梁潔　孟根斯立木　顏羽昕　金蓉　包小妹　馬麗杰　那日蘇　蘇曉麗　謝敏琦　馬月宏

中圖分類號 R285 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2020）11-1294-09

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.11.03

摘 要 目的：探討七味清肝散的抗肝纖維化（HF）作用，并挖掘其潛在機(jī)制。方法：將雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為空白組、HF模型組和七味清肝散低、中、高劑量組[135、270、405 mg/（kg·d），以生藥總量計]，每組12只。除空白組外，其余各組均灌胃50%四氯化碳花生油溶液（2 mL/kg，每周2次，連續(xù)8周）以復(fù)制HF模型;與此同時，空白組和HF模型組大鼠均灌胃等容0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，各給藥組大鼠均灌胃相應(yīng)藥物，每日1次，連續(xù)8周。觀察各組大鼠的一般情況，于末次給藥后觀察其肝臟形態(tài)，并測定肝臟指數(shù);檢測大鼠血清肝功能指標(biāo)[丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、羥脯氨酸（HYP）]含量以及肝組織中α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）的表達(dá)情況，并采用蘇木精-伊紅染色和Masson染色進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。采用串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽（TMT）技術(shù)，以蛋白表達(dá)量的差異倍數(shù)為指標(biāo)，篩選藥物組（合并七味清肝散各劑量組肝組織樣品）和HF模型組的差異表達(dá)蛋白，并借助Uniprot-GOA數(shù)據(jù)庫以及KAAS、KEGG mapper在線工具等對其進(jìn)行基因本體（GO）和KEGG通路富集分析。結(jié)果：空白組大鼠健康狀況好;肝臟呈鮮紅色且表面光滑，肝小葉完整，未見變性壞死、炎癥細(xì)胞浸潤或纖維組織增生。與空白組比較，HF模型組大鼠飲食減少、精神萎靡、皮毛雜亂且無光澤;肝臟呈暗紅色或黃色，表面粗糙，質(zhì)地較硬，可見炎癥細(xì)胞浸潤、纖維組織破壞、橋間連接等現(xiàn)象;其肝臟系數(shù)、肝功能指標(biāo)含量和α-SMA的表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05）。與HF模型組比較，七味清肝散各劑量組大鼠上述癥狀均有不同程度的改善，且低劑量組肝臟系數(shù)、高劑量組ALP含量以及各劑量組ALT、AST、HYP含量和α-SMA的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05）。共篩選出與HF有關(guān)的差異表達(dá)蛋白42個，其中表達(dá)上調(diào)15個、表達(dá)下調(diào)27個，包括脂肪酸結(jié)合蛋白4（FABP4）、膽固醇7α-羥化酶（CYP7A1）等。富集分析結(jié)果顯示，差異表達(dá)蛋白主要富集于細(xì)胞外空間、血液微粒等細(xì)胞部位，涉及氧化還原酶活性、脂肪酸結(jié)合等分子功能，異型細(xì)胞間黏附的調(diào)控、蛋白質(zhì)活化級聯(lián)等生物過程以及視黃醇代謝、花生四烯酸代謝、過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）等信號通路。結(jié)論：七味清肝散可降低HF模型大鼠的肝臟系數(shù)以及血清中ALT、AST、ALP、HYP含量，下調(diào)α-SMA的表達(dá)，改善肝組織的炎癥及纖維化程度，具有一定的肝保護(hù)作用。該方潛在抗HF作用機(jī)制可能涉及FABP4、CYP7A1、PPAR等多個靶點和信號通路。

關(guān)鍵詞 肝纖維化;七味清肝散;蛋白質(zhì)組學(xué);串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽技術(shù);差異表達(dá)蛋白;大鼠

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To investigate the anti-hepatic fibrosis （HF） effects of Qiwei qinggan powder and explore its possible mechanism. METHODS： Male Wistar rats were randomly divided into blank group， HF model group， Qiwei qinggan powder low-dose， medium-dose and high-dose groups [135， 270， 405 mg/（kg·d），by total amount of crude drugs]， with 12 rats in each group. Except for blank group， other groups were given 50% CCl4-peanut oil solution intragastrically （2 mL/kg， twice a week， for consecutive 8 weeks） to induce HF model. At same time， blank group and model group were given constant volume of 0.5% CMC-Na solution intragastrically; administration groups were given relevant medicine intragastrically， once a day， for consecutive 8 weeks. General situation of rats were observed， and liver morphology was observed after last administration and hepatic indexes were detected. The contents of liver function indexes （ALT， AST， ALP， HYP） in serum and the expression of α-SMA in hepatic tissue were determined， and HE and Masson staining were performed to observe the histopathology. Using the difference multiple of expression quantity as the index， TMT technology was used to screen the differentially expressed protein in medicine group （combining the liver tissue samples of Qiwei qinggan powder groups） and HF model group. Uniprot-GOA database and KAAS， KEGG mapper online tools were used to analyze GO and KEGG pathway enrichment. RESULTS： The rats in the blank group were in good health; the liver was bright red and smooth， the liver lobules were intact， no degeneration and necrosis， inflammatory cell infiltration or fibrous tissue proliferation was found. Compared with blank group， the rats in HF model group had poor diet， depressed spirit， disordered and lusterless fur; the liver was dark red or yellow with rough surface， hard texture， inflammatory cell infiltration， fiber tissue destruction， bridge connection and so on; the hepatic index， the contents of liver function indexes and the expression of α-SMA were increased significantly （P<0.05）. Compared with HF model group， above symptoms of rats were improved to different extent in different dose groups of Qiwei qinggan powder; hepatic index in Qiwei qinggan powder low-dose group， the content of ALP in high-dose group， the contents of ALT， AST and HYP and the expression of α-SMA in different dose groups were decreased significantly （P<0.05）. A total of 42 differentially expressed proteins related to HF were screened， of which 15 were up-regulated and 27 were down-regulated in expression， including fatty acid binding protein 4 （FABP4）， cholesterol 7α-hydroxylase （CYP7A1）. The results of enrichment analysis showed that the differentially expressed proteins were mainly enriched in extracellular space， blood particles and other cell parts， involving the molecular functions of oxidoreductase activity and fatty acid binding， the biological processes of the regulation of heterotypic cell adhesion， protein activation cascade， as well as retinol metabolism， arachidonic acid metabolism， PPAR and other signal pathway. CONCLUSIONS： Qiwei qinggan powder can reduce the hepatic index， ALT， AST， ALP and HYP contents in serum， down-regulate the expression of α-SMA， improve the degree of inflammation and fibrosis of liver tissue， and have a certain protective effect on rats. The anti-HF mechanism of it involves multiple targets and signal pathways， such as FABP4， CYP7A1 and PPAR.

KEYWORDS? ?Hepatic fibrosis; Qiwei qinggan powder; Proteomics; TMT technology; Differentially expressed proteins; Rats

肝纖維化（Hepatic fibrosis，HF）是一種慢性的肝損傷疾病，主要發(fā)病原因包括病毒性肝炎、酒精肝、脂肪肝、寄生蟲感染、化學(xué)毒物侵害、自身免疫性疾病等[1-3]。被損傷的肝臟細(xì)胞可分泌多種炎癥細(xì)胞因子，后者可激活肝星狀細(xì)胞（HSC），活化的HSC可合成分泌大量的以膠原纖維為主的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）。在此過程中，ECM的暫時增生有利于肝臟的自我修復(fù);活化的HSC可轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞進(jìn)而形成多能干細(xì)胞，進(jìn)而分化成肝細(xì)胞，最終有利于肝臟的重塑[4-6]。由此可見，上述過程是肝臟損傷自我修復(fù)的一種保護(hù)機(jī)制。然而，當(dāng)損傷長期累積，ECM將會大量聚集，造成肝硬化、肝癌等嚴(yán)重后果，嚴(yán)重危害人體健康[7-8]。有數(shù)據(jù)顯示，HF的發(fā)病率在全世界范圍內(nèi)呈上升趨勢;而且有研究表明，在排除了發(fā)病原因（如飲酒）之后，HF仍可繼續(xù)進(jìn)展，最終導(dǎo)致不良后果[9]。目前，用于治療HF的藥物大多價格昂貴且毒副作用大，臨床應(yīng)用受限。

蒙藥七味清肝散由藍(lán)盆花、紅花、人工牛黃、石膏、香青蘭、瞿麥、五靈脂等藥材組成，臨床可用于治療肝熱目赤、黃疸、肝區(qū)疼痛、發(fā)燒口渴、頭痛等癥[10]。方中，藍(lán)盆花具有甘、澀、鈍、燥、膩、重、涼等性味，可清熱、清“協(xié)日”、瀉火，主要用于治療肺熱、肝熱、咽喉熱等疾病;紅花味辛、性溫，入心、肝、腎經(jīng)，具有清肝熱的作用;牛黃可用于解熱、解毒、定驚，具有清熱涼肝、息風(fēng)止痙的功效;石膏性涼，有清熱解毒的功效;香青蘭具有清胃肝熱、止血的作用;瞿麥可清熱解毒;五靈脂具有活血散瘀的功效;諸藥合用，共奏清肝熱之效[10]。本課題組前期已通過動物實驗證實了七味清肝散具有抗HF的作用[11]。為進(jìn)一步證明該方是通過多靶點的協(xié)同和/或競爭作用來治療HF，本研究擬利用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法對其作用機(jī)制及靶點進(jìn)行預(yù)測分析，旨在為后續(xù)該方抗HF相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

ELx800型酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）;725型紫外分光光度計（日本Shimadzu公司）;BX51型顯微鏡（日本Olympus公司）;Odyssey型紅外激光成像系統(tǒng)（美國LI-COR公司）;EASY-nLC 1000型超高效液相系統(tǒng)、Orbitrap Fusion Lumos型三合一質(zhì)譜系統(tǒng)（美國Thermo Fisher Scientific公司）;SM2010R型切片機(jī)（德國Leica公司）;3K15型高速冷凍離心機(jī)（美國Sigma公司）;BS2202S型電子分析天平[塞多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司];HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

藍(lán)盆花（批號：171219，產(chǎn)地：內(nèi)蒙古）、紅花（批號：171103，產(chǎn)地：新疆）、瞿麥（批號：170910，產(chǎn)地：內(nèi)蒙古）、香青蘭（批號171109，產(chǎn)地：內(nèi)蒙古）、五靈脂（批號：171215，產(chǎn)地：河北）、人工牛黃（批號：171030，產(chǎn)地：甘肅）、石膏（批號：171217，產(chǎn)地：河北）等藥材均購自內(nèi)蒙古天盛蒙中醫(yī)有限責(zé)任公司，由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院蒙藥炮制實驗中心主任呼日樂巴根副教授鑒定為真品。除人工牛黃外，其余藥材均經(jīng)粉碎后過100目篩，再加入人工牛黃，混合均勻（組方藥材量分別為紅花180 g、香青蘭60 g、藍(lán)盆花60 g、人工牛黃80 g、瞿麥60 g、石膏180 g、五靈脂60 g）。臨用前，以0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液配制成質(zhì)量濃度為30 mg/mL（以生藥總量計，下同）的混懸液。

水合氯醛（天津福晨化學(xué)試劑廠，批號：20141007）;花生油（山東魯花集團(tuán)，批號：20171209）;四氯化碳（CCl4，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20140319;臨用前，用滅菌花生油配制成溶液）;羥脯氨酸（HYP）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號分別為20180523、20180429、20180421、20180428）;蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒、Masson三色染色試劑盒、RIPA裂解液、苯甲基磺酰氟（PMSF）、5×蛋白上樣緩沖液（北京索萊寶科技有限公司，批號分別為20180927、20181001、20190420、20190426、20190509）;BCA蛋白濃度測定試劑盒、封閉液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號分別為122118190507、20190412）;兔抗大鼠α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）抗體、兔抗大鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號分別為00075696、00075847）;Dylight 800標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（美國Abbkine公司，批號：ATSMR2201）;串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽（TMT）相對定量蛋白質(zhì)組試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司，批號：TF266292）;胰酶（美國Proemga公司，批號：121652）;碘代乙酰胺、二硫蘇糖醇、尿素、三乙基碳酸氫銨（TEAB）（美國Sigma公司，批號分別為WXBC4645V、SLBM4127V、WXBC8002V、BCBX4134）;乙腈、三氟乙酸、甲酸等為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 動物

清潔級Wistar大鼠50只，雄性，8周齡，體質(zhì)量190～220 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0006。所有動物均飼養(yǎng)于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，室溫18～22 ℃。大鼠自由進(jìn)食、飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行后續(xù)實驗。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

將大鼠隨機(jī)分為5組，即空白組、HF模型組以及七味清肝散低、中、高劑量組[135、270、405 mg/（kg·d），以生藥總量計;該藥成人臨床劑量為1.5～3 g/d，各組給藥劑量根據(jù)種屬間劑量折算表并按成人最低劑量的1、2、3倍換算而得]，每組12只。造模方法和干預(yù)周期參考相關(guān)文獻(xiàn)[12]：除空白組外，其余各組大鼠均灌胃50%CCl4花生油溶液2 mL/kg以復(fù)制HF模型，每周2次，連續(xù)8周。造模同時，空白組和HF模型組大鼠均灌胃等容0.5%CMC-Na溶液，各給藥組大鼠灌胃相應(yīng)藥物，每日1次，連續(xù)8周。第8周末，隨機(jī)處死除空白組外的其余組大鼠各2只，通過病理檢查判斷造模成功[12]。

2.2 大鼠肝纖維化相關(guān)現(xiàn)象觀察及指標(biāo)檢測

2.2.1 一般情況 在研究過程中，每周稱定大鼠體質(zhì)量1次，并密切觀察其每日飲食、飲水以及毛發(fā)、精神狀態(tài)等一般情況。

2.2.2 樣品采集 于末次給藥后，大鼠（每組10只，下同）禁食、不禁水12 h，然后腹腔注射10%水合氯醛溶液進(jìn)行麻醉，經(jīng)腹主動脈取血適量，靜置20 min后，于4 ℃下以3 500 r/min離心10 min，分離血清。取血后處死大鼠，取出肝臟，分離肝組織適量，備用。

2.2.3 肝功能指標(biāo)檢測 采用賴氏法以紫外分光光度計檢測血清中ALT、AST含量，采用比色法以紫外分光光度計檢測血清中ALP含量，采用酸水解法以紫外分光光度計檢測肝組織中HYP的含量，均嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒說明書操作。

2.2.4 肝組織形態(tài)學(xué)觀察 觀察肝臟外觀及軟硬度;肝臟經(jīng)磷酸鹽緩沖液（PBS，pH為7.2～7.4）清洗后，稱定質(zhì)量，并計算其與體質(zhì)量的比值（即肝臟系數(shù)）。取肝組織適量，于4%甲醛溶液中固定48 h，經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片（厚度約4～5 μm）后，以HE和Masson三色染色試劑染色，置于顯微鏡下觀察（HF組織經(jīng)HE染色后可見肝板排列混亂、炎癥細(xì)胞浸潤、氣球樣變、橋間連接等現(xiàn)象，經(jīng)Masson染色后則可見纖維組織增生）。

2.2.5 肝組織中α-SMA的表達(dá)情況 采用Western blotting法檢測α-SMA的表達(dá)水平。取大鼠肝組織適量，使用RIPA裂解液裂解肝組織提取總蛋白后，采用BCA法檢測蛋白含量。然后加入5×蛋白上樣緩沖液適量，于95 ℃下變性8 min，取變性蛋白50 μg，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳后以濕法轉(zhuǎn)膜，用封閉液室溫封閉10 min，加入相應(yīng)一抗（稀釋度均為 1 ∶ 5 000），于4 ℃孵育過夜;洗膜后，加入相應(yīng)二抗（稀釋度為1 ∶? ? ?2 500），室溫孵育1 h;洗膜后，置于紅外激光成像系統(tǒng)上掃描。使用Image Studio ver 3.1軟件進(jìn)行分析，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白（GAPDH）條帶灰度值的比值來表示目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。

2.3 差異表達(dá)蛋白的篩選

從七味清肝散各劑量組中隨機(jī)抽取1個肝組織樣品，混合，作為藥物組進(jìn)行后續(xù)試驗。稱取HF模型組和藥物組肝組織樣品適量至液氮預(yù)冷的研缽中，加液氮充分研磨至粉狀，均分別加入4倍量（μL/μg）的8 mol/L 尿素溶液，超聲（每超聲3 s停5 s）裂解3 min，于4 ℃下以1 200 r/min離心10 min，去除細(xì)胞碎片。將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中，采用BCA法測定蛋白含量。于蛋白樣品溶液中加入二硫蘇糖醇使后者終濃度為5 mmol/L，于56 ℃還原30 min;加入碘代乙酰胺適量，室溫避光孵育15 min。按質(zhì)量比1 ∶ 50加入胰酶，于37 ℃酶解過夜;再按質(zhì)量比1 ∶ 100加入胰酶，繼續(xù)同條件再次酶解4 h。經(jīng)酶解后的肽段用Strata X C18除鹽柱除鹽后，真空冷凍干燥。以0.5 mol/L TEAB溶液溶解肽段，根據(jù)TMT相對定量蛋白質(zhì)組試劑盒說明書方法標(biāo)記肽段。肽段經(jīng)0.1%甲酸水溶液溶解后，使用超高效液相系統(tǒng)進(jìn)行分離[色譜柱為Reprosil-Pur C18（200 mm×0.1 mm，1.9 μm），流動相為含0.1%甲酸和2%乙腈的水溶液（A）-含0.1%甲酸和10%水的乙腈溶液（B），梯度洗脫（0～42 min，6%B→22%B;42～54 min，22%B→30%B;54～57 min，30%B→80%B;57～60 min，80%B），流速為500 mL/min，柱溫為50 ℃，進(jìn)樣量為1 μg]，然后再使用質(zhì)譜系統(tǒng)進(jìn)行分析[電離源為納升級電噴霧電離源（NSI），電壓為2.4 kV;一級質(zhì)譜掃描范圍為m/z 350～1 550，掃描分辨率為60 000;二級質(zhì)譜掃描范圍則固定起點為m/z 100，掃描分辨率為17 500]。采用MaxQuant v1.5.2.8軟件進(jìn)行定量分析并對肽段定量值作歸一化處理，篩選蛋白表達(dá)量（即對應(yīng)肽段的信號強(qiáng)度）差異倍數(shù)>1.2且P<0.05的蛋白作為差異表達(dá)蛋白。上述試驗由杭州景杰生物科技有限公司完成。

2.4 生物信息學(xué)分析

采用MaxQuant v1.5.2.8軟件進(jìn)行差異表達(dá)蛋白的質(zhì)譜數(shù)據(jù)檢索與解析;借助Uniprot-GOA數(shù)據(jù)庫（http：//www.ebi.ac.uk/GOA/downloads）對差異表達(dá)蛋白進(jìn)行基因本體（GO）分析（包括GO注釋和GO富集），使用Wolfpsort V0.2軟件對上述蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位注釋;使用KAAS在線服務(wù)工具（http：//www.genome.jp/kaas-bin/kaas_main）對差異表達(dá)蛋白進(jìn)行注釋，通過KEGG mapper在線工具（http：//www.kegg.jp/kegg/mapper.html）對通路進(jìn)行匹配。富集分析采用Perl module方法，以P<0.05為顯著富集。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 24.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 七味清肝散對大鼠HF的抑制作用

3.1.1 一般情況 空白組大鼠健康狀況良好，飲食、飲水正常，行動敏捷，體質(zhì)量自然增長，毛色有光澤，大便成形。HF模型組大鼠飲食減少，行動遲緩，精神萎靡，體質(zhì)量有所下降，皮毛雜亂且無光澤，有時可見大便不成形。七味清肝散各劑量組大鼠狀態(tài)介于空白組和HF模型組之間。

3.1.2 肝臟形態(tài) 空白組大鼠肝臟呈鮮紅色，表面光滑，無粗糙感或顆粒感，且質(zhì)地柔軟。HF模型組大鼠肝臟呈暗紅色甚至黃色，表面粗糙，有明顯的顆粒感，質(zhì)地較硬。七味清肝散各劑量組大鼠肝臟呈暗紅色，表面略粗糙，但無明顯顆粒感，整體狀態(tài)介于空白組和HF模型組之間。

3.1.3 肝臟指數(shù)和肝功能指標(biāo) 與空白組比較，HF模型組大鼠肝臟系數(shù)以及肝功能指標(biāo)（ALT、AST、ALP、HYP）含量均顯著升高（P<0.05）。與HF模型組比較，七味清肝散各劑量組大鼠ALT、AST、HYP含量，低劑量組肝臟系數(shù)以及高劑量組ALP含量均顯著降低（P<0.05），詳見表1。

3.1.4 肝臟纖維形態(tài) 空白組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝板排列整齊，包漿均勻，未見變性壞死、炎癥細(xì)胞浸潤或纖維組織增生。HF模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，肝板排列混亂，肝組織可見大量炎癥細(xì)胞浸潤、肝細(xì)胞氣球樣變、纖維組織增生，個別樣本甚至出現(xiàn)橋間連接以及假小葉。七味清肝散各劑量組大鼠肝組織纖維增生減少，炎癥細(xì)胞浸潤減少，細(xì)胞變性、壞死減少，詳見圖1、圖2。

3.1.5 α-SMA表達(dá) 與空白組比較，HF模型組大鼠肝組織中α-SMA的表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）;與HF模型組比較，七味清肝散各劑量組大鼠肝組織中α-SMA的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05），詳見圖3、表1。

3.2 差異表達(dá)蛋白分析結(jié)果

經(jīng)質(zhì)譜數(shù)據(jù)解析，共鑒定出藥物組表達(dá)蛋白5 013個，HF模型組表達(dá)蛋白5 012個;兩組差異表達(dá)蛋白有146個，其中表達(dá)上調(diào)82個、表達(dá)下調(diào)64個;經(jīng)查閱中國知網(wǎng)、萬方數(shù)據(jù)、PubMed等數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，其中有42個差異表達(dá)蛋白與HF有關(guān)（表達(dá)上調(diào)15個、表達(dá)下調(diào)27個），詳見表2。

3.3 生物學(xué)功能分析結(jié)果

3.3.1 差異表達(dá)蛋白GO注釋 GO注釋內(nèi)容主要包括生物過程、細(xì)胞組分和分子功能。結(jié)果顯示，生物過程以參與單一生物體過程、代謝過程、細(xì)胞進(jìn)程為主，分別富集差異表達(dá)蛋白97、86、83個;細(xì)胞成分以細(xì)胞、細(xì)胞器、膜為主，分別富集差異表達(dá)蛋白96、77、51個;分子功能以結(jié)合、催化活性為主，分別富集差異表達(dá)蛋白91、76個，詳見圖4。亞細(xì)胞定位分析結(jié)果顯示，差異表達(dá)蛋白主要分布于細(xì)胞質(zhì)（定位比例為29.45%，即某生物學(xué)功能項下差異表達(dá)蛋白占所有注釋到該生物學(xué)功能的蛋白總數(shù)的比例，下同）、細(xì)胞外區(qū)（27.4%）和細(xì)胞膜（10.96%），詳見圖5。

3.3.2 差異表達(dá)蛋白富集分析 將差異表達(dá)蛋白在GO、KEGG通路這兩個方面均進(jìn)行富集分析，得到了GO一級分類描述下的三大類（即生物過程、分子功能、細(xì)胞組分）富集結(jié)果以及KEGG通路富集結(jié)果，分別見圖6、圖7（圖中，條形圖越長，則表示差異表達(dá)蛋白在該分類或功能上的富集越顯著）。

GO富集結(jié)果顯示，差異表達(dá)蛋白在細(xì)胞外空間、血液微粒、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)部分等細(xì)胞組分，在氧化還原酶活性、脂肪酸結(jié)合、單羧酸結(jié)合等分子功能，以及在異型細(xì)胞間黏附的調(diào)控、蛋白質(zhì)活化級聯(lián)、調(diào)節(jié)血管大小等生物過程上顯著富集。

KEGG通路富集結(jié)果顯示，差異表達(dá)蛋白主要富集于類固醇激素的生物合成、視黃醇代謝、組氨酸代謝、花生四烯酸代謝、細(xì)胞色素P450代謝外源物質(zhì)和過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）等信號通路（P<0.05）。其中，視黃醇代謝、花生四烯酸代謝和PPAR信號通路與HF有關(guān)[13-14]，且PPAR信號通路中富集到了經(jīng)七味清肝散作用后下調(diào)的脂肪酸結(jié)合蛋白4（FABP4）和膽固醇7α-羥化酶（CYP7A1），二者亦與HF密切相關(guān)[15-17]。

4 討論

七味清肝散是蒙醫(yī)的經(jīng)典名方，常被用于治療各種肝臟疾病[10]。本課題組前期研究已經(jīng)明確了七味清肝散的抗HF作用[11]，所以本研究將重點放在了該方多靶點、多機(jī)制治療HF的潛在靶點上。同時，由于目前尚缺乏療效確切的HF治療藥物，加之民族醫(yī)學(xué)與中醫(yī)理論體系也有所差異，故本研究暫未設(shè)置陽性對照組。蒙藥及其方劑成分復(fù)雜多樣，因缺乏合理的方法對其作用靶點及機(jī)制進(jìn)行深入探討[18-19]，使得蒙藥的發(fā)展受到一定限制。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)的發(fā)展，通過對比藥物組與模型組相關(guān)蛋白表達(dá)的變化，并以此進(jìn)行潛在作用靶點的挖掘，可為科學(xué)闡釋蒙藥的作用機(jī)制提供新的思路。近年來，蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于蒙藥機(jī)制研究等領(lǐng)域中[20-21]。鑒于此，本課題組在進(jìn)一步證實七味清肝散對HF模型大鼠保護(hù)作用的基礎(chǔ)上，結(jié)合TMT技術(shù)初步分析了該方治療HF的潛在靶點及機(jī)制，旨在為其深入研究提供參考。

HF是肝臟疾病發(fā)展過程中的重要節(jié)點，正確認(rèn)識并及時治療可有效控制該病的發(fā)展。有文獻(xiàn)報道，CCl4可導(dǎo)致肝臟炎癥以及纖維化的發(fā)生，并伴隨肝細(xì)胞的變性、壞死、破裂，進(jìn)而使存在于肝細(xì)胞內(nèi)的酶（ALT、AST、ALP）進(jìn)入到血清中，故血清肝酶含量可反映肝細(xì)胞受損程度[22]。此外，HYP是膠原蛋白中特征性的氨基酸成分，在HF發(fā)生時顯著升高，可作為肝功能的評價指標(biāo)之一[23]。除上述指標(biāo)外，病理切片亦有助于更準(zhǔn)確地判斷肝臟病變的程度。其中，HE染色可用以觀察炎癥細(xì)胞浸潤、氣球樣變、假小葉等病理狀態(tài);Masson染色則可直觀反映肝組織中膠原纖維的生成情況，從而判斷HF的進(jìn)展程度。因此，本研究在測定肝臟指數(shù)的基礎(chǔ)上，選擇了ALT、AST、ALP、HYP等肝功能指標(biāo)以及HE、Masson染色病理切片以評價七味清肝散對HF模型大鼠的保護(hù)作用。結(jié)果顯示，與空白組比較，HF模型組大鼠肝臟偏硬且觸摸有顆粒感，肝臟系數(shù)和血清中ALT、AST、ALP、HYP含量均顯著升高;病理切片可見炎癥細(xì)胞浸潤、假小葉形成、橋間連接以及纖維組織增生等現(xiàn)象。與HF模型組比較，七味清肝散各劑量組大鼠肝組織病變均有不同程度的減輕，各劑量組大鼠血清ALT、AST、HYP含量和低劑量組肝臟系數(shù)、高劑量組ALP含量均顯著降低。這提示七味清肝散可減輕HF模型大鼠的肝臟損傷和纖維化程度。

HSC激活是HF病理過程的中心環(huán)節(jié)，而α-SMA是HSC激活的標(biāo)志物;HSC激活后，α-SMA呈高表達(dá)，會進(jìn)一步造成ECM合成增多、堆積，最終引發(fā)HF[24]。本研究結(jié)果顯示，與空白組比較，HF模型組大鼠肝組織中α-SMA的表達(dá)水平顯著升高;與HF模型組比較，七味清肝散各劑量組大鼠肝組織中α-SMA的表達(dá)水平均顯著降低。這提示該方可通過下調(diào)α-SMA的表達(dá)來抑制HSC的活化，從而發(fā)揮抑制HF的作用。上述結(jié)果與相關(guān)研究[11]基本一致。

本研究利用TMT技術(shù)共篩選出藥物組和HF模型組間的差異表達(dá)蛋白146個，其中與HF相關(guān)的有42個。已有研究證實，磷酸酶與張力蛋白同源物（PTEN）與HF相關(guān)：PTEN可負(fù)性調(diào)控活化HSC的細(xì)胞周期、抑制活化HSC增殖、誘導(dǎo)活化HSC凋亡、抑制活化HSC的膠原合成，與HF的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[25-26]。視黃醇脫氫酶（RDH）是視黃醇合成的關(guān)鍵酶，其表達(dá)下調(diào)可導(dǎo)致宮頸癌細(xì)胞增殖;轉(zhuǎn)染RDH后，宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力均下降[27]。雖然目前并無研究報道RDH與HF的相關(guān)性，但RDH位于視黃醇代謝信號通路的重要節(jié)點，且視黃醇與肝臟受損密切相關(guān)，如肝臟受損可影響視黃醇的代謝[13];視黃醇可影響儲脂細(xì)胞（如HSC）中的膠原纖維產(chǎn)生及向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化[28];過量視黃醇可導(dǎo)致多種形式的肝臟損害[29];視黃醇缺乏可能與肝癌發(fā)生有關(guān)[30]等。本研究結(jié)果顯示，與HF模型組比較，七味清肝散組PTEN、RDH蛋白的表達(dá)均顯著上調(diào)（P<0.001）。這提示PTEN、RDH可能是治療HF的靶點之一。后續(xù)本課題組將以此入手，繼續(xù)研究七味清肝散抗HF的作用機(jī)制。

為了進(jìn)一步明確七味清肝散治療HF的潛在靶點和機(jī)制，本研究進(jìn)一步運用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法進(jìn)行分析。GO數(shù)據(jù)庫能夠?qū)Σ煌瑪?shù)據(jù)庫中關(guān)于基因和基因產(chǎn)物的生物學(xué)術(shù)語進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，對基因和蛋白功能進(jìn)行統(tǒng)一的限定和描述，也就是說，GO數(shù)據(jù)庫可給每個基因貼上“標(biāo)簽”，以便研究者能夠通過此標(biāo)簽快速尋找到目標(biāo)基因，并針對某類GO生物學(xué)功能進(jìn)行快速分析[31]。通過GO注釋及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位，筆者發(fā)現(xiàn)七味清肝散治療HF時的作用靶點主要在細(xì)胞內(nèi)，位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞外基質(zhì)，有結(jié)合、催化和轉(zhuǎn)錄活性，參與單一生物體過程、代謝過程以及細(xì)胞進(jìn)程相關(guān)生物過程。從富集結(jié)果來看，七味清肝散改善HF最主要是通過一些位于細(xì)胞外空間且具有氧化還原酶活性、脂肪酸結(jié)合等分子功能以及可參與細(xì)胞間黏附、蛋白質(zhì)活化級聯(lián)等生物過程的蛋白來發(fā)揮作用。

HF主要表現(xiàn)為ECM調(diào)控失調(diào)及異常沉積，影響正常肝臟功能[32]。這一過程涉及多個信號通路，例如轉(zhuǎn)化生長因子β/Smad、整合素、細(xì)胞外因子/β-聯(lián)蛋白、以及Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶（Rho-ROCK）信號通路[33-36]。本研究也富集到一些與HF相關(guān)的信號通路，如視黃醇代謝、花生四烯酸代謝、PPAR信號通路等。有研究指出，肝臟是花生四烯酸代謝物產(chǎn)生、發(fā)揮作用及失活的重要場所[14]。當(dāng)肝臟受損時，花生四烯酸代謝過程勢必會受到影響，提示該代謝通路可能成為七味清肝散治療HF的靶點。PPAR信號通路可參與HSC活化及其向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程，也參與了HF的發(fā)展[37-38]。本研究挖掘到了該通路上富集的FABP4和CYP7A1。其中，F(xiàn)ABP4是脂結(jié)合蛋白家族中的一員，在脂質(zhì)代謝中起著至關(guān)重要的作用[39]。臨床研究顯示，F(xiàn)ABP4表達(dá)于肝纖維化、肝硬化組織，且隨著HF程度加重而增多[15];也有研究證實，F(xiàn)ABP4在慢性丙型肝炎病毒致肝病患者體內(nèi)的表達(dá)升高，但經(jīng)抗病毒藥物治療后，其表達(dá)量有所降低，提示該蛋白可能與肝損傷過程有關(guān)[16]。CYP7A1是膽汁酸合成的關(guān)鍵限速酶，可調(diào)節(jié)體內(nèi)膽汁酸的平衡[40]。CYP7A1表達(dá)升高后，機(jī)體膽汁酸合成過多，造成肝內(nèi)膽汁淤積、ECM合成增多，最終引發(fā)HF[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP4、CYP7A1蛋白均顯著下調(diào)，提示七味清肝散抑制HF可能是通過上述靶點來實現(xiàn)的。

綜上所述，七味清肝散可降低HF模型大鼠的肝臟系數(shù)以及血清中ALT、AST、ALP、HYP含量，下調(diào)α-SMA的表達(dá)，改善肝組織的炎癥及纖維化程度，對其具有一定的保護(hù)作用。藥物組和HF模型組間的差異表達(dá)蛋白主要位于細(xì)胞外空間，富集于氧化還原酶活性、脂肪酸結(jié)合等分子功能，異型細(xì)胞間黏附的調(diào)控、蛋白質(zhì)活化級聯(lián)等生物過程以及視黃醇代謝、花生四烯酸代謝、PPAR等信號通路上。上述蛋白及通路可能是該方治療HF的重要靶點，也體現(xiàn)了該方抗HF的多靶點作用特點。本課題組后續(xù)將借助液質(zhì)聯(lián)用等技術(shù)分析七味清肝散整方及入血成分，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和反向分子對接等手段深入挖掘各組分的作用靶標(biāo);同時，擬聯(lián)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)等手段進(jìn)一步探討該方抗HF的具體機(jī)制，為該方的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2019-09-26 修回日期：2020-03-31）

（編輯：張元媛）