范菊娣 錢志瑤 龍義國(guó) 覃容貴

1 貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院(貴陽(yáng) 550025)2 貴州醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院(貴陽(yáng) 550025)3 貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科(貴陽(yáng) 55004)

民族藥九頭獅子草為爵床科植物九頭獅子草[Peristrophejaponica(Thunb.) Bremek.]全草，主產(chǎn)于貴州，已收載于2003年版《貴州省中藥、民族藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》，且民間廣為栽培、應(yīng)用，其味辛、性涼，主治祛風(fēng)、清熱、化痰、解毒等，用于治療風(fēng)熱咳嗽、小兒驚風(fēng)、喉痛、疔毒、乳癰，而當(dāng)與其它藥物配伍使用，則可治療肺熱咳嗽、虛熱咳嗽、小兒吐奶并泄青、男子尿結(jié)、咽喉腫痛、痔瘡、蛇咬傷、黑皰疔、婦女白帶、經(jīng)漏等[1- 3]。九頭獅子草長(zhǎng)期以來(lái)在貴州省苗族、布依族民間用來(lái)治療小兒高熱、小兒驚風(fēng)等，尤以治療臨床原因不明、抗生素類藥物無(wú)顯效的高熱效果較好，本課題組發(fā)現(xiàn)石油醚部位及水部位為九頭獅子草解熱有效部位[4]。同時(shí)，九頭獅子草藥用方法在福建、浙江、川藏等地民間的草藥書上也均有收載。

貴州省黔東南苗族侗族自治地區(qū)，九頭獅子草常被世居苗族婦女用于治療婦科泌尿系統(tǒng)的感染，是苗家人房前屋后皆有種植的家庭常備草藥，故有“婦人生病，開門采之”之說(shuō)。貴州省以九頭獅子草為主藥生產(chǎn)的用于治療婦科陰道感染不適癥狀以及日常保潔的苗草護(hù)陰液也已上市，但其藥用有效部位尚未明確。九頭獅子草用于治療婦科炎癥，療效良好，為推廣其臨床應(yīng)用，前期研究已明確了九頭獅子草抗菌、止癢和抗炎的作用[5]，在此基礎(chǔ)上，本文對(duì)其治療細(xì)菌性陰道炎的有效部位進(jìn)行篩選研究。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

昆明種小鼠，清潔級(jí)，雌性，體質(zhì)量20～25 g，由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SYXK(黔)2002- 0001。本實(shí)驗(yàn)涉及動(dòng)物試驗(yàn)程序和內(nèi)容已通過(guò)本校醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)。

1.2 藥品與試劑

九頭獅子草干燥藥材，購(gòu)自貴陽(yáng)市萬(wàn)東藥材市場(chǎng)，經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院中藥學(xué)教研室覃容貴教授鑒定為正品，藥材標(biāo)本保留于貴州醫(yī)科大學(xué)中藥、民族藥標(biāo)本館。苯甲酸雌二醇注射液(上海通用藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)120703)；婦科千金片(株洲千金藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)20120413)。金黃色葡萄球菌(ATCC25923)、大腸桿菌(ATCC25922)，由貴州醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室提供。營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，上?？等鹕锟萍加邢薰?，批號(hào)120221；營(yíng)養(yǎng)瓊脂，上海盛思生化科技有限公司，批號(hào)121118；沙氏瓊脂培養(yǎng)基，上?？婆d商貿(mào)有限公司，批號(hào)：120921；液體沙氏培養(yǎng)基，北京朋利馳科技有限公司，批號(hào)：121124。

1.3 儀器與設(shè)備

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，W3-100SP；數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱，303A-型；電熱恒溫箱，WSZ-134- 75；不銹鋼手提式壓力蒸汽滅菌器，YXQ-SG46- 280SA；超凈工作臺(tái)，SW-CJ-1F；光學(xué)顯微鏡，CX31- 32C02。

1.4 水提液與不同極性部位的制備

九頭獅子草臨床用藥采用水煮湯藥，因此制備水提液作為比較，分析各不同極性部位治療小鼠陰道炎的作用。取干燥九頭獅子草適量，剪碎，以20倍量蒸餾水回流提取2次，各2 h，靜置過(guò)濾，合并濾液，水浴濃縮至稠膏。取干燥九頭獅子草適量剪碎，以20倍量70%乙醇回流提取2次，各2 h，靜置過(guò)濾，合并濾液，減壓回收乙醇至無(wú)醇味[6]。依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，萃取液減壓濃縮得稠浸膏，回收有機(jī)溶劑，記為石油醚部位浸膏、乙酸乙酯部位浸膏和正丁醇部位浸膏，剩余溶液濃縮得乙醇浸膏。

1.5 劑量設(shè)定與樣品制備

水提液以人的臨床用量換算成的小鼠用量為基礎(chǔ)，人的臨床劑量為100 g/d，根據(jù)人與小鼠的每公斤體質(zhì)量折算系數(shù)計(jì)算得到小鼠劑量。不同極性部位的劑量以人的臨床用量換算成的小鼠用量為基礎(chǔ)，結(jié)合各個(gè)部位得膏率，根據(jù)人與小鼠的每公斤體質(zhì)量折算系數(shù)計(jì)算得到理論的小鼠用量，再參考預(yù)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行調(diào)整。為了保證達(dá)到篩選藥效的目的，設(shè)定劑量在臨床用量的基礎(chǔ)上有所提高。樣品制備則分別取適量各不同極性部位浸膏，置于研缽中，少量乙醇潤(rùn)濕，加0.5%羧甲基纖維素鈉，研磨均勻得混懸液，并配制成所需劑量，即得為石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和70%乙醇提取部位試驗(yàn)樣品；水提液以蒸餾水配制成所需劑量樣品。以婦科千金片作陽(yáng)性治療藥，同法用0.5%羧甲基纖維素鈉配成均勻混懸液[7]。

1.6 體外抑菌實(shí)驗(yàn)

分別將金黃色葡萄球菌菌懸液、大腸埃希菌菌懸液于培養(yǎng)基平板上均勻涂抹，蓋好平皿置室溫干燥5 min備用。分別將直徑為5.0 mm的無(wú)菌紙片浸入已制備好的九頭獅子草石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和70%乙醇提取部位試驗(yàn)樣品以及水提液樣品中作為藥敏紙片，同時(shí)設(shè)定空白對(duì)照。將含有不同提取液的藥敏紙片以及空白對(duì)照紙片均勻貼在已接種好的平板上，蓋好平皿，置37 ℃培養(yǎng)18～24 h觀察結(jié)果，測(cè)量抑菌圈。

1.7 九頭獅子草各部位對(duì)細(xì)菌性陰道炎模型小鼠的影響[8]

1.7.1 細(xì)菌性陰道炎模型制作 取健康雌性小鼠165只，于頸背部皮下注射0.05 mL苯甲酸雌二醇注射液，濃度為2 mg/mL，隔天1次，連續(xù)3次，于第6天將濃度為1×108cfu/mL的金黃色葡萄球菌懸液20 μL注入手術(shù)吸收性止血海綿中，再將其塞于小鼠陰道內(nèi)，作為造模組；另取25只小鼠，同法給予苯甲酸雌二醇注射液，于第6天將已注入20 μL生理鹽水的手術(shù)吸收性止血海綿塞于小鼠陰道內(nèi)，作為空白對(duì)照備選組[9]。大腸埃希菌陰道炎小鼠模型同法制作。于接種后的第4天取陰道分泌物涂片鏡檢，根據(jù)菌體特征觀察以確定是否感染成功，金黃色葡萄球菌排列成葡萄串狀，菌體光滑、隆起，無(wú)芽胞、莢膜；大腸埃希菌則為無(wú)芽孢的直桿菌。

1.7.2 陰道分泌物鏡檢[10]分別從造模組中隨機(jī)挑選出140只感染成功的小鼠，每組20只，分成7組，標(biāo)記為模型陽(yáng)性對(duì)照組、石油醚部位組、乙酸乙酯部位組、正丁醇部位組、70%乙醇部位組、水提組和婦科千金片治療對(duì)照組，從空白對(duì)照備選組中隨機(jī)挑選陰道分泌物鏡檢為陰性的小鼠20只作為空白對(duì)照組。各組小鼠分別按劑量等容積不等濃度灌胃給藥2 mL/100 g，模型陽(yáng)性對(duì)照組及空白對(duì)照組灌胃給予同體積蒸餾水，連續(xù)10 d，每天1次，于停藥后第1、4天無(wú)菌棉簽取陰道分泌物涂片，革蘭氏染色鏡檢，2次鏡檢結(jié)果均為金黃色葡萄球菌，大腸埃希菌陰性者為轉(zhuǎn)陰，計(jì)算轉(zhuǎn)陰率。

1.7.3 陰道組織病理學(xué)分析[11]頸椎脫臼處死小鼠，取小鼠陰道組織，10%中性甲醛溶液進(jìn)行固定，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅染色后進(jìn)行病理組織學(xué)檢查，對(duì)小鼠陰道黏膜的病理組織改變進(jìn)行劃分等級(jí)，等級(jí)劃分分為0-III級(jí)：0級(jí)為黏膜上皮光滑，組織無(wú)壞死脫落，黏膜下無(wú)出血、充血、水腫、炎細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象，且陰道內(nèi)無(wú)炎性滲出物；I級(jí)為黏膜上皮無(wú)壞死脫落；黏膜下有水腫、充血現(xiàn)象，陰道內(nèi)無(wú)炎性滲出物；II級(jí)為黏膜上皮組織有灶性壞死脫落，黏膜下出現(xiàn)點(diǎn)狀出血、水腫、充血，有少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，陰道內(nèi)有少量炎性滲出物；III級(jí)為黏膜上皮出現(xiàn)壞死脫落，黏膜下表現(xiàn)為片狀出血、水腫、充血、炎細(xì)胞浸潤(rùn)，且陰道內(nèi)有大量炎性滲出物。

1.7.4 小鼠陰道黏膜組織病理學(xué)檢查 頸椎脫臼處死小鼠，取陰道組織，用10%的福爾馬林溶液固定，進(jìn)行石蠟包埋、切片，進(jìn)行HE染色，顯微鏡下觀察并拍照。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理[12]，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體外抑菌的測(cè)定

分別對(duì)九頭獅子草各提取部位樣品的平板培養(yǎng)抑菌實(shí)驗(yàn)進(jìn)行抑菌圈的測(cè)量，結(jié)果顯示，在九頭獅子草提取液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果顯示，以水提液和石油醚部位的抑菌圈較大，平均值分別為13.50 mm、13.00 mm，抑菌圈的大小依次為：水提液(13.50 mm)>石油醚部位(13.00 mm)>70%乙醇部位組(10.00 mm)>正丁醇部位組(9.00 mm)≥乙酸乙酯部位組(7.50 mm)。在九頭獅子草提取液對(duì)大腸埃希菌的抑制實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果顯示，同樣以水提液和石油醚部位的抑菌圈較大，平均值分別為15.50 mm、14.25 mm，抑菌圈的大小依次為：水提液(15.50 mm)>石油醚部位(14.25 mm)>70%乙醇部位組(12.00 mm)>正丁醇部位組(9.75 mm)≥乙酸乙酯部位組(9.25 mm)。

2.2 九頭獅子草各部位對(duì)細(xì)菌性陰道炎模型小鼠的影響

小鼠陰道內(nèi)金黃色葡萄球菌與大腸埃希菌的數(shù)量明顯增加，是導(dǎo)致細(xì)菌性陰道炎發(fā)病的原因之一[13]。通過(guò)對(duì)小鼠進(jìn)行細(xì)菌性陰道炎模型的制作，菌種包括金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌，接種培養(yǎng)后，觀察小鼠陰道內(nèi)分泌物，觀察發(fā)現(xiàn)，小鼠陰道內(nèi)分泌物增加，金黃色葡萄球菌與大腸埃希菌的菌落生長(zhǎng)密集。將九頭獅子草各部位提取液作用于各造模成功的小鼠陰道內(nèi)，第1、4天用無(wú)菌棉簽取小鼠陰道分泌物涂片，革蘭氏染色鏡檢，觀察用藥后小鼠陰道炎的治愈情況并計(jì)算轉(zhuǎn)陰率。通過(guò)鏡檢各實(shí)驗(yàn)組金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的生長(zhǎng)情況，計(jì)算轉(zhuǎn)陰率，結(jié)果見表1，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。統(tǒng)計(jì)分析可知，細(xì)菌性陰道炎小鼠各給藥組的細(xì)菌轉(zhuǎn)陰率與模型陽(yáng)性對(duì)照組相比，差異較大，即九頭獅子草水提液、70%乙醇以及石油醚、乙酸乙酯、正丁醇部位提取液對(duì)小鼠細(xì)菌性陰道炎有一定的治療作用，其中水提組、70%乙醇部位組以及石油醚部位組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，水提組治療作用最好，其次依次為石油醚組部位、70%乙醇組部位。同時(shí)，九頭獅子草各部位提取物對(duì)大腸埃希菌所引起的陰道炎的治愈效果略高于對(duì)金黃色葡萄球菌所引起的陰道炎。

與模型陽(yáng)性對(duì)照組比較，各給藥組的陰道組織病理情況均有所改善。水提組20例黏膜上皮光滑，無(wú)壞死脫落，黏膜下無(wú)充血、水腫、出血、炎細(xì)胞浸潤(rùn)，陰道內(nèi)無(wú)炎性滲出物；8例黏膜下充血，8例黏膜下水腫；4例有少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。石油醚部位組16例黏膜上皮光滑，無(wú)壞死脫落，黏膜下無(wú)充血、水腫、出血、炎細(xì)胞浸潤(rùn)，陰道內(nèi)無(wú)炎性滲出物；8例黏膜下充血，12例黏膜下水腫；4例有少量點(diǎn)狀出血。70%乙醇部位組12例黏膜上皮光滑，無(wú)壞死脫落，黏膜下無(wú)充血、水腫、出血、炎細(xì)胞浸潤(rùn)，陰道內(nèi)無(wú)炎性滲出物；8例黏膜下充血，8例黏膜下水腫；8例有少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，4例有點(diǎn)狀出血。乙酸乙酯部位組和正丁醇部位組病變情況有所改善，但效果不如以上各組顯著(見表2)。

表1 九頭獅子草各部位提取物對(duì)細(xì)菌性陰道炎模型小鼠的影響

表2 九頭獅子草各部位提取物對(duì)細(xì)菌性陰道炎模型小鼠陰道病理組織影響

2.3 對(duì)小鼠陰道黏膜炎癥的病理學(xué)形態(tài)影響

鏡下正常小鼠陰道壁組織結(jié)構(gòu)清楚，黏膜被覆鱗狀上皮完整，未見糜爛及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜下層血管輕度擴(kuò)張充血，伴個(gè)別炎細(xì)胞浸潤(rùn)；模型對(duì)照組陰道壁組織結(jié)構(gòu)清楚，黏膜被覆鱗狀上皮重度糜爛，伴較多中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜下層血管中度擴(kuò)張充血，伴較多炎細(xì)胞浸潤(rùn)。其他有效部位組陰道病變有所減輕，與婦科千金片治療組比較，石油醚組和70%乙醇部位組效果相當(dāng)。見圖1。

3 討 論

陰道炎是陰道黏膜及黏膜下結(jié)締組織的炎癥，常見的有細(xì)菌性陰道病、滴蟲性陰道炎、霉菌性陰道炎、老年性陰道炎等?，F(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)證明，很多中藥單味試劑都具有較強(qiáng)的殺滅和抑制滴蟲、真菌，以及消炎和調(diào)整陰道內(nèi)環(huán)境的作用[14]，同時(shí)還能避免大量抗生素的使用所引起的正常菌群失調(diào)。

在貴州省民間，九頭獅子草用于治療婦科炎癥，療效良好，本研究結(jié)果也表明，九頭獅子草水提液、石油醚部位及70%乙醇部位提取液對(duì)細(xì)菌性陰道炎均有較好的治療作用，但石油醚部位及70%乙醇部位提取液作用弱于水提液，正丁醇部位及乙酸乙酯部位作用不明顯，因此判斷九頭獅子草治療陰道炎的有效部位主要為石油醚部位及70%乙醇提取部位，石油醚部位作用強(qiáng)于70%乙醇提取部位。

前期研究結(jié)果表明，九頭獅子草對(duì)金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌有不同程度的抑制作用[15]，可降低右旋糖酐所致小鼠的瘙癢次數(shù)及瘙癢持續(xù)總時(shí)間，并提高磷酸組胺所致豚鼠的致癢閾，具有顯著的止癢作用[16]；也能降低二甲苯所致的小鼠耳廓腫脹度，提高腫脹抑制率，降低新鮮雞蛋清所致的小鼠足跖腫脹度，提高腫脹抑制率，還能顯著降低炎性足PGE2含量，提高PGE2抑制率，具有顯著的抗炎作用[17]，說(shuō)明九頭獅子草既有抑菌、抗炎、止癢的作用，同時(shí)能提高陰道炎動(dòng)物動(dòng)物模型病原菌轉(zhuǎn)陰率和陰道黏膜炎癥的治愈程度，這對(duì)各種原因引起的陰道炎來(lái)說(shuō)可以達(dá)到標(biāo)本兼治療的效果，值得在臨床進(jìn)行推廣應(yīng)用。

圖1 九頭獅子草各組分對(duì)小鼠陰道炎其組織病理學(xué)的影響 (HE，×200)A.模型對(duì)照組；B.空白對(duì)照組；C.婦科千金片治療對(duì)照組；D.正丁醇組；E.乙酸乙酯組；F.石油醚組；G.水提組；H.70%醇提組