馬強　熊書　苗加偉　陳潔　周海英　羅嬌　楊貞妮　孫厚良　鄧雪松

中圖分類號 R737.9;R965.2 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2020）11-1342-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.11.10

摘 要 目的：研究木香烴內(nèi)酯對乳腺癌SK-BR-3細胞增殖、遷移和凋亡的影響及機制。方法：取對數(shù)生長期的SK-BR-3細胞，分別加入不同濃度（10、20、30、40、50 μmol/L）的木香烴內(nèi)酯作用24、48、72 h，采用CCK-8法檢測細胞的增殖抑制率。將細胞分為空白對照組和木香烴內(nèi)酯10、20、30 μmol/L濃度組，采用Hoechst 33258熒光染色法觀察細胞形態(tài)及凋亡情況，并計算細胞凋亡率;采用細胞劃痕試驗檢測細胞的遷移能力，并計算遷移率;采用Western blotting法檢測細胞中B淋巴細胞瘤因子2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3）和分裂型Caspase-3（Cleaved Caspase-3）蛋白的相對表達水平。結(jié)果：木香烴內(nèi)酯對SK-BR-3細胞具有顯著的增殖抑制作用（P<0.05或P<0.01），且呈現(xiàn)濃度和時間依賴趨勢?？瞻讓φ战M細胞輪廓清晰、形態(tài)規(guī)則、貼壁較好;與空白對照組比較，木香烴內(nèi)酯10、20、30 μmol/L濃度組細胞數(shù)量明顯減少，細胞結(jié)構(gòu)松散、體積縮小、間隙變大，且多數(shù)細胞輪廓消失、變圓，貼壁不良;細胞遷移率和Bcl-2蛋白的相對表達水平均顯著降低，細胞凋亡率和Bax、Caspase-3及Cleaved Caspase-3蛋白的相對表達水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：木香烴內(nèi)酯能抑制人乳腺癌SK-BR-3細胞增殖和遷移，誘導(dǎo)其凋亡，其作用機制可能與上調(diào)Bax、Caspase-3和Cleaved Caspase-3表達，下調(diào)Bcl-2表達有關(guān)。

關(guān)鍵詞 木香烴內(nèi)酯;人乳腺癌SK-BR-3細胞;增殖;遷移;凋亡;機制

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the effects of costunolide on the proliferation， migration and apoptosis of breast cancer SK-BR-3 cells and its mechanism. METHODS： SK-BR-3 cells in logarithmic growth period were collected and cultured with different concentrations （10， 20， 30， 40， 50 μmol/L） of costunolide for 24， 48， 72 h. Inhibitory rate of costunolide on cell proliferation was detected with CCK-8. The cells were divided into blank control group and costunolide group （10， 20， 30 μmol/L）. Hoechst 33258 fluorescence was used to observe the morphology and apoptosis of cells， and apoptotic rate of cells were calculated. Cell scratch test was used to detect the migration ability of cells and calculate the migration rate. Western blotting was used to detect the relative expression level of Bcl-2， Bax， Caspase-3 and Cleaved Caspase-3 in cells. RESULTS： The proliferation of SK-BR-3 cells were significantly inhibited by costunolide （P<0.05 or P<0.01）， and it shows a trend of concentration and time dependence. In the blank control group， cells possessed clear contour， regular shape and good adherence. Compared with blank control group， the number of cells were decreased significantly in 10， 20， 30 μmol/L costunolide groups， the cell structure was loose， the volume was reduced， and the gap became larger， and most of the cell contour disappeared and became round， the cell adherence was poor; cell migration rate and Bcl-2 protein relative expression level were decreased significantly， while apoptosis rate and the relative expression level of Bax， Caspase-3 and Cleaved Caspase-3 protein were significantly increased （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Costunolide can inhibit the proliferation and migration， and induce apoptosis of human breast cancer SK-BR-3 cells， mechanism of which? may be through up-regulating the expression of Bax， Caspase-3 and Cleaved Caspase-3 while down-regulating the expression of Bcl-2.

KEYWORDS? ?Costunolide; Human breast cancer SK-BR-3 cells; Proliferation; Migration; Apoptosis; Mechanism

乳腺癌是女性癌癥病死率最高的疾病，我國乳腺癌的發(fā)病率在女性惡性腫瘤中位列第1位[1-2]。引起乳腺癌的危險因素有很多，包括遺傳因素、激素水平異常、吸煙史和飲酒史[3]。乳腺癌的發(fā)病機制仍然是未知的，其治療一般采用化療、放療和生物免疫治療，但目前尚無明確的治療靶點[4]。此外，目前使用的治療方案也存在著許多副作用[3]。因此，近年來學(xué)者們致力于發(fā)現(xiàn)具有治療乳腺癌潛力的新靶點藥物。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，從中藥中分離提取的天然產(chǎn)物可作為抗癌新藥的重要來源，目前已有大量植物化學(xué)成分被成功地用于治療各種癌癥和其他疾病[5-7]。

木香烴內(nèi)酯是從傳統(tǒng)中藥木香中提取的一種倍半萜內(nèi)酯，研究發(fā)現(xiàn)，其具有抗炎、抗真菌、抗癌等多種生物活性[8]。另有相關(guān)研究報道證實，木香烴內(nèi)酯可通過融合基因介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子5（Bcr/Abl-Stat5）途徑促進伊馬替尼誘導(dǎo)的慢性髓性白血病細胞凋亡[9];其可通過調(diào)節(jié)核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB）信號通路誘導(dǎo)肝癌HepG2細胞的凋亡[10];此外，其也被證明可以抑制人肺鱗癌SK-MES-1細胞的細胞周期進程[11]。但目前木香烴內(nèi)酯是否對乳腺癌細胞具有抗癌活性尚不清楚，基于此，筆者采用CCK-8法檢測木香烴內(nèi)酯對人乳腺癌SK-BR-3細胞增殖的影響，采用細胞劃痕試驗檢測其對該細胞遷移能力的影響，采用Hoechst 33258熒光染色法觀察其對該細胞凋亡的影響，采用Western blotting法檢測其對該細胞中B淋巴細胞瘤因子2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3）和分裂型Caspase-3（Cleaved Caspase-3）蛋白表達的影響，以期研究木香烴內(nèi)酯對SK-BR-3細胞增殖、遷移、凋亡的影響及其作用機制，為治療乳腺癌的新藥開發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Allegra -64R型臺式高速冷凍離心機（美國Beckman公司）;ELx800型酶標儀（美國Bio-Tek公司）;MCO-15AC型細胞培養(yǎng)箱（日本Sanyo公司）;ChemiDoc Touch型化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）;DMi8A型熒光倒置顯微成像系統(tǒng)（德國Leica公司）;JA2003J型電子分析天平（寧波凱諾儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

木香烴內(nèi)酯（成都曼思特生物科技有限公司，批號：A0302，純度：≥99%）;DMEM高糖培養(yǎng)基（批號：C11995500BT）、胰酶（批號：25200-056）、胎牛血清（批號：A3160802）、青霉素-鏈霉素溶液（批號：15140-122）均購自美國Gibco公司;CCK-8試劑盒（美國APExBIO公司，批號：K1018）;二甲基亞砜（DMSO，美國Sigma公司，批號：D2650）;Hoechst 33258染色液（批號：C0021）、4%多聚甲醛（批號：P1110）均購自北京索萊寶科技有限公司;蛋白酶抑制劑（PMSF，批號：ST506）、磷酸酶抑制劑（批號：P1051）、RIPA細胞裂解液（批號：P0013K）、BCA蛋白定量試劑盒（批號：P0012）均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;彩色預(yù)染蛋白Marker（批號：P9001）、ECL化學(xué)發(fā)光顯色液（批號：P10100）均購自蘇州新賽美生物科技有限公司;兔抗 Caspase-3一抗（批號：380189）、兔抗Cleaved Caspase-3一抗（批號：341052）、兔抗Bax一抗（批號：612259）、兔抗Bcl-2一抗（批號：310004）及兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）一抗（批號：384404）均購自成都正能生物技術(shù)有限責任公司;辣根過氧化物酶（HRP ）標記山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（英國Abcam公司，批號：ab6789）;其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 細胞

人乳腺癌 SK-BR-3細胞系（編號：20161202-04）購自上海中喬新舟生物技術(shù)有限公司，課題組前期對該細胞系抽提的DNA進行STR位點及性別基因Amelogenin檢查，結(jié)果顯示完全匹配，可進行后續(xù)研究。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

將凍存的SK-BR-3細胞接種于含12%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 μg/mL鏈霉素的 DMEM高糖培養(yǎng)基（即完全培養(yǎng)基）中，置于37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（培養(yǎng)條件下同），每2～3 d更換培養(yǎng)液 1 次，待細胞長滿培養(yǎng)瓶底部80%～90%時進行傳代，取對數(shù)生長期細胞進行相關(guān)試驗。

2.2 木香烴內(nèi)酯對SK-BR-3細胞增殖的影響考察

取對數(shù)生長期的SK-BR-3細胞，加入完全培養(yǎng)基制成細胞懸液，按 5×103個/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL。將細胞在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，分為空白對照組（含細胞但不含藥物）和木香烴內(nèi)酯10、20、30、40、50 μmol/L濃度組（濃度設(shè)置參考相關(guān)文獻[12-14]）?？瞻讓φ战M加入完全培養(yǎng)基100 μL，木香烴內(nèi)酯給藥組分別加入終濃度為 10、20、30、40、50 μmol/L的木香烴內(nèi)酯培養(yǎng)液，每孔總體積為200 μL，每組設(shè) 5 個復(fù)孔。藥物分別作用24、48、72 h后，每孔加 10 μL CCK-8 溶液，繼續(xù)孵育 4 h后，采用酶標儀于450 nm 波長下測定各孔吸光度（OD）值，計算細胞增殖抑制率[細胞增殖抑制率（%）=（空白對照組OD值-試驗組OD值）/空白對照組OD值×100%]。

2.3 木香烴內(nèi)酯對SK-BR-3細胞凋亡的影響考察

取對數(shù)生長期的SK-BR-3細胞，以1×104個/孔的密度接種于12孔板中，每孔加入1 mL完全培養(yǎng)基，于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)基，將細胞分為空白對照組和木香烴內(nèi)酯10、20、30 μmol/L濃度組[前期試驗發(fā)現(xiàn)木香烴內(nèi)酯高濃度下（40～50 μmol/L）細胞大量死亡漂浮，貼壁細胞較少，故選擇10、20、30 μmol/L進行試驗]?？瞻讓φ战M加入完全培養(yǎng)基1 mL，試驗組分別加入終濃度為10、20、30 μmol/L的木香烴內(nèi)酯培養(yǎng)液，每組設(shè)5個復(fù)孔，然后培養(yǎng)48 h后，棄去培養(yǎng)基，于4 ℃下用4%多聚甲醛溶液固定30 min;用PBS洗滌細胞2次，每次3～5 min;加入500 μL Hoechst 33258染色液，室溫避光染色10 min，吸除染色液，用PBS洗滌2次，每次3～5 min;然后置于倒置熒光顯微鏡下觀察，每孔隨機選擇5個視野拍照。鏡下可見，凋亡細胞的熒光強度比正常細胞要高，且細胞核會出現(xiàn)致密的濃染或呈碎塊狀致密濃染。利用圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0計數(shù)凋亡細胞數(shù)和細胞總數(shù)，并計算細胞凋亡率[細胞凋亡率（%）=凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%]。

2.4 木香烴內(nèi)酯對SK-BR-3細胞遷移的影響考察

取對數(shù)生長期的SK-BR-3細胞，以5×105個/孔的密度接種于6孔板中，每孔加入2 mL完全培養(yǎng)基，于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞完全鋪滿，然后用200 μL移液槍槍頭在單層細胞上作“一”字劃痕。隨后用PBS洗滌2次，對漂浮細胞和損傷細胞進行清洗和去除，之后將細胞分為空白對照組和木香烴內(nèi)酯10、20、30 μmol/L濃度組?？瞻讓φ战M加入無血清培養(yǎng)液2 mL，木香烴內(nèi)酯給藥組分別加入終濃度為 10、20、30 μmol/L的木香烴內(nèi)酯培養(yǎng)液，每組設(shè)3個復(fù)孔。細胞在培養(yǎng)0、24、48 h后用倒置顯微鏡觀察其愈合情況并拍照。利用Image J V1.8.0軟件分析并計算細胞的遷移率[細胞遷移率（%）=（0 h劃痕面積-培養(yǎng)后劃痕面積）/0 h劃痕面積×100%]。

2.5 木香烴內(nèi)酯對SK-BR-3細胞中Bcl-2、Bax、Caspase-3、Cleaved Caspase-3蛋白表達的影響考察

采用Western blotting法進行檢測。取對數(shù)生長期的SK-BR-3細胞，以 1×107個/瓶的密度接種于細胞培養(yǎng)瓶中，待細胞貼壁后，將細胞分為空白對照組和木香烴內(nèi)酯10、20、30、40 μmol/L濃度組（增加40 μmol/L濃度組以反映凋亡相關(guān)蛋白表達水平的變化趨勢）?？瞻讓φ战M加入3 mL完全培養(yǎng)基，試驗組分別加入終濃度為 10、20、30、40 μmol/L的木香烴內(nèi)酯培養(yǎng)液，每組設(shè)3個復(fù)瓶，分別培養(yǎng)48 h。收集各組細胞，加入預(yù)先配制的RIPA細胞裂解液（內(nèi)含1%的PMSF及1%磷酸酶抑制劑）100 μL，于冰上裂解30 min后，于4 ℃下以13 500? ? r/min離心10 min，提取總蛋白，用BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。取蛋白變性后，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）電泳，然后轉(zhuǎn)膜，以5%脫脂奶粉在4 ℃封閉12 h;TBST緩沖液清洗，然后加入兔抗Caspase-3、Bax、Bcl-2 、Cleaved Caspase-3、GAPDH一抗（1 ∶ 1 000），于4 ℃下孵育過夜;TBST 緩沖液清洗，加入HRP標記的羊抗兔IgG二抗（1 ∶ 2 000），室溫孵育 3 h;TBST 緩沖液清洗，用 ECL顯色劑顯色，利用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光并拍照。運用 Quantity One V4.6.6圖像分析軟件檢測條帶的灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，計算各目的蛋白相對表達水平。

2.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用 GraphPad Prism 6.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以x±s表示，組間比較采用t檢驗。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 木香烴內(nèi)酯對SK-BR-3細胞增殖的影響

與空白對照組比較，木香烴內(nèi)酯作用24、48、72 h時，各藥物濃度組細胞的增殖抑制率均顯著升高（P<0.05或P<0.01），且呈明顯的濃度和時間依賴趨勢。木香烴內(nèi)酯在10、20、30 μmol/L濃度下作用48 h后，表現(xiàn)出較為明顯的細胞增殖抑制作用，故選擇10、20、30? ? ? ?μmol/L作用48 h進行后續(xù)試驗。各組細胞增殖抑制率測定結(jié)果見表1。

3.2 木香烴內(nèi)酯對SK-BR-3細胞凋亡的影響

空白對照組細胞輪廓清晰、形態(tài)規(guī)則、細胞質(zhì)飽滿、貼壁較好。與空白對照組比較，木香烴內(nèi)酯10、20、30? ?μmol/L濃度組細胞數(shù)量明顯減少、結(jié)構(gòu)松散、體積縮小、間隙變大，且多數(shù)細胞輪廓消失、皺縮變圓，貼壁不良;隨木香烴內(nèi)酯濃度的增加，細胞凋亡率顯著升高（P<0.05或P<0.01）。各組細胞形態(tài)學(xué)顯微圖見圖1，細胞凋亡率測定結(jié)果見圖2。

3.3 木香烴內(nèi)酯對SK-BR-3細胞遷移的影響

與空白對照組比較，木香烴內(nèi)酯10、20、30 μmol/L濃度組細胞遷移率顯著降低（P<0.05或P<0.01），且呈現(xiàn)濃度和時間依賴趨勢。各組細胞遷移情況顯微圖見圖3，細胞遷移率測定結(jié)果見圖4。

3.4 木香烴內(nèi)酯對SK-BR-3細胞中凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

與空白對照組比較，木香烴內(nèi)酯10、20、30、40 μmol/L濃度組細胞中Caspase-3、Bax及Cleaved Caspase-3蛋白的相對表達水平均顯著升高，Bcl-2蛋白的相對表達水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。各組細胞中凋亡相關(guān)蛋白表達電泳圖見圖5，蛋白相對表達水平測定結(jié)果見圖6。

4 討論

木香烴內(nèi)酯是一種含有α-亞甲基-γ-內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)的倍半萜內(nèi)酯，該結(jié)構(gòu)能與含有巰基的酶及其功能性蛋白酶發(fā)生反應(yīng)，進而干擾細胞的代謝過程，從而發(fā)揮多種藥理活性[15-16]。據(jù)報道，木香烴內(nèi)酯在10～50 μmol/L濃度范圍內(nèi)對多種腫瘤細胞的增殖有較強的抑制作用[12-14]。因此，在本研究中，選擇終濃度為10、20、30、40、50 μmol/L的木香烴內(nèi)酯進行細胞增殖試驗，考察其對人乳腺癌SK-BR-3細胞的增殖抑制作用。結(jié)果顯示，木香烴內(nèi)酯對SK-BR-3細胞具有明顯的增殖抑制作用，且呈濃度和時間依賴趨勢。此外，利用細胞劃痕試驗分析木香烴內(nèi)酯對SK-BR-3細胞遷移能力的影響，結(jié)果顯示，木香烴內(nèi)酯能有效抑制細胞遷移，并亦呈濃度和時間依賴趨勢。

致癌作用在人體內(nèi)的過程比較復(fù)雜，目前認為可能是通過癌基因和轉(zhuǎn)錄活性的改變影響細胞增殖和細胞凋亡[17]。在許多腫瘤疾病中，細胞增殖和細胞凋亡之間的平衡變化發(fā)揮著重要的作用[18]。細胞死亡包括自噬、凋亡和壞死3種類型[19]。其中，細胞凋亡在生物體的進化、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定以及多個系統(tǒng)的發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用，尤其在癌癥的發(fā)展上[20-21]。因此，誘導(dǎo)細胞凋亡也成為了許多抗癌治療的共同目標[22]。據(jù)研究報道，木香烴內(nèi)酯可誘導(dǎo)多種腫瘤細胞凋亡[23]。本研究采用Hoechst 33258染色法觀察細胞凋亡并計算凋亡率，結(jié)果顯示，不同濃度木香烴內(nèi)酯作用后，細胞均出現(xiàn)明顯的核固縮及碎裂等凋亡現(xiàn)象，且隨著木香烴內(nèi)酯濃度的增加，細胞的凋亡率顯著升高，提示木香烴內(nèi)酯可誘導(dǎo)SK-BR-3細胞凋亡。

目前，臨床上大多數(shù)常用抗癌藥物的主要抗癌機制為激活凋亡途徑以殺死癌細胞[24]。研究表明，細胞凋亡是通過哺乳動物細胞的內(nèi)源或外源性凋亡途徑發(fā)生的[25]，其中，線粒體途徑在內(nèi)源性凋亡過程中起著重要作用，被認為與癌細胞凋亡有關(guān)[26]。其中，線粒體凋亡途徑受Bcl-2家族蛋白控制，該家族蛋白包括抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax，兩者分別具有抑制或促進細胞凋亡的作用[27];此外，這些蛋白也是線粒體凋亡途徑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，通過調(diào)節(jié)線粒體膜通透性以控制線粒體凋亡[28]。Caspase家族蛋白在誘導(dǎo)細胞凋亡中也起著關(guān)鍵作用，并參與細胞凋亡的最終途徑，其中Caspase-3是細胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶，當其被激活時，可促進Caspase-3的剪切，進而觸發(fā)下游細胞凋亡的級聯(lián)反應(yīng)，誘發(fā)細胞凋亡[29]。因此，本研究檢測了木香烴內(nèi)酯對SK-BR-3細胞凋亡途徑關(guān)鍵調(diào)控因子Bax、Bcl-2、Caspase-3及Cleaved Caspase-3表達的影響，結(jié)果顯示，木香烴內(nèi)酯可上調(diào)Bax、Caspase-3和Cleaved Caspase-3的表達，下調(diào)Bcl-2的表達。

綜上所述，木香烴內(nèi)酯能抑制SK-BR-3細胞的增殖和遷移，誘導(dǎo)其凋亡，且這種作用隨著木香烴內(nèi)酯濃度的增加而增強;其機制與上調(diào)Bax、Caspase-3和Cleaved Caspase-3的表達，下調(diào)Bcl-2的表達有關(guān)。在后續(xù)研究中，可對木香烴內(nèi)酯的藥理作用及分子機制進行深入挖掘，以期為其臨床應(yīng)用提供參考。

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（收稿日期：2020-03-14 修回日期：2020-04-05）

（編輯：唐曉蓮）