郭豐　黃山　李斌

中圖分類(lèi)號(hào) R285 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2020）11-1303-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.11.04

摘 要 目的：基于核因子2（Nrf2）/血紅素加氧酶1（HO-1）信號(hào)通路研究夜關(guān)門(mén)提取物對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)小鼠海馬細(xì)胞HT22損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。方法：采用谷氨酸（5 mmol/L）建立HT22細(xì)胞損傷模型后，以水溶性維生素E為陽(yáng)性對(duì)照（50 ?mol/L），采用MTT法檢測(cè)0（空白對(duì)照）、25、50、100 ?g/mL夜關(guān)門(mén)的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯提取物預(yù)處理12 h后對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)損傷細(xì)胞增殖的影響。以水溶性維生素E為陽(yáng)性對(duì)照（50 ?mol/L），采用2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽探針（DCFH-DA）法檢測(cè)0（空白對(duì)照）、25、50、100 ?g/mL夜關(guān)門(mén)二氯甲烷提取物預(yù)處理12 h后對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)損傷細(xì)胞中活性氧（ROS）水平的影響;以HO-1激動(dòng)劑鈷-原卟啉為陽(yáng)性對(duì)照，采用Western blotting法檢測(cè)0（空白對(duì)照）、25、50、100 ?g/mL夜關(guān)門(mén)二氯甲烷提取物處理24 h后對(duì)細(xì)胞中HO-1蛋白表達(dá)的影響;分別采用Western blotting法（藥物分別處理0.5、1、1.5 h）和免疫熒光染色法（藥物處理1 h）檢測(cè)100 ?g/mL夜關(guān)門(mén)二氯甲烷提取物處理后對(duì)細(xì)胞核內(nèi)外Nrf2蛋白表達(dá)的影響。采用小干擾RNA（si-RNA）轉(zhuǎn)染技術(shù)進(jìn)行HO-1基因沉默后，考察100 ?g/mL夜關(guān)門(mén)二氯甲烷提取物對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)損傷細(xì)胞的存活率以及細(xì)胞中ROS水平的影響。結(jié)果：與空白對(duì)照比較，50、100 ?g/mL夜關(guān)門(mén)二氯甲烷提取物均可顯著升高細(xì)胞的存活率（P<0.05），并降低細(xì)胞中ROS水平（P<0.05）;25、50、100 ?g/mL夜關(guān)門(mén)二氯甲烷提取物均可顯著升高細(xì)胞中HO-1蛋白表達(dá)水平（P<0.05），100 ?g/mL夜關(guān)門(mén)二氯甲烷提取物可顯著降低細(xì)胞質(zhì)中Nrf2蛋白水平并升高細(xì)胞核中Nrf2蛋白水平（P<0.05）。HO-1基因沉默后，夜關(guān)門(mén)二氯甲烷提取物對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)損傷細(xì)胞的促增殖以及降低ROS水平的作用被逆轉(zhuǎn)（P<0.05）。結(jié)論：夜關(guān)門(mén)二氯甲烷提取物可通過(guò)激活Nrf2信號(hào)通路，誘導(dǎo)HO-1蛋白的表達(dá)，從而發(fā)揮對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)損傷HT22細(xì)胞的保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞 夜關(guān)門(mén);谷氨酸;血紅素加氧酶 1;核因子2;小鼠;海馬細(xì)胞HT22;機(jī)制

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the protective effects of Lespedeza cuneata extract on glutamate-induced hippocampal cells HT22 injury of mice and its possible mechanism based on Nrf2/HO-1 signaling pathway. METHODS： Using glutamate （5 mmol/L） to extablish the injury model of HT22 cells. Using water soluble vitamin E as positive control （50 ?mol/L）， MTT assay was used to detect the effects of 0 （blank control）， 25， 50， 100 ?g/mL petroleum ether extract， dichloromethane extract， ethyl acetate extract of L. cuneata on the proliferation of glutamate-induced injury cellsafter pretreated for 12 h. Using water soluble vitamin E as positive control （50 ?mol/L）， DCFH-DA assay was used to detect the effects of 0 （blank control）， 25， 50， 100 ?g/mL L. cuneata dichloromethane extract on the level of active oxygen （ROS） in glutamate-induced injury cells after pretreated with 12 h. Using HO-1 agonist CoPP as positive control， Western blotting method was used to detect the effects of 0 （blank control）， 25， 50， 100 ?g/mL L. cuneata dichloromethane extract on the protein expression of HO-1 after treated for 24 h. Western blotting method （treated for 0.5， 1， 1.5 h） and immunofluorescence staining （treated for 1 h） were used to detect the effects of 100 ?g/mL L. cuneata dichloromethane extract on protein expression of Nrf2 inside and outside the nucleus. After HO-1 gene was silenced by small interfering RNA （Si RNA） transfection technology， the effects of 100 ?g/mL L. cuneata dichloromethane extract on the survival rates of glutamate-induced injury cells and the level of ROS were detected. RESULTS： Compared with blank control， 50， 100 ?g/mL L. cuneata dichloromethane extract could significantly improve the survival rate of glutamate-induced injury cells （P<0.05）， while reduced the level of ROS （P<0.05）. 25， 50， 100 ?g/mL L. cuneata dichloromethane extract could increase the protein expression of HO-1 in cells （P<0.05）， while 100 ?g/mL L. cuneata dichloromethane extract could significantly decrease the protein level of Nrf2 in cytoplasm and increase that in nucleus （P<0.05）. After HO-1 gene silencing， the effects of L. cuneata dichloromethane extract on the proliferation promotion of glutamate-induced injury cells and the reduction of ROS level were reversed （P<0.05）. CONCLUSIONS： L. cuneata dichloromethane extract can protect HT22 cells against injury induced by glutamate through activating Nrf2 pathway， inducing HO-1 expression.

KEYWORDS? ?Lespedeza cuneata; Glutamate; HO-1; Nrf2; Mice; Hippocampal cells HT22; Mechanism

大腦中的海馬神經(jīng)元損傷是各種神經(jīng)退行性疾病的重要病理環(huán)節(jié)[1-2]。谷氨酸作為哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，不僅參與了快速的興奮性突觸傳遞，還可以調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、突觸的可塑性，參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常的生理功能[3]。然而，細(xì)胞間隙中谷氨酸濃度過(guò)高時(shí)會(huì)對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生氧化應(yīng)激與毒性，導(dǎo)致神經(jīng)元的退化、衰老及死亡，谷氨酸引起的神經(jīng)毒性是導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病中神經(jīng)細(xì)胞死亡的重要機(jī)制之一[4]。夜關(guān)門(mén)為豆科胡枝子屬植物夜關(guān)門(mén)（Lespedeza cuneata G. Don）的全草，廣泛分布于我國(guó)大部分地區(qū)[5]，具有清熱解毒、利濕消積等功效[6-7]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，夜關(guān)門(mén)具有抗菌、抗炎及抗氧化等多種生物活性[8-9]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，夜關(guān)門(mén)可以通過(guò)降低腦組織中一氧化氮（NO）及活性氧（ROS）水平有效地抑制小鼠實(shí)驗(yàn)性失眠[10]，而NO與ROS水平異常則是腦神經(jīng)毒性的重要指標(biāo)。因此，本課題組利用谷氨酸誘導(dǎo)小鼠海馬細(xì)胞HT22損傷模型，探究夜關(guān)門(mén)提取物對(duì)腦神經(jīng)保護(hù)的藥效作用及相關(guān)機(jī)制，為該藥用植物的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

AS110 R2型分析天平（波蘭Radwag公司）;ELx800型多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek公司）;HS-1302型超凈工作臺(tái)（上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司）;GL-802型微型臺(tái)式真空泵（海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司）;CCL-170B-8型CO2恒溫培養(yǎng)箱（新加坡藝思高生物科技有限公司）;XSP-17CV型倒置生物顯微鏡（上海巴拓儀器有限公司）;XB-K-25型細(xì)胞計(jì)數(shù)板（深圳市達(dá)科為生物技術(shù)有限公司）; Mini P-4型小型垂直電泳系統(tǒng)（北京凱元信瑞儀器有限公司）;Tanon-4600型化學(xué)發(fā)光成像儀（上海天能科技有限公司）;CX31-12C04型雙目生物熒光顯微鏡（日本Olympus公司）;TDZ5-WS型冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）。

1.2 藥品與試劑

夜關(guān)門(mén)藥材于2018年8月采自山東青島，經(jīng)青島科技大學(xué)化工學(xué)院黃山教授鑒定為豆科胡枝子屬植物夜關(guān)門(mén)（L. cuneata G. Don）的全草;水溶性維生素E對(duì)照品、谷氨酸對(duì)照品（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：1001270674、100023-198601，純度：97%、98%）;二甲亞砜（DMSO，美國(guó)Amresco公司）;DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶、青霉素/鏈霉素雙抗（美國(guó)Gibco-BRL公司，批號(hào)：2081862、11041-8611、90326-1、91018-1）;Griess染色試劑盒（美國(guó)Promega公司，批號(hào)：20190605）;Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒、RIPA裂解液（北京索萊寶生物科技有限公司，批號(hào)：20190708、20290305）;血紅素加氧酶1（HO-1）小鼠單克隆抗體、核因子2（Nrf2）小鼠單克隆抗體、β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）小鼠單克隆抗體、核纖層蛋白B（Lamin-B）小鼠單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的兔抗小鼠免疫球蛋白G（IgG）二抗、小干擾RNA 對(duì)照品（si-RNA control）、HO-1小干擾RNA （si-RNA HO-1）、鈷-原卟啉（CoPP）（美國(guó)Santa Cruz公司）;2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽探針（DCFH-DA）、異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的IgG二抗、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染液（英國(guó)Abcam公司，批號(hào)：ab113851、ab188285、ab228549）;LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑（美國(guó)Invitrogen公司，批號(hào)：1306267）;MTT試劑盒、ROS檢測(cè)試劑盒、二喹啉甲酸（BCA）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：804W0515、100-500T、20180317）;其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 細(xì)胞

小鼠海馬細(xì)胞HT22細(xì)胞株由韓國(guó)圓光大學(xué)金英哲教授贈(zèng)送。

2 方法

2.1 夜關(guān)門(mén)不同溶劑提取物的制備

取夜關(guān)門(mén)藥材，打成粗粉，稱取粗粉3份，各500 g，以70%乙醇為溶劑、料液比（g/mL）為1 ∶ 30，在80 ℃條件下回流提取，然后分別以石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯對(duì)提取液進(jìn)行萃取，每種溶劑均萃取3次，每次溶劑用量均為12、8、6倍（L/kg），每次均萃取2 h;濾過(guò)，合并濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在水浴條件下減壓濃縮，然后于55 ℃水浴中揮干溶劑，分別得到石油醚提取物（得率為2.78%）、二氯甲烷提取物（得率為3.23%）和乙酸乙酯提取物（得率為3.12%）。

2.2 細(xì)胞的培養(yǎng)

將細(xì)胞接種于含10%FBS和1%青霉素/鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于試驗(yàn)。

2.3 夜關(guān)門(mén)不同溶劑提取物的細(xì)胞毒性考察

將細(xì)胞用含10%FBS和1%青霉素/鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基（下同）重懸至密度為8×104個(gè)/mL，接種到96孔板中，每孔100 μL，將細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。然后將細(xì)胞分為空白組和夜關(guān)門(mén)的乙酸乙酯、二氯甲烷、石油醚提取物組（質(zhì)量濃度均為25、50、100、200 μg/mL，均以浸膏量計(jì)，下同），每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。各給藥組細(xì)胞先加入含相應(yīng)藥液的培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)12 h，空白組細(xì)胞加入空白培養(yǎng)基，然后加入50 μL MTT試劑（終質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h;吸棄上清液，加入150 μL DMSO溶液，輕微振搖1 min至DMSO將甲臜結(jié)晶完全溶解后，采用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的光密度（OD），并計(jì)算細(xì)胞存活率[細(xì)胞存活率（%）=OD試驗(yàn)組/OD空白組×100%]。

2.4 夜關(guān)門(mén)不同溶劑提取物對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的影響

按“2.3”項(xiàng)下方法接種、培養(yǎng)細(xì)胞后，將細(xì)胞分為空白組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組（水溶性維生素E，50 μmoL/L）和夜關(guān)門(mén)的乙酸乙酯、二氯甲烷、石油醚提取物組（質(zhì)量濃度均為25、50、100 μg/mL），每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。各給藥組細(xì)胞先加入含相應(yīng)藥液的培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)12 h，空白組、模型組細(xì)胞加入空白培養(yǎng)基，然后除空白組外，其余各組細(xì)胞均加入谷氨酸（終濃度為5 mmol/L）誘導(dǎo)損傷24 h，再按“2.3”項(xiàng)下MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率。

2.5 夜關(guān)門(mén)二氯甲烷提取物對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)損傷細(xì)胞中ROS水平的影響

采用DCFH-DA法檢測(cè)細(xì)胞中ROS水平。將細(xì)胞用培養(yǎng)基重懸至密度為2.5×104 個(gè)/mL，接種到24孔板中，每孔1 mL，將細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。然后將細(xì)胞分為空白組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組（水溶性維生素E，50 μmoL/L）和夜關(guān)門(mén)二氯甲烷提取物不同質(zhì)量濃度組（25、50、100 μg/mL），每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔?？瞻捉M細(xì)胞不作處理;模型組細(xì)胞在培養(yǎng)12 h后，加入5 mmol/L谷氨酸誘導(dǎo)損傷12 h;各給藥組細(xì)胞分別添加相應(yīng)藥液預(yù)處理12 h后，再加入5 mmol/L谷氨酸誘導(dǎo)損傷12 h。吸棄培養(yǎng)液，用無(wú)血清和抗體的培養(yǎng)基洗細(xì)胞3遍;用10 μmoL/L 的DCFH-DA避光孵育30 min，再用無(wú)血清和抗體的培養(yǎng)基洗3遍;加入1%Triton X-100 在37 ℃下孵育10 min，然后分別在激發(fā)波長(zhǎng)488 nm和發(fā)射波長(zhǎng)525 nm下用熒光分光光度計(jì)測(cè)定各孔的熒光強(qiáng)度，計(jì)算細(xì)胞中ROS水平（ROS水平=試驗(yàn)組熒光強(qiáng)度/空白組熒光強(qiáng)度）。

2.6 夜關(guān)門(mén)二氯甲烷提取物對(duì)細(xì)胞中HO-1蛋白表達(dá)的影響

采用Western blotting法檢測(cè)細(xì)胞中HO-1蛋白表達(dá)水平。將細(xì)胞用培養(yǎng)基重懸至密度為1×105 個(gè)/mL，接種到6孔板中，每孔1 mL。將細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。然后將細(xì)胞分為空白組、CoPP組（HO-1激動(dòng)劑，20 μmmol/L）和夜關(guān)門(mén)二氯甲烷提取物不同質(zhì)量濃度組（25、 50、100 μg/mL），每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔?？瞻捉M細(xì)胞不作處理，各給藥組細(xì)胞分別加入相應(yīng)藥液處理24 h。吸棄培養(yǎng)液，加1 mL冰PBS重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，以300 r/min離心3 min，吸棄培養(yǎng)液;加入50 μL含蛋白酶和磷酸化蛋白酶抑制劑的RIPA細(xì)胞裂解液，于冰上裂解10 min，然后在4 ℃下以15 000 r/min離心20 min，取上清液，置于-80 ℃冰柜中保存，備用。按BCA法測(cè)定總蛋白含量。取30 μg總蛋白進(jìn)行10%～12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），條件為電壓120 V、電流300 mA、時(shí)間90 min;電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，用TBST緩沖液洗膜3次，室溫下用封閉劑（5%的脫脂奶粉）孵育2 h;再用TBST洗3次，加入HO-1、β-actin一抗（1 ∶? ? ? ? 1 000），在室溫下以封閉劑孵育1.5 h;TBST洗膜3次，加入HRP標(biāo)記的二抗（1 ∶ 5 000），在室溫下以封閉劑孵育1 h;TBST洗膜3次，以ECL試劑進(jìn)行顯色，利用化學(xué)發(fā)光成像儀進(jìn)行分析。通過(guò)Gel-Pro Analyzer 4.0軟件對(duì)蛋白條帶灰度進(jìn)行定量分析，以目標(biāo)條帶灰度值與內(nèi)參β-actin條帶灰度值之比表示目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。

2.7 夜關(guān)門(mén)二氯甲烷提取物對(duì)細(xì)胞中Nrf2蛋白表達(dá)的影響

2.7.1 Western blotting法檢測(cè) 按“2.5”項(xiàng)下方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行接種和培養(yǎng)后，將細(xì)胞分為空白組和夜關(guān)門(mén)二氯甲烷提取物組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔?？瞻捉M細(xì)胞不作處理，夜關(guān)門(mén)二氯甲烷提取物組細(xì)胞分別用100 μg/mL夜關(guān)門(mén)二氯甲烷提取物處理不同時(shí)間（0.5、1、1.5 h）后，吸棄上清液，加1 mL冰磷酸鹽緩沖液（PBS），重懸細(xì)胞至1.5 mL離心管中，以300 r/min離心3 min;吸棄培養(yǎng)液，加入20 μL 含蛋白酶和磷酸化蛋白酶抑制劑的細(xì)胞質(zhì)裂解液，于冰上裂解10 min，然后在4 ℃下以15 000 r/min離心20 min，取上清液，即為細(xì)胞質(zhì)蛋白溶液;沉淀加入細(xì)胞核裂解液，與細(xì)胞質(zhì)裂解步驟相同，取上清液，即為細(xì)胞核蛋白溶液。采用BCA法測(cè)定蛋白含量，然后取蛋白按“2.5”項(xiàng)下方法進(jìn)行電泳試驗(yàn)并分析結(jié)果（細(xì)胞核中 Nrf2蛋白表達(dá)水平測(cè)定的內(nèi)參為L(zhǎng)amin B，細(xì)胞質(zhì)中Nrf2蛋白表達(dá)水平測(cè)定的內(nèi)參為β-actin）。

2.7.2 免疫熒光法檢測(cè) 將細(xì)胞用培養(yǎng)基重懸至密度為1×105 個(gè)/mL，在6孔板中預(yù)先加入12 mm細(xì)胞爬片，然后將細(xì)胞接種到6孔板中，每孔1 mL。將細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。然后將細(xì)胞分為空白組和夜關(guān)門(mén)二氯甲烷提取物組，空白組細(xì)胞不作處理，夜關(guān)門(mén)二氯甲烷提取物組細(xì)胞用100 μg/mL夜關(guān)門(mén)二氯甲烷提取物處理1.5 h后，吸棄培養(yǎng)液，用PBS洗3次;用4%多聚甲醛在室溫固定20 min，用0.1% Triton X100 孵育10 min，然后用含1%FBS的脫脂奶粉封閉30 min;加入Nrf2一抗（1 ∶ 200），孵育過(guò)夜，用PBS沖洗;再加入FITC標(biāo)記的二抗（1 ∶ 2 000），避光孵育1 h，PBS洗3次;加入DAPI（0.5 mg/mL） 孵育5 min，PBS洗3次。將細(xì)胞爬片取出，封片，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。綠色熒光為Nrf2陽(yáng)性染色，藍(lán)色熒光為細(xì)胞核染色。

2.8 HO-1基因沉默后夜關(guān)門(mén)二氯甲烷提取物對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的影響

將細(xì)胞用培養(yǎng)基重懸至密度為2.5×104個(gè)/mL，接種到24孔板中，每孔1 mL。將細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，將其分為空白組、模型組、夜關(guān)門(mén)二氯甲烷提取物組、夜關(guān)門(mén)二氯甲烷提取物+siRNA HO-1組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。分別將siRNA HO-1與其對(duì)照siRNA control樣品用無(wú)血清和抗體的培養(yǎng)基稀釋至濃度為40 nmol/L。之后取LipofectamineTM 2000稀釋液1 μL于50 μL培養(yǎng)基中，室溫孵育5 min后與上述稀釋后的siRNA溶液混合，室溫靜置20 min，得到轉(zhuǎn)染液。將轉(zhuǎn)染液加入各細(xì)胞孔中，每孔100 μL。其中，空白組、模型組與夜關(guān)門(mén)二氯甲烷提取物組加入siRNA control轉(zhuǎn)染液，夜關(guān)門(mén)二氯甲烷提取物+siRNA HO-1組加入siRNA HO-1轉(zhuǎn)染液。然后，夜關(guān)門(mén)二氯甲烷提取物組及夜關(guān)門(mén)二氯甲烷提取物+siRNA HO-1組分別加入夜關(guān)門(mén)二氯甲烷提取物（100 μg/mL）處理細(xì)胞24 h，空白組不作處理。之后分別按“2.3”～“2.5”項(xiàng)下方法進(jìn)行細(xì)胞存活率及細(xì)胞中ROS水平和HO-1蛋白表達(dá)的檢測(cè)，以判斷夜關(guān)門(mén)二氯甲烷提取物是否通過(guò)促進(jìn)HO-1蛋白的表達(dá)進(jìn)而發(fā)揮藥效。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用GraphPad Prism 5.0軟件繪制柱形圖。數(shù)據(jù)以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 夜關(guān)門(mén)不同溶劑提取物的細(xì)胞毒性測(cè)定結(jié)果

當(dāng)夜關(guān)門(mén)各溶劑提取物的質(zhì)量濃度在25～100? ? ? ? μg/mL范圍時(shí)，對(duì)細(xì)胞活性均無(wú)明顯影響;當(dāng)提取物質(zhì)量濃度達(dá)到200 μg/mL時(shí)，均可顯著降低細(xì)胞的存活率（P<0.05）。這表明在25～100 μg/mL范圍內(nèi)，各溶劑提取物對(duì)細(xì)胞的毒性較小，故以此質(zhì)量濃度范圍進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。夜關(guān)門(mén)不同溶劑提取物對(duì)細(xì)胞的毒性考察結(jié)果見(jiàn)圖1。

3.2 夜關(guān)門(mén)不同溶劑提取物對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的影響

與空白組比較，模型組細(xì)胞的存活率顯著降低（P<0.05）。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和50、100 μg/mL夜關(guān)門(mén)二氯甲烷提取物組細(xì)胞的存活率顯著降低（P<0.05），而其余提取物組細(xì)胞存活率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），可見(jiàn)夜關(guān)門(mén)二氯甲烷提取物對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷具有一定的保護(hù)作用，故后續(xù)試驗(yàn)以夜關(guān)門(mén)二氯甲烷提取物為研究對(duì)象。夜關(guān)門(mén)不同溶劑提取物對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的影響考察結(jié)果見(jiàn)圖2。

3.3 夜關(guān)門(mén)二氯甲烷提取物對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)損傷細(xì)胞中ROS水平的影響

與空白組比較，模型組細(xì)胞中ROS水平顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和50、100 μg/mL夜關(guān)門(mén)二氯甲烷提取物組細(xì)胞中ROS水平顯著降低（P<0.05），且夜關(guān)門(mén)二氯甲烷提取物的作用具有一定的濃度依賴性趨勢(shì)。各組細(xì)胞中ROS水平測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

3.4 夜關(guān)門(mén)二氯甲烷提取物對(duì)細(xì)胞中HO-1蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，CoPP組和25、50、100 μg/mL夜關(guān)門(mén)二氯甲烷提取物組細(xì)胞中HO-1蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05），且夜關(guān)門(mén)二氯甲烷提取物的作用具有一定的濃度依賴趨勢(shì)。各組細(xì)胞中HO-1蛋白表達(dá)的電泳圖見(jiàn)圖3，蛋白表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

3.5 夜關(guān)門(mén)二氯甲烷提取物對(duì)細(xì)胞中Nrf2蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，夜關(guān)門(mén)二氯甲烷提取物不同處理時(shí)間組細(xì)胞質(zhì)中Nrf2蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05），而細(xì)胞核中Nrf2蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）。各組細(xì)胞中Nrf2蛋白表達(dá)的電泳圖見(jiàn)圖4，蛋白水平測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3;免疫熒光染色顯微圖見(jiàn)圖5。

3.6 HO-1基因沉默后夜關(guān)門(mén)二氯甲烷提取物對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的影響

進(jìn)行si-RNA HO-1轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞中HO-1蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），表明si-RNA HO-1轉(zhuǎn)染對(duì)HO-1基因發(fā)揮了沉默作用。夜關(guān)門(mén)二氯甲烷提取物可升高谷氨酸誘導(dǎo)損傷細(xì)胞的存活率及細(xì)胞中ROS水平（P<0.05），而HO-1基因沉默后逆轉(zhuǎn)了夜關(guān)門(mén)二氯甲烷提取物對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)損傷細(xì)胞的促進(jìn)增殖以及降低ROS水平的作用（P<0.05）。HO-1基因沉默后各組細(xì)胞中HO-1蛋白表達(dá)的電泳圖見(jiàn)圖6，蛋白表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4;細(xì)胞存活率和細(xì)胞中ROS水平測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。

4 討論

谷氨酸引起的神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激和興奮性毒性與各類(lèi)神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生、發(fā)展有著密切聯(lián)系。研究發(fā)現(xiàn)，高濃度谷氨酸能引起海馬組織中谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體及谷氨酸重?cái)z取的功能下降[11]。本研究采用5 mmoL/L谷氨酸誘導(dǎo)小鼠海馬細(xì)胞HT22發(fā)生氧化應(yīng)激，從而引起細(xì)胞損傷及細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生。用不同溶劑夜關(guān)門(mén)提取物對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理后，發(fā)現(xiàn)夜關(guān)門(mén)二氯甲烷提取物可以顯著抑制由谷氨酸誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷和ROS的過(guò)量生成，這說(shuō)明夜關(guān)門(mén)二氯甲烷提取物具有顯著的神經(jīng)保護(hù)活性。

HO-1是一種廣泛存在的抗氧化防御酶，是熱休克蛋白家族中的一個(gè)成員，可代謝血紅素生成一氧化碳（CO）、膽紅素和游離鐵。相關(guān)研究表明，HO-1及其代謝產(chǎn)物具有神經(jīng)保護(hù)作用[12]。Nrf2是體內(nèi)調(diào)控HO-1表達(dá)的重要上游蛋白，在正常狀態(tài)下，Nrf2與Nrf2的細(xì)胞質(zhì)抑制劑Keap1結(jié)合;在受到外界刺激時(shí)，Nrf2從復(fù)合體中解離出來(lái)后，從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，與HO-1啟動(dòng)子ARE結(jié)合，激活HO-1基因表達(dá)，從而發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用[13-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，夜關(guān)門(mén)二氯甲烷提取物及CoPP可以誘導(dǎo)細(xì)胞中HO-1的表達(dá)，同時(shí)也可以使細(xì)胞中Nrf2活化并從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至胞核;而利用si-RNA轉(zhuǎn)染技術(shù)進(jìn)行HO-1基因沉默后，可以逆轉(zhuǎn)夜關(guān)門(mén)二氯甲烷提取物的上述作用。

綜上所述，夜關(guān)門(mén)二氯甲烷提取物可通過(guò)激活谷氨酸誘導(dǎo)小鼠海馬細(xì)胞的Nrf2信號(hào)通路，來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞中HO-1蛋白的表達(dá)，從而發(fā)揮其對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用。但本研究結(jié)論仍需動(dòng)物藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)等相關(guān)研究進(jìn)一步證實(shí)。

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（收稿日期：2019-12-26 修回日期：2020-04-21）

（編輯：林 靜）