楊蘭艷，殷芳，王建剛，孔娜

作者單位：云南省第三人民醫(yī)院消化內(nèi)科，云南 昆明650000

食管癌是最常見的消化道惡性腫瘤，其預(yù)后不良，居全球癌癥相關(guān)死因第6位［1］。西方國家大多數(shù)食管癌病理類型為腺癌，而在我國則以鱗狀細(xì)胞癌居多。隨著以手術(shù)治療為主、化療和放療為輔的綜合治療措施的出現(xiàn)，食管癌病人的生存率有所提高，但其5年總生存率仍然較低［2］。腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（Tumor necrosis factor receptor associated factor 6，TRAF6）是一種新型天冬酰胺基內(nèi)肽酶蛋白酶，具有促進(jìn)蛋白質(zhì)穩(wěn)定的作用［3］，最近的研究表明TRAF6與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)［4-6］。然而國內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)TRAF6與食管鱗狀細(xì)胞癌（Esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）復(fù)發(fā)和生存的相關(guān)性研究。本研究通過檢測TRAF6在ESCC組織中的表達(dá)及其與生存和復(fù)發(fā)的相關(guān)性，以期為ESCC的治療和預(yù)后評估提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料選取2012年12月至2014年2月在云南省第三人民醫(yī)院接受根治性切除術(shù)治療的經(jīng)病理證實(shí)為ESCC的病人作為研究對象。共有478例ESCC病人納入本研究，年齡（59.3±7.6）歲，年齡范圍為44～75歲。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求，所有研究對象在參與本研究前均已簽署知情同意書。

1.2免疫組織化學(xué)及陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)采用10%甲醛對術(shù)中切除的新鮮的食管癌組織標(biāo)本進(jìn)行固定，并行常規(guī)石蠟包埋，將石蠟標(biāo)本切成4 μm連續(xù)切片，60℃烤片8 h備用。將切片脫蠟和水化。采用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗3次，每次3 min。蒸餾水浸泡后行抗原修復(fù)。采用PBS 100℃修復(fù)10 min。并自然冷卻至室溫。在PBS搖床上進(jìn)行2～3次沖洗，每次5 min。然后滴入過氧化氫酶阻斷溶液，室溫下孵育10 min；滴加生物素標(biāo)記二抗（羊抗兔IgG），室溫下孵育1 h；PBS沖洗3次，每次3 min；行DNA染色，蒸餾水沖洗后，使用蘇木素復(fù)染，酒精脫水，采用流水進(jìn)行緩慢沖洗反藍(lán)，空氣干燥，中性膠封片。

由2名高級職稱病理科醫(yī)師對免疫結(jié)果進(jìn)行判定［7］：在高倍鏡下，每張切片觀察15個(gè)視野。平均100個(gè)細(xì)胞中TRAF6陽性細(xì)胞的個(gè)數(shù)為陽性細(xì)胞率。細(xì)胞質(zhì)中觀察到棕黃色顆粒為陽性，陽性細(xì)胞染色程度評分標(biāo)準(zhǔn)為0分：陰性；1分：淡黃色；2分：黃色；3分：棕黃色。陽性細(xì)胞百分比評分標(biāo)準(zhǔn)：0分：＜1%；1分：1%～10%；2分：＞10%～30%；3分：＞30%～60%；4分：＞60%。最終得分為細(xì)胞質(zhì)陽性細(xì)胞染色程度評分與陽性細(xì)胞百分比評分之和。最終結(jié)果判定：0～2分：陰性，3～7分：陽性。

1.3隨訪采用電話隨訪和門診隨訪相結(jié)合的方式，病人出院后每3個(gè)月隨訪1次，了解病人術(shù)后復(fù)發(fā)和生存狀況等信息，隨訪截止日期為2019年5月。478例ESCC病人中，445例完成隨訪，失訪23例，隨訪率95.2%。中位隨訪時(shí)間為33個(gè)月（范圍為5～60個(gè)月）。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。連續(xù)資料用x±s表示。分類資料用例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。用Kaplan-Meier并Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行單因素生存分析，單因素分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量納入Cox多因素模型分析影響ESCC病人復(fù)發(fā)和死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1TRAF6表達(dá)與ESCC病人臨床病例特征的關(guān)系478例ESCC病人中，341例（71.3%）符合TRAF6表達(dá)陽性標(biāo)準(zhǔn)。TRAF6陽性表達(dá)癌組織細(xì)胞質(zhì)呈淡黃色、棕黃色或棕褐色，見圖1。TRAF6表達(dá)與性別、年齡、腫瘤大小無關(guān)（P＞0.05）。TRAF6表達(dá)與ESCC病人的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和死亡狀況顯著相關(guān)（P＜0.001）。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、較高臨床分期、發(fā)生復(fù)發(fā)或死亡的病人TRAF6陽性表達(dá)率高。見表1。

表1 腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌臨床病例特征的關(guān)系/例（%）

2.2ESCC病人單因素生存分析Kaplan-Meier并Log-rank檢驗(yàn)顯示，較高TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TRAF6陽性表達(dá)可增加ESCC病人復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)（P＜0.001）。較高TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、TRAF6陽性表達(dá)可增加ESCC病人死亡風(fēng)險(xiǎn)（P＜0.001）。結(jié)果見表2，圖2。

2.3ESCC病人多因素Cox回歸分析結(jié)果將Kaplan-Meier并Log-rank分析結(jié)果顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量納入Cox回歸模型，結(jié)果顯示：較高TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TRAF6陽性表達(dá)是ESCC病人復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.001）。較高TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、TRAF6陽性表達(dá)是ESCC病人死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.001）。見表3。

表2 食管鱗狀細(xì)胞癌445例單因素生存分析

表3 食管鱗狀細(xì)胞癌445例多因素生存分析

3 討論

近年來，雖然ESCC的治療技術(shù)取得了突破性的進(jìn)展，然而其總體生存率并沒有得到顯著改善。ESCC具有家族聚集性的臨床特征，表明遺傳易感性可能在食管癌發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用［8］。然而，由于腫瘤的異質(zhì)性，具有相似臨床特征的ESCC病人預(yù)后也可能不同。因此，鑒定新的敏感和特異性分子標(biāo)志物對于ESCC的早期診斷和治療非常重要。TRAF6是腫瘤壞死因子受體和白細(xì)胞介素-1受體/Toll樣受體超家族誘導(dǎo)信號的銜接因子，并在先天免疫反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用［9］。動物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TRAF6在ESCC細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，并可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長［10-11］。然而，TRAF6對ESCC病人復(fù)發(fā)和死亡影響的研究仍然有限。

本研究發(fā)現(xiàn)TRAF6陽性表達(dá)和ESCC病人的性別、年齡、腫瘤大小無關(guān)，但與ESCC病人的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和死亡狀況顯著相關(guān)。TRAF6陽性表達(dá)陽性病人復(fù)發(fā)和死亡的風(fēng)險(xiǎn)增加。這與先前關(guān)于TRAF6對其他腫瘤病人預(yù)后影響的研究一致：TRAF6高表達(dá)與胃癌、舌癌、卵巢癌等腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)［4-5，12］。表明TRAF6可能是ESCC復(fù)發(fā)和死亡的新型生物標(biāo)志物。TRAF6可以同時(shí)調(diào)控核因子-κB（NF-κB）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）兩條信號通路。通過調(diào)控食管癌組織中NF-κB、MAPK兩條信號通路的異常激活，NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的升高，可以增加食管癌化療的耐藥抵抗。MAPK家族主要包括細(xì)胞外信號調(diào)控激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、JNK/SAPK（c-Jun氨基末端激酶/應(yīng)激活化蛋白激酶）和p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）3個(gè)信號通路。ERK和p38 MAPK均在食管癌組織中存在高表達(dá)，并影響食管癌病人的預(yù)后［13］。JNK/SAPK磷酸化后可促進(jìn)食管癌組織中瘤體的生長和血管的形成，抑制JNK/SAPK的活性可抑制食管癌侵襲［14-15］。此外，抑制TRAF6的表達(dá)可顯著抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲，并促進(jìn)細(xì)胞周期的凋亡［13，16-18］。提示TRAF6可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的病理生理學(xué)作用。

綜上所述，TRAF6在ESCC癌組織中的表達(dá)參與ESCC的發(fā)生發(fā)展，TRAF6表達(dá)陽性病人復(fù)發(fā)和死亡的風(fēng)險(xiǎn)增加，TRAF6可作為ESCC潛在的治療靶點(diǎn)。

（本文圖1，2見封3）

圖1 食管鱗狀細(xì)胞癌病人癌組織中腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）表達(dá)（免疫組織化學(xué)染色×200）：A為陽性；B為陰性

圖2 腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌445例生存率的相關(guān)性：A為無瘤生存率；B為總體生存率