周盛敏，姜元榮

豐益(上海)生物技術(shù)研發(fā)中心有限公司 (上海 200137)

中國居民營養(yǎng)與健康狀況調(diào)查顯示，與脂肪相關(guān)慢性病如超重、肥胖、高血壓、糖尿病等增長迅速，主要?dú)w結(jié)為脂類攝入過多或脂類代謝異常。膳食脂肪主要來源于食用油和食物，兩者約各占50%，可見食用油平衡膳食重要性。2016版《中國居民膳食指南》推薦每天烹調(diào)油攝入量25～30 g，少吃油，吃好油。于是功能性結(jié)構(gòu)油脂成為研究熱點(diǎn)，如中長鏈脂肪酸結(jié)構(gòu)脂作為一種低能量健康油脂逐漸引起人們的關(guān)注。

在我們之前的研究中，已經(jīng)評估了含有30%(w/w)中鏈脂肪酸的結(jié)構(gòu)脂在小鼠和大鼠中的安全性，90 d的喂養(yǎng)中，在胚胎毒性和致畸性研究中沒有觀察到劑量相關(guān)的副作用[1]。通過長鏈甘油三酯(LCT)和中鏈甘油三酯(MCT)的酯交換制備了不同中鏈脂肪酸含量(10%、20%、30%，w/w)的結(jié)構(gòu)脂。系統(tǒng)的開展了不同中鏈脂肪酸含量的結(jié)構(gòu)脂對C57BL / 6J小鼠相應(yīng)的體重變化，血清相關(guān)指標(biāo)變化，肝臟甘油三酯和肝臟脂質(zhì)代謝變化等。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

菜籽油，益海嘉里金龍魚糧油食品股份有限公司；中長鏈脂肪酸結(jié)構(gòu)脂，豐益研發(fā)中心提供；無脂飼料，開源動物飼料(常州)有限公司；RNA樣本保存液，英杰公司；甘油三酯和膽固醇試劑盒，上海申索福佑醫(yī)學(xué)診斷有限公司；肝素鈉、瓊脂糖，上海生物工程有限公司。

1.2 儀器和設(shè)備

Genome Sequencer FLX， 羅氏；GC-MS 6973N型，安捷倫；PCR-DGGE，伯樂；全波長多功能酶標(biāo)儀，賽默飛世爾；ABI 7900 HT熒光定量PCR，賽默飛世爾。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

SPF級雄性C57BL/6小鼠，七周齡，適應(yīng)喂養(yǎng)一周后根據(jù)體重隨機(jī)分為五組，每組12只，共計(jì)60只。實(shí)驗(yàn)分組如下：低脂組 (LFD)、菜籽油占比4.3%，高脂組(HFD)、菜籽油占比20wt%，低劑量組 (MLCT-L)、10wt%MCFA的MLCT占比20wt%，中劑量組 (MLCT-M)、20wt%MCFA的MLCT占比20wt%，高劑量組 (MLCT-H)、30wt%MCFA的MLCT占比20wt%。小鼠連續(xù)喂養(yǎng)6周，記錄小鼠每周的攝食量和體重。小鼠禁食16 h后，取血按照商業(yè)試劑盒的說明測定血清TC、TG、HDL-C、LDL-C含量[2]，屠宰小鼠、分別稱取內(nèi)臟脂肪如腎周脂肪、附睪脂肪重量及肝臟重量，并測定肝臟TG含量[2]，保留小鼠肝臟組織，液氮速凍后暫存于-80 ℃ 冰箱中備用。

稱取30 mg肝臟組織，加入TrizoL 700 μL，低溫均質(zhì)后加入氯仿200 μL，漩渦震蕩2 min后，在10 000 rpm轉(zhuǎn)速下冷凍離心15 min。取上清液后提取肝臟組織中的 mRNA(參照Qiagen Rneasy Mini Kit 試劑盒說明)。測定mRNA 的純度，然后統(tǒng)一反轉(zhuǎn)錄，采用 SYBR GREEN 染料法實(shí)時(shí)熒光定量 PCR，目的基因相對表達(dá)量采用2-ΔΔCt方法來計(jì)算[3]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)結(jié)果采用 SPSS 21.0和 OriginPro 7.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 中長鏈脂肪酸結(jié)構(gòu)脂預(yù)防高脂飲食引起的體重增加

經(jīng)過 6 周喂養(yǎng)，各組每周的食物攝入量沒有顯著性差異。說明中長鏈脂肪酸結(jié)構(gòu)脂對于小鼠日常飲食量并沒有影響，即MLCT并沒有通過影響攝食來減少能量攝入，緩解體重增加。但在體重增加方面 (圖 1)，與喂食低脂飼料組相比，由于HFD 組提高了脂肪攝入，導(dǎo)致了6周喂養(yǎng)后HFD 組體重增加明顯高于低脂組 (P< 0.05)。在20wt%及30wt%中鏈脂肪酸劑量MLCT干預(yù)下，體重增加相對于高脂飼料組分別減少了40.3%和42.3%，并且中劑量組和高劑量組與高脂飼料組相比有顯著性差異 (P< 0.05)，這可能與中鏈脂肪酸特殊代謝途徑有關(guān)[4]?？梢婋S著中鏈脂肪酸含量的增加，其體重的抑制效果越加明顯，這個結(jié)果也與一些文獻(xiàn)報(bào)道[5-7]的結(jié)論相一致。

圖1 MLCT對小鼠體重的重量分析

2.2 中長鏈脂肪酸結(jié)構(gòu)脂對血清生化指標(biāo)的影響

小鼠血清生化指標(biāo)變化如圖 2所示，當(dāng)小鼠攝入 MLCT 后，且隨著中鏈脂肪酸含量的提升，小鼠血清生化指標(biāo)改善程度越好。高脂飼料喂食組血清總甘油三脂含量顯著高于低脂飼料喂食組，添加中鏈脂肪酸能夠降低血清中總甘油三脂含量，在高劑量30wt%中鏈脂肪酸下達(dá)到顯著性水平(P< 0.05)。高脂飼料喂食組血清總膽固醇含量顯著高于低脂飼料喂食組，添加中鏈脂肪酸能夠降低高脂組血清中膽固醇含量。在10wt%、20wt%、30wt%中鏈脂肪酸劑量下，血清總膽固醇分別下降了31%、37.9%、51.7%，且三個劑量組均達(dá)到了顯著性水平。同樣地，低密度脂蛋白膽固醇變化趨勢與總膽固醇相似。當(dāng)中鏈脂肪酸含量達(dá)到20wt%和30wt%時(shí)，其高密度脂蛋白膽固醇水平顯著高于低脂組和高脂組(P< 0.05)?？偟膩碚f，高脂飼料喂食相對于低脂飼料喂食導(dǎo)致總甘油三酯和總膽固醇升高更為敏感，而且發(fā)現(xiàn)30wt%中鏈脂肪酸的MLCT可以有效改善小鼠的脂質(zhì)代謝過程。

圖2 MLCT對小鼠血清中總甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇的影響

2.3 MLCT 對內(nèi)臟脂肪和肝臟甘油三酯的影響

哺乳動物體內(nèi)脂肪組織主要有兩種類型，分為白色脂肪和棕色脂肪，白色脂肪主要以甘油三酯的形式儲存能量。圖 3a 和 3b是腎周脂肪和附睪脂肪等白色脂肪的變化結(jié)果，腎周脂肪和附睪脂肪等內(nèi)臟脂肪重量隨著小鼠攝入中鏈脂肪酸含量的增加，都逐漸下降，在30wt%中鏈脂肪酸劑量的MLCT干預(yù)下，腎周脂肪和附睪脂肪相對于高脂飼料組分別減少了48%和40.8%，并且達(dá)到了顯著性水平 (P< 0.05)，同時(shí)與低脂組相比沒有顯著性差異 (P> 0.05)。同樣的隨著中鏈脂肪酸攝入量的增加，在20wt%和30wt%中鏈脂肪酸劑量的MLCT干預(yù)下，肝臟甘油三酯相對于高脂飼料組分別減少了23.6%和31.8%，在中劑量和高劑量MLCT作用下，肝臟甘油三酯出現(xiàn)顯著降低(P< 0.05)，并且與低脂組相比沒有顯著性差異 (P> 0.05)。從上面結(jié)果可以看出，高劑量的 MLCT可以抑制白色脂肪如腎周脂肪和附睪脂肪累積以及降低肝臟甘油三酯含量。

2.4 MLCT 對小鼠肝組織脂代謝相關(guān)基因蛋白表達(dá)影響

上述實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著中鏈脂肪酸攝入量的增加，小鼠肝臟甘油三酯指標(biāo)明顯改善。肝臟是機(jī)體內(nèi)重要的甘油三酯代謝的器官，肥胖會導(dǎo)致肝組織脂肪堆積、脂肪變性進(jìn)而導(dǎo)致脂代謝的異常。肝臟內(nèi)甘油三酯的累積主要由以下幾個因素引起：一是脂肪酸攝入增加；二是極低密度脂蛋白分泌減少；三是脂肪酸從頭合成[8]；四是脂肪酸β-氧化減少[9]。為了進(jìn)一步探討MLCT對小鼠肝臟脂質(zhì)代謝變化的可能機(jī)制，采用實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測了脂代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平。脂肪酸 β-氧化通過過氧化物酶體增殖物激活受體α(Peroxisome prolif-erator-activated receptor α, PPARα) 促進(jìn)脂肪酸氧化限速酶肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶 (CAT) 的表達(dá)和脂酰輔酶 A (ACS) 合成酶的合成，加快脂肪酸氧化分解。如圖4所示，β-氧化相關(guān)基因包括過氧化物酶體增殖物激活受體α、中鏈?；o酶 A 脫氫酶 (Medium chain acyl-CoA dehydrogenase, MCAD)和長鏈酰基輔酶 A 脫氫酶 (Long chain acyl-CoA dehydrogenase, LCAD) ，顯示出不同的結(jié)果。與高脂組相比，低、中、高劑量MLCT組PPARα的mRNA 表達(dá)水平顯著性上調(diào)(P< 0.05)。另外，進(jìn)入線粒體脂酰輔酶A合成酶被中鏈酰基輔酶 A 脫氫酶 (Medium chain acyl-CoA dehydrogenase, MCAD)和長鏈?；o酶 A 脫氫酶 (Long chain acyl-CoA dehydrogenase, LCAD)脫氫[8]和β-氧化，在MCAD的mRNA 表達(dá)水平上，五個組均沒有顯著性差異(P> 0.05)。但在LCAD的mRNA 表達(dá)水平上，隨著中鏈脂肪酸攝入量的增加，低、中、高劑量組表達(dá)水平均顯著上調(diào)(P< 0.05)，這與Shinohara 等報(bào)道的結(jié)果相一致[3]。以上表明MLCT組小鼠體內(nèi)脂肪酸β-氧化降低了肝臟內(nèi)甘油三脂水平。

圖3 MLCT對小鼠腎周脂肪、附睪脂肪、肝臟甘油三酯的影響

圖4 MLCT對小鼠肝臟相關(guān)基因表達(dá)水平的影響

肝臟甘油三脂含量除了受脂肪酸β-氧化分解代謝外，還受肝臟內(nèi)脂肪酸合成影響。因此分析了控制脂肪酸合成的乙酰輔酶 A 羧化酶 1 (Acetyl CoA carboxylase 1, ACC1)，固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白 1c(Sterol regulatory element binding protein 1c, SREBP-1c)、蘋果酸酶 (Malic enzyme, ME)和脂肪酸合成酶 (Fatty acid synthetase, FAS)[10]。其中，乙酰輔酶 A 向丙二酰輔酶 A 的轉(zhuǎn)變離不開ACC1 酶催化[11]；FAS是多功能同二聚體蛋白，對肝臟中膳食攝入碳水化合物轉(zhuǎn)化為脂肪酸至關(guān)重要[12]。蘋果酸酯去羧基過程需要ME酶參與，從而釋放出丙酮酸和二氧化碳[13]。如圖 4所示，在10wt%、20wt%、30wt%中鏈脂肪酸干預(yù)下，ACC1、ME、SREBP-1c、FAS等四個基因表達(dá)明顯減弱，與高脂組相比，中劑量組和高劑量組明顯抑制脂肪酸再合成，達(dá)到了顯著性水平 (P< 0.05)，表明隨著中鏈脂肪酸攝入，肝臟內(nèi)脂肪酸合成相關(guān)酶表達(dá)受到抑制。綜上，小鼠攝入 MLCT可以抑制體內(nèi)脂肪酸合成，增加了肝臟內(nèi)的脂肪酸 β-氧化，這可以很好的解釋了前面肝臟甘油三酯含量的下降。

3 結(jié)論

本研究表明， 含有30%(w/w)中鏈脂肪酸的結(jié)構(gòu)脂可以有效減少脂肪累積，降低體重，改善小鼠的脂代謝和肝臟甘油三酯水平，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)其通過上調(diào)肝臟內(nèi)基因蛋白過氧化物酶體增殖物激活受體α和長鏈?；o酶 A 脫氫酶表達(dá)提升脂肪酸β-氧化，且下調(diào)脂肪酸合成酶、乙酰輔酶A羧化酶1、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c和蘋果酸酶表達(dá)抑制脂肪酸合成?？梢酝茰y中長鏈脂肪酸結(jié)構(gòu)脂是通過調(diào)控脂代謝相關(guān)基因蛋白表達(dá)并伴隨著中鏈脂肪酸特殊代謝途徑等共同作用達(dá)到防治肥胖目的。