張丹，趙軍，孫鳳江，張娟美，季亞男

青光眼全球發(fā)病率約1%～2%[1]，視神經(jīng)損傷及特征性視野缺損為其主要特征。病理性高眼壓是青光眼危險要素之一，但單純控制眼壓并不能完全抑制視神經(jīng)損害的發(fā)展[2]。進行性視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞（retinal ganglion cells,RGCs）凋亡是視神經(jīng)損傷和視功能損害進展的主要因素，RGCs 是青光眼視神經(jīng)損害的核心[3-4]。因而，RGCs 保護是青光眼治療的重點。芍藥苷（paeoniflorin，PF）是從毛茛科植物芍藥/牡丹的根皮中提取的水溶性單萜苷，具有抗炎、抗氧化應激、免疫調節(jié)活性及神經(jīng)保護等作用[5-6]。本研究通過對慢性高眼壓大鼠模型進行腹腔注射芍藥苷的治療，初步討論芍藥苷對慢性高眼壓模型大鼠RGCs 凋亡的影響及作用機制，以期發(fā)現(xiàn)新的保護RGCs 的藥物，尋找減輕青光眼視神經(jīng)侵害新的作用靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

30 只SPF 級健康雄性SD 大鼠（7～8 周齡）由武漢華聯(lián)科生物技術有限公司實驗室提供，體質量180～210 g，許可批號：SYXK（鄂）2018-0104。所有大鼠均經(jīng)裂隙燈檢查及檢眼鏡檢查。按照國家科學技術部發(fā)布的《實驗動物管理條例》進行使用。

1.2 主要試劑及儀器

芍藥苷（上海源葉生物科技有限公司，純度＞98%，生產(chǎn)批號：L07M9Q60533）；0.5%鹽酸丙美卡因滴眼液（美國愛爾康公司）；左氧氟沙星眼膏（湖北遠大天天明制藥有限公司，生產(chǎn)批號：H20040234）；TONO-Pen AVIA 眼壓計（美國Medtronnic SALON 公司）；HE 染色試劑盒 （Bioswamp，批號：I17091）、TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒 （ROCHE，批號：11684817910）、HO-1 一抗（HO-1 Max VisionTM，抗體種屬：兔，Bioswamp,批號：PAB38338）；兔/鼠聚合物二抗免疫組化試劑盒 （邁新，批號：KIT-5020）、DAB 濃縮型試劑盒（Bioswamp，批號：W1762）。

1.3 方法

1.3.1 分組 按照隨機數(shù)字表法將30 只SD 大鼠隨機分為假手術組，高眼壓模型組及芍藥苷治療組，每組10 只，選取右眼為試驗眼。

1.3.2 建立慢性高眼壓模型采用標準鞏膜靜脈燒灼法[7]制造高眼壓大鼠模型。10%水合氯醛（0.3ml/100mg）腹腔內(nèi)注射麻醉，隨后丙美卡因點眼，1 次/5 min，共3 次。在角膜緣后1.5 mm 處連續(xù)剪開6：00～12：00位球結膜，分離結膜下筋膜及肌肉，暴露上直肌兩側及外直肌下方共3 條表淺鞏膜靜脈總支 （1 點位、8點位、10 點位），用臺式電凝筆止血器進行灼燒靜脈總支。燒灼處靜脈血流消失，近端靜脈充血怒張，遠端靜脈血流消失成一條白線標志燒灼成功。假手術組只剪開球結膜，不處理鞏膜靜脈。Tono-Pen AVIA眼壓計測量眼壓，單位為mmHg（1mmHg=0.133 kPa），術后眼壓大于術前眼壓的1.7 倍即視為造模成功。于造模前及造模后30 min、7 d、14 d 分別測量右眼眼壓。測量前10%水合氯醛麻醉，用眼壓計測量3次，取其平均值。術畢每日結膜囊內(nèi)涂左氧氟沙星眼膏。術后治療組大鼠進行腹腔注射芍藥苷（20 mg/kg），其余大鼠腹腔內(nèi)注射生理鹽水0.5 ml，每日1 次，連續(xù)2 周。

1.3.3 取材 末次注射后次日，過量麻醉處死，快速摘除右眼球，留取部分球后視神經(jīng)組織，4%多聚甲醛（4℃）中固定24 h，石蠟包埋備HE 染色、TUNEL及免疫組化用。

1.4 檢查指標

1.4.1 蘇木素-伊紅染色（HE 染色）組織切片脫臘至水化，進行HE 染色，蘇木精染液染核，雙蒸水終止染色，分化液分化，脫洗，0.5%伊紅染色2～3 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片。高倍鏡（×400）觀察各組大鼠視網(wǎng)膜的形態(tài)結構。每組隨機選取10 張切片，取50 μm 視野中的RGCs 區(qū)域，計算RGCs 層細胞數(shù)量。

表1 各組大鼠造模前后的眼壓比較（）

表1 各組大鼠造模前后的眼壓比較（）

注:* 與同組術前比較，P＜0.05；# 與同一時間段假手術組比較，P＜0.05

圖1 造模后兩周各組大鼠視網(wǎng)膜組織HE 染色（×400）。1A 假手術組大鼠視網(wǎng)膜構造規(guī)整，層次清晰，細胞整齊排列，單層視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞外形規(guī)則，內(nèi)、外核層排列整齊；1B 高眼壓模型組大鼠視網(wǎng)膜構造紊亂，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)目減少，排列錯亂，形狀不規(guī)則，可見部分細胞核裂解、變性，內(nèi)、外核層輕度水腫，排列疏松；1C 芍藥苷組大鼠視網(wǎng)膜各層構造尚規(guī)整，層次明晰，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞排列尚規(guī)整，形狀較規(guī)則，內(nèi)、外核層排列稍紊亂

圖2 造模后兩周各組大鼠視網(wǎng)膜組織TUNEL 染色（×400）。2A 假手術組；2B 高眼壓模型組，箭頭指凋亡細胞；2C 芍藥苷治療組。箭頭指凋亡細胞

1.4.2 TUNEL 檢測 組織切片常規(guī)脫臘至水化，常規(guī)進行TUNEL 染色,組織切片常規(guī)脫臘至水化，蛋白酶K 孵育15 min，TUNEL 反應混合液孵育60 min，PBS 沖洗3 次，DAB 孵育10 min，蘇木素復染。高倍顯微鏡下（×400）觀察并拍照，棕色細胞核為凋亡細胞,每張切片隨機選取3 個視野，分別計數(shù)每個視野中陽性著色細胞數(shù)，取平均值。

1.4.3 視網(wǎng)膜組織血紅素加氧酶-1 （Heme oxygenase-1，HO-1）免疫組化染色 組織切片常規(guī)脫臘至水化；0.05 mol/L 枸櫞酸鈉緩沖液（PH=6.0）微波修復抗原；自然冷卻后PBS 清洗3 次，3%H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶活性10min；10%山羊血清室溫封閉30 min；相繼加入一抗，4℃過夜；室溫復溫40 min；Maxvision 二抗37℃作用30 min；DAB 顯色，蘇木素復染。高倍顯微鏡下（×400）根據(jù)染色強度進行評定：淡黃色，即弱陽性；棕黃色，即陽性；棕褐色，即強陽性。應用image pro-plus 6.0 圖像系統(tǒng)進行圖像分析，以陽性染色細胞平均光密度值作為HO-1陽性表達水平。

1.5 統(tǒng)計學方法

運用SPSS 25.0 統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料采用均數(shù)±標準差（）描述，比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間的兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 眼壓測量

造模前，3 組眼壓比較無統(tǒng)計學意義 （F=1.191,P=0.319）；造模后30 min，模型組及芍藥苷組眼壓均較之前升高，造模成功（t模型組=-25.086，t芍藥苷組=-24.912,均P=0.000）；造模后1 周、2 周，高眼壓模型組與芍藥苷治療組眼壓均較假手術組升高（F1周=388.43，F(xiàn)2周=281.504，均P=0.000）；造模后，模型組與芍藥苷治療組眼壓無統(tǒng)計學意義（F=1.223，P=0.283）。

2.2 大鼠視網(wǎng)膜HE 染色

與假手術組（17.0±2.67）個/視野比較，模型組（8.5±2.07）個/視野及芍藥苷治療組（12.5±1.72）個/視野，RGCs 層細胞數(shù)量均減少（t模型組=7.965，t芍藥苷組=4.488，均P=0.000），但芍藥苷治療組RGCs 層細胞數(shù)量高于模型組，差異具有統(tǒng)計學意義（t=-4.407，P=0.000）（圖1）。

2.3 TUNEL 檢測大鼠RGCs 凋亡

假手術組大鼠視網(wǎng)膜RGCs 層未見細胞凋亡；模型組大鼠RGCs 層凋亡細胞增多，（12.1±1.52）個/視野，且內(nèi)、外核層也可見少量凋亡細胞；芍藥苷治療組大鼠RGCs 層TUNEL 陽性細胞少量表達，（5.3±1.7）個/視野，與模型組相比，具有統(tǒng)計學意義（t=9.410,P=0.000）（圖2）。

2.4 大鼠RGCs 中HO-1 的表達

HO-1 主要定位于細胞質中，散見于胞核中，陽性細胞呈片狀散布的棕褐色顆粒（圖3）。假手術組HO-1 蛋白平均光密度值為（0.45±0.13），高眼壓模型組HO-1 蛋白平均光密度值（0.5±0.3），芍藥苷治療組HO-1 蛋白平均光密度值（0.74±0.19）。3 組光密度值差異有統(tǒng)計學意義（F=6.657,P=0.004）。兩兩比較，模型組與假手術組比較無統(tǒng)計學意義（t=-1.05,P=0.31），但芍藥苷治療組則平均光密度值高于模型組（t=-2.306,P=0.017），有統(tǒng)計學意義。

3 討論

青光眼為全球第一大不可逆致盲性眼病[1]，尤其是亞洲后裔，并有一定的遺傳傾向。病理性高眼壓是青光眼危險因素之一，但單純降低眼壓并不能有效控制視神經(jīng)病變的進展。青光眼是一種視神經(jīng)變性類疾病，其發(fā)病核心是RGCs。RGCs 進行性凋亡是視神經(jīng)損傷的主要要素。因此，加強預防和治療視神經(jīng)損傷尤為重要。

圖3 造模后兩周各組大鼠視網(wǎng)膜組織HO-1 蛋白表達免疫組化（×400）。3A 假手術組HO-1 蛋白弱陽性表達；3B 高眼壓模型組HO-1 陽性表達增多，著色加深；3C 芍藥苷治療組HO-1 蛋白表達比模型組表達數(shù)量多，著色更深，強陽性表達進一步增多。HO-1：血紅素加氧酶-1

氧化應激在發(fā)展和加速青光眼視神經(jīng)損傷中起關鍵作用[8]。氧化應激反應升高，視網(wǎng)膜自由基增加，使線粒體功能異常，能量代謝異常，導致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的凋亡，同時自由基還可直接攻擊細胞的DNA，加快細胞凋亡[9]。在Liu Q 等[10]的實驗中，發(fā)現(xiàn)氧化應激狀態(tài)下HO-1 在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞中的表達增多。在高眼壓狀態(tài)下，大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)活性氧產(chǎn)生增多和脂質過氧化增加等[11]，為響應氧化損傷，機體會調動抗氧化系統(tǒng)。HO-1 是體內(nèi)分布最普遍的抗氧化酶之一，其一方面可阻止游離血紅素參與氧化反應，另一方面可通過其降解產(chǎn)物（膽紅素、CO、鐵離子）發(fā)揮抗氧化應激、抗炎、抑制凋亡和改善組織微循環(huán)的作用[12]。在本次實驗中，模型組HO-1 表達輕度上調主要是機體自身抗氧化系統(tǒng)激活的結果。HO-1相關通路的激活顯著降低慢性高眼壓大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的凋亡和損傷，從而起到保護作用[13-14]。

芍藥苷是從毛茛科植物芍藥或者牡丹的根皮中提取的一種水溶性單萜苷，主要應用于神經(jīng)系統(tǒng)或者神經(jīng)退行性疾病，近年其抗炎、抗氧化應激、免疫調節(jié)活性等作用受到越來越多的關注。芍藥苷能下調活性氧、NO、H2O2、Ca2+等物質，抑制氧化亢進，并能活化Nrf2 等抗氧化通路，上調Nrf2 等因子及其下游抗氧化酶（HO-1）的水平[15-16]，保護細胞免受氧化損傷。芍藥苷能降低大鼠血糖及抑制膠質細胞活化,上調視網(wǎng)膜GLAST、GS 表達，降低視網(wǎng)膜谷氨酸含量，對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜Müller 細胞具有保護作用[17]。另外，已有實驗證實芍藥苷在急性高眼壓模型中可通過抑制NLRP3 炎癥小體信號通路保護視網(wǎng)膜[18]。在本次實驗中，我們發(fā)現(xiàn)芍藥苷在慢性高眼壓大鼠模型中能夠通過上調HO-1 的表達減少視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的凋亡。

綜上所述，本次實驗初步證明在慢性高眼壓大鼠模型中，芍藥苷可抑制RGCs 的凋亡，其保護效應可能是通過上調HO-1 表達實現(xiàn)的。HO-1 相關通路的激活減輕RGCs 凋亡與損傷，將為青光眼發(fā)病機制—氧化應激學說提供支持證據(jù)，也確定了芍藥苷的視神經(jīng)作用機制。這將對于挽救視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的凋亡提供新的途徑和作用靶點。