譚崢嶸， 豐大利， 張 清

宜昌市第二人民醫(yī)院， 三峽大學(xué)第二人民醫(yī)院 a.消化內(nèi)科； b.腫瘤科， 湖北 宜昌 443000

膽管癌(cholangiocarcinoma，CCA)是源于肝外膽管包括肝門區(qū)至膽總管下端的膽管的惡性腫瘤，預(yù)后較差[1]。近年來(lái)CCA的發(fā)病率和死亡率顯著增加。其病因尚不清楚，可能與遺傳、膽管結(jié)石、寄生蟲(chóng)和膽管囊性擴(kuò)張癥等有關(guān)。由于大多數(shù)CCA患者臨床早期無(wú)明顯癥狀，因此很難進(jìn)行早期診斷和早期治療。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)是指長(zhǎng)度>200個(gè)核苷酸的轉(zhuǎn)錄本，雖然這些分子的功能正逐漸被破譯，但因?yàn)槠洳痪幋a蛋白，曾被認(rèn)為是“垃圾基因”或“轉(zhuǎn)錄噪音”[2-3]?；蜷g長(zhǎng)鏈非編碼RNA(intergenic long non-coding RNA，lincRNA)是最大類的LncRNA分子[4-5]。許多研究報(bào)道lincRNA具有抑制腫瘤或促進(jìn)腫瘤的作用[6]。在本研究中，通過(guò)整合分析公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因芯片測(cè)序數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)，鑒定CCA中與預(yù)后相關(guān)的關(guān)鍵lincRNA，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，為CCA的防治研究提供有價(jià)值的線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 高通量表達(dá)數(shù)據(jù) CCA表達(dá)量和臨床數(shù)據(jù)獲取自人類癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas，TCGA)(http：//www.tcga.org)，包含36例腫瘤樣本和9例正常樣本。數(shù)據(jù)集GSE107943獲取自高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)(gene expression omnibus，GEO)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/)[7]，包含30例腫瘤樣本和27例正常樣本。所有腫瘤樣品均為人源，均為實(shí)體瘤樣品。

1.1.2 組織樣本收集 臨床組織樣本來(lái)源于2018年-2019年在宜昌市第二人民醫(yī)院確診為CCA的5例患者，術(shù)中分別取癌組織和癌旁組織。入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有患者經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢查和影像學(xué)檢查明確診斷確診為CCA；(2)術(shù)前未進(jìn)行化療或放療；(3)臨床資料完整。樣本收集后用RNA保護(hù)液儲(chǔ)存后放入-80 ℃冰箱。本研究經(jīng)宜昌市第二人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過(guò)(批號(hào)：S2019-026)，所有患者知情同意。

1.1.3 試劑 提取RNA采用Trizol試劑，cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀選用Applied Biosystems 7300。

1.2 方法

1.2.1 差異表達(dá)lincRNA的篩選 用R軟件進(jìn)行差異性基因分析，并進(jìn)行Mann-WhitneyU檢驗(yàn)以確定腫瘤組織和正常樣品之間顯著差異性表達(dá)的lincRNA。腫瘤組織表達(dá)量比正常組織表達(dá)量的差異倍數(shù)大于2倍，校正P< 0.05 視為顯著失調(diào)lincRNA，使用雙側(cè)非配對(duì)t檢驗(yàn)來(lái)檢測(cè)表達(dá)差異的顯著性。韋恩圖使用Venny 2.1(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)進(jìn)行分析制作。

1.2.2 lincRNA的診斷和預(yù)后分析 本研究使用Graphpad prism 8對(duì)lincRNA的表達(dá)進(jìn)行了受試者工作特征曲線(ROC曲線)分析，ROC曲線下面積(AUC)>0.8，P<0.05時(shí)，基因表達(dá)對(duì)CCA有診斷意義。使用Graphpad prism 8對(duì)lincRNA RP11-488L18.10的表達(dá)進(jìn)行了Kaplan-Meier生存曲線分析，P<0.05表示對(duì)預(yù)后有意義。

1.2.3 基因富集分析 基因富集分析用來(lái)挖掘在CCA組織中l(wèi)incRNA RP11-488L18.10 顯著富集分通路[8]?；蚺判驑?biāo)準(zhǔn)選項(xiàng)選擇Pearson分析，置換次數(shù)選擇2000。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR Trizol法提取組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)癌組織和癌旁組織中l(wèi)incRNA RP11-488L18.10和MCM2的表達(dá)。lincRNA RP11-488L18.10引物序列，上游5’- CCAAGACCCAAGGACAGCT-3’，下游5’- GAAGGATGGACAGGAGATG-3’； MCM2引物序列，上游5’- ATGGCGGAATCATCGGAATCC-3’，下游5’- GGTGAGGGCATCAGTACGC-3’；內(nèi)參GAPDH引物序列，上游5’-GACTCATGACCACAGTCCATGC -3’，下游5’-AGAGGCAGGGATGATGTTCTG -3’。結(jié)果采用 Applied Biosystems 7300系統(tǒng)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 表達(dá)差異lincRNA的篩選 分別在TCGA和GSE107943篩選表達(dá)差異lincRNA，然后將兩個(gè)數(shù)據(jù)集上調(diào)和下調(diào)lincRNA分別取交集，分別得到451個(gè)同時(shí)在TCGA和GSE107943上調(diào)的lincRNA和154個(gè)同時(shí)在TCGA和GSE107943下調(diào)的lincRNA(圖1a)。接著對(duì)這些失調(diào)基因進(jìn)行生存曲線分析，發(fā)現(xiàn)8個(gè)lincRNA對(duì)預(yù)后影響顯著。對(duì)這8個(gè)lincRNA在腫瘤組織中的表達(dá)豐度進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)lincRNA RP11-488L18.10在TCGA和GSE107943腫瘤組織中豐度相對(duì)都較高(圖1b)。

注：a，TCGA和GSE107943數(shù)據(jù)集中上調(diào)和下調(diào)lincRNA的交集；b，8個(gè)lincRNA在腫瘤組織中的表達(dá)豐度。

圖1表達(dá)差異lincRNA的篩選

2.2 lincRNA RP11-488L18.10對(duì)CCA的診斷意義 通過(guò)對(duì)TCGA和GSE107943進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，lincRNA RP11-488L18.10在這兩個(gè)數(shù)據(jù)集的CCA組織中顯著上調(diào)(圖2a、b)。利用TCGA和GSE107943數(shù)據(jù)集對(duì)lincRNA RP11-488L18.10的表達(dá)與CCA的關(guān)系進(jìn)行ROC曲線分析，結(jié)果顯示，TCGA中AUC=1，P<0.000 1；在GSE107943中AUC=0.946 9，P<0.000 1。這說(shuō)明lincRNA RP11-488L18.10的高表達(dá)可以預(yù)測(cè)CCA的發(fā)生(圖2c、d)。

2.3 lincRNA RP11-488L18.10表達(dá)對(duì)CCA患者的預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值 在TCGA中，lincRNA RP11-488L18.10的高表達(dá)可以顯著預(yù)測(cè)CCA患者的總生存率(P=0.016)(圖3a)和無(wú)復(fù)發(fā)生存率(P=0.017)(圖3b)；在GSE107943中，lincRNA RP11-488L18.10 的高表達(dá)可以顯著預(yù)測(cè)CCA患者的總生存率(P=0.023)(圖3c)和無(wú)復(fù)發(fā)生存率(P=0.005)(圖3d)。

注：a，TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中l(wèi)incRNA RP11-488L18.10的表達(dá)；b，GSE107943中l(wèi)incRNA RP11-488L18.10的表達(dá)；c，TCGA中ROC曲線分析；d，GSE107943中ROC曲線分析。

圖2lincRNARP11-488L18.10的表達(dá)水平及其對(duì)CCA的診斷意義

注：a，TCGA中l(wèi)incRNA RP11-488L18.10表達(dá)與CCA總生存率的關(guān)系；b，TCGA中l(wèi)incRNA RP11-488L18.10表達(dá)與CCA無(wú)復(fù)發(fā)生存率的關(guān)系；c，GSE107943中l(wèi)incRNA RP11-488L18.10表達(dá)與CCA總生存率的關(guān)系；d，GSE107943中l(wèi)incRNA RP11-488L18.10表達(dá)與CCA無(wú)復(fù)發(fā)生存率的關(guān)系。

圖3lincRNARP11-488L18.10表達(dá)對(duì)CCA的預(yù)后預(yù)測(cè)分析

2.4 lincRNA RP11-488L18.10的功能預(yù)測(cè) 在TCGA和 GSE107943兩個(gè)數(shù)據(jù)集中對(duì)lincRNA RP11-488L18.10進(jìn)行基因富集分析，結(jié)果顯示， lincRNA RP11-488L18.10的表達(dá)和DNA復(fù)制通路呈顯著正相關(guān)(P值分別為0.022、0.008)(圖4a、b)。分別對(duì)兩個(gè)數(shù)據(jù)集中的核心富集基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)這些基因的表達(dá)都與 lincRNARP11-488L18.10的表達(dá)呈顯著正相關(guān)，并且R值均大于0.3(圖4c、d)。微型染色體維持蛋白2(minichromosomemaintenance protein 2，MCM2)在兩個(gè)數(shù)據(jù)集中都顯示出了較高的相關(guān)性和富集度，所以選擇MCM2來(lái)進(jìn)一步分析。散點(diǎn)圖顯示兩個(gè)數(shù)據(jù)集中l(wèi)incRNA RP11-488L18.10 都與 MCM2呈顯著正相關(guān)(P值均<0.001)(圖4e、f)。

2.5 臨床樣本驗(yàn)證 取臨床樣本檢測(cè)癌旁組織中l(wèi)incRNA RP11-488L18.10的相對(duì)表達(dá)量為0.918±0.230，CCA組織為2.636±1.127，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.340，P=0.010)；癌旁組織MCM2的相對(duì)表達(dá)量為0.942±0.216，CCA組織為1.766±0.617，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.818，P=0.023)。

3 討論

在過(guò)去的幾十年中，CCA的發(fā)病率顯著增加。大多數(shù)患者早期沒(méi)有明顯的癥狀，其高危風(fēng)險(xiǎn)因素包括膽汁淤積和慢性炎癥環(huán)境。一般采用手術(shù)切除、全身化療和靶向放射等治療[9]。近年來(lái)，對(duì)CCA機(jī)制的研究越來(lái)越深入，但腫瘤發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素、多階段及多基因調(diào)控的過(guò)程，徹底了解遺傳因素在CCA中的作用和信號(hào)通路需要大樣本研究。轉(zhuǎn)錄組重建技術(shù)能夠快速方便地從RNA-seq數(shù)據(jù)中篩選差異性LncRNA[10-11]。測(cè)序深度和閱讀長(zhǎng)度的快速增加大大提高了轉(zhuǎn)錄物重建的準(zhǔn)確性。綜合生物信息學(xué)分析方法解決了單個(gè)隊(duì)列研究的局限性。

LncRNA影響包括致瘤過(guò)程在內(nèi)的各種生物過(guò)程，既往研究[12-14]已表明它們?cè)谏聿±怼⒛[瘤和胚胎發(fā)育中的重要性。LncRNA可以通過(guò)復(fù)雜的機(jī)制影響腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，包括表達(dá)水平失調(diào)和靶基因的調(diào)控，因此被認(rèn)為是潛在的預(yù)后標(biāo)志物[15]。例如，LncRNA TP73-AS1被發(fā)現(xiàn)充當(dāng)海綿miR-194的競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA，促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲[16]。據(jù)報(bào)道[17]，lincRNA 00961可作為神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后指標(biāo)和潛在的治療靶標(biāo)。LncRNA SNHG20被確定為骨肉瘤患者不良預(yù)后的獨(dú)立影響因素，可調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲[18]。關(guān)于LncRNA與CCA的預(yù)后及發(fā)展目前研究較少。研究[19]發(fā)現(xiàn)線粒體RNA加工內(nèi)切核糖核酸酶的LncRNA組分通過(guò)調(diào)節(jié)miR-217參與CCA的進(jìn)展。有研究[20]顯示，LncRNA EPIC1通過(guò)靶向調(diào)控Myc促進(jìn)CCA進(jìn)展。本研究首次報(bào)道了在TCGA和GSE107943兩個(gè)數(shù)據(jù)集中l(wèi)incRNA RP11-488L18.10在腫瘤組織中豐度相對(duì)較高。lincRNA RP11-488L18.10的高表達(dá)可以顯著預(yù)測(cè)CCA的發(fā)生和不良預(yù)后。lincRNA RP11-488L18.10與MCM2呈顯著正相關(guān)。

MCM在細(xì)胞周期中形成DNA復(fù)制前復(fù)合物，啟動(dòng)DNA復(fù)制，是所有真核細(xì)胞DNA復(fù)制所必須的。MCM家族蛋白中共6個(gè)成員，分別為MCM2-7，MCM2能更準(zhǔn)確地反映細(xì)胞增殖情況。MCM2只存在于細(xì)胞周期的細(xì)胞核中，在增殖細(xì)胞中表達(dá)水平高，在靜止期細(xì)胞或分化好的細(xì)胞中不表達(dá)或水平很低，提示MCM2可以作為增殖細(xì)胞的特異標(biāo)志[21]。有研究[21-22]顯示，在卵巢癌中MCM2的表達(dá)明顯高表達(dá)，且MCM2的表達(dá)水平與預(yù)后呈正相關(guān)。LncRNA的生物學(xué)功能主要表現(xiàn)在從表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控3個(gè)層面實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控。lincRNA RP11-488L18.10與MCM2的具體結(jié)合位點(diǎn)和功能學(xué)，需通過(guò)動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究首次報(bào)道了lincRNA RP11-488L18.10與CCA的發(fā)生及預(yù)后密切相關(guān)，提示lincRNA RP11-488L18.10具有成為CCA診斷標(biāo)志物的良好前景。