孫 露，單瀟瀟，蔣建蘭*，張桂山

1天津大學化工學院 系統(tǒng)生物工程教育部重點實驗室，天津 300350；2中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所 農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)微生物資源收集與保藏重點實驗室，北京100081

水稻是當今世界最重要的糧食作物之一[1,2]，而稻瘟病是對水稻危害最嚴重的真菌病害之一[3]。近年來，利用細菌拮抗植物病原真菌以防治植物病害的生物防治手段正逐步受到人們的關注[4-6]，研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌能夠產(chǎn)生多種防治動植物病原體的代謝產(chǎn)物[7,8]，具有豐富的醫(yī)學應用價值。據(jù)報道，特基拉芽胞桿菌具有抗菌、促生等作用[9,10]，可用于抗菌藥物，而針對細菌中抗菌活性物質(zhì)的發(fā)酵優(yōu)化也已成為研究熱點[11-13]。

目前細菌發(fā)酵條件的優(yōu)化多采用單因素試驗結合正交設計[14]或響應面設計[15]。相對于正交設計，響應面設計考慮了隨機誤差，能夠對各個水平進行分析，得到一定試驗范圍內(nèi)的最優(yōu)方案，具有操作簡潔、模型選擇性廣、預測精度較高的特點。綜合文獻報道，選取在單因素試驗基礎上，利用響應面設計中的多因素顯著性篩選試驗(Plackett-Burman design，PBD)篩選出對抑菌活性有顯著影響的3個因素，再運用中心復合設計(central composite design，CCD)進行試驗，確定重要因素的最優(yōu)條件。

本研究以不同的芽孢桿菌為來源菌、不同的植物病原真菌為靶標菌進行牛津杯法抑菌試驗，篩選出對稻瘟病菌的生長有良好抑制效果的特基拉芽孢桿菌(Bacillustequilensis)WRN032菌株，然后對該菌株的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，以期得到最佳優(yōu)化條件。

1 儀器與試劑

1.1 供試菌株

10種芽孢桿菌(見表1)由中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所分離保存，10種真菌(見表1)由中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心(Agricultural Culture Collection of China，ACCC)進行保藏。

1.2 試劑

Landy培養(yǎng)基(用于芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng))：MgSO4·7H2O 0.500 g/L、KH2PO41.000 g/L、KCl 0.200 g/L、MnSO4·H2O 0.010 g/L、FeSO4·7H2O 0.005 g/L、CuSO4·5H2O 0.002 g/L、yeast extract 1.000 g/L、L-phenylalanine 0.020 g/L、L-glutamic acid 5.000 g/L、(NH4)2SO42.000 g/L、檸檬酸鈉0.010 g/L、蒸餾水950 mL、1%葡萄糖溶液50 mL。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar，PDA)用于稻瘟病菌的培養(yǎng)，購自Coolaber公司； 二甲基亞砜(DMSO AR)、乙酸乙酯(AR)、石油醚(AR)和正丁醇(AR)購自天津市江天化工技術有限公司。

1.3 儀器

UV6000紫外可見分光光度計(上海元析儀器有限公司)；ZWY-211B臥式恒溫搖床(上海智城有限責任公司)；ME204、ME802電子分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；MJB1-B001-Q3滅菌器(無錫益騰壓力容器有限公司)；LRH-70恒溫生化培養(yǎng)箱、DZF-6050真空干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)；SW-CJ-2FD潔凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)；N-1100旋轉蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司)；3K15臺式冷凍離心機(SIGMA公司)。

2 方法

2.1 菌株篩選

2.1.1 菌種活化

芽孢桿菌活化：取保存于-80 ℃冰箱甘油保藏管中的10種芽孢桿菌(見表1)菌液，分別劃線純化后于37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

真菌活化：將保存于斜面培養(yǎng)基的10種真菌(見表1)接于PDA上，30 ℃恒溫培養(yǎng)。

表1 菌株名稱和編號Table 1 Name and number of the strain

2.1.2 種子液制備

用250 mL錐形瓶裝入95 mL的Landy培養(yǎng)基，滅菌，加入1%的葡萄糖溶液5 mL，然后分別加入一環(huán)活化后的芽孢桿菌菌株，于37 ℃、180 rpm條件下培養(yǎng)18 h，即得種子液。

2.1.3 搖瓶發(fā)酵

用250 mL錐形瓶裝入95 mL、初始pH為5.5的Landy培養(yǎng)基，滅菌，加入1%的葡萄糖溶液5 mL，然后分別加入1 mL芽孢桿菌菌株的種子液，于37 ℃、180 rpm條件下培養(yǎng)24 h，即得發(fā)酵液。

2.1.4 樣品前處理

取不同芽孢桿菌發(fā)酵液各1 L，依次用等體積的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇按照極性從小到大的順序對發(fā)酵液進行萃取，每種有機溶劑均萃取三次，合并同種萃取液后得到石油醚萃取液、乙酸乙酯萃取液和正丁醇萃取液。

將不同芽孢桿菌發(fā)酵液的有機溶劑萃取液分別使用旋轉蒸發(fā)儀進行減壓濃縮，然后利用真空干燥箱進行干燥，最終得到30種干燥物，置于棕色瓶中，于4 ℃冰箱中密封避光保存。

2.1.5 牛津杯法抑菌試驗

取等量30種干燥物分別溶于DMSO，加入蒸餾水稀釋至藥液濃度1 mg/mL。在PDA平面上均勻擺放三個牛津杯，進行三組試驗，每組試驗平行三次。試驗組：向牛津杯中滴加100 μL 1 mg/mL藥液；空白對照：滴加等體積DMSO溶液；陰性對照：滴加等體積蒸餾水。在PDA中央位置接種真菌，30 ℃恒溫培養(yǎng)7～15天，觀察并篩選出對一種或多種真菌具有抑菌效果的干燥物，測定其抑菌圈直徑。試驗篩選得到特基拉芽孢桿菌WRN032發(fā)酵液的乙酸乙酯萃取干燥物對稻瘟病菌的抑菌效果最好(見圖1)，該菌株從香菇菌糠中培養(yǎng)分離獲得，菌種保藏編號為CGMCC 14405，用特基拉芽孢桿菌WRN032進行后續(xù)試驗。

圖1 特基拉芽孢桿菌WRN032對稻瘟病菌的抑菌效果及空白對照Fig.1 Bacteriostatic effect of B.tequilensis WRN032 on M.oryzae and blank control

2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化

2.2.1 單因素試驗

參考相關文獻與研究經(jīng)驗，在Landy培養(yǎng)基成分固定前提下，測定275 nm波長處的吸光度OD及抑菌圈直徑d為考察指標，采用控制變量法分別考察初始pH(A)、接種量(B)、搖床轉速(C)、培養(yǎng)溫度(D)、培養(yǎng)時間(E)、葡萄糖濃度(F)和搖瓶裝液量(G)對特基拉芽孢桿菌WRN032發(fā)酵的影響，試驗因素和水平見表2。

2.2.2 PBD試驗設計

根據(jù)單因素試驗結果，在各影響因素趨勢圖(見圖2)中對兩種指標均呈上升趨勢的區(qū)間內(nèi)，選擇最高值和最低值作為PBD試驗設計中各因素高、低水平，設計進行PBD試驗，繼續(xù)后續(xù)優(yōu)化。PBD試驗因素和水平見表3。

表2 單因素試驗因素和水平Table 2 The factor levels of single-factor test

2.2.3 CCD試驗設計

根據(jù)單因素和PBD試驗結果(見表4)，篩選出影響顯著的因素，并確定其他影響因素的最佳水平。利用Design-expert軟件設計進行CCD試驗，試驗設計和結果見表5。

2.2.4 驗證試驗設計

采用初始發(fā)酵和優(yōu)化發(fā)酵條件分別對特基拉芽孢桿菌WRN032菌株進行發(fā)酵，并進行樣品前處理和牛津杯法抑菌試驗，測定并對比兩種發(fā)酵條件下的吸光度OD和抑菌圈直徑d。

3 結果

3.1 單因素試驗結果

根據(jù)圖2可知七種因素的趨勢情況，分別在兩指標共同上升區(qū)間內(nèi)選擇高、低水平進行后續(xù)PBD試驗。以培養(yǎng)溫度為例進行詳細說明：溫度在26～37 ℃范圍內(nèi)，OD和d隨溫度的升高呈先升高后降低的趨勢，且當溫度在30 ℃左右時，兩種指標均最大，然后逐漸降低，溫度的3、4水平分別為30和34 ℃，二者溫差過大而指標降低幅度并不大，為避免出現(xiàn)誤差，因此在后續(xù)PBD試驗中，選擇培養(yǎng)溫度高、低水平為32和26 ℃。最終確定各因素高、低水平分別為：初始pH 7.0和6.0；接種量3和1 mL；搖床轉速220和140 rpm；培養(yǎng)溫度32和26 ℃；培養(yǎng)時間72和24 h；葡萄糖濃度5%和1%；搖瓶裝液量125和50 mL。其中，初始pH的低水平未選擇5.5是由于在較低pH下Landy培養(yǎng)基滅菌后呈現(xiàn)渾濁狀態(tài)，會影響菌株生長以及OD的測定。

圖2 不同因素五水平對吸光度和抑菌圈直徑的影響Fig.2 The influence of five levels of different factors on OD and d

3.2 PBD試驗結果

依據(jù)表3和表4分析可得：七種影響因素對特基拉芽孢桿菌WRN032發(fā)酵液吸光度OD的影響順序為：培養(yǎng)時間>培養(yǎng)溫度>初始pH>搖床轉速>搖瓶裝液量>接種量>葡萄糖濃度；對其抑菌圈直徑d的影響順序為：培養(yǎng)時間>初始pH >培養(yǎng)溫度>搖床轉速>搖瓶裝液量>接種量>葡萄糖濃度。P<0.05為顯著性影響因素，取各因素交集并綜合單指標進行分析，得到培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度和初始pH為顯著性影響因素，在確定另外四種因素的最佳水平，即搖床轉速220 rpm，搖瓶裝液量100 mL/250 mL(即40%)，接種量1 mL/100 mL(即1%)，葡萄糖濃度0.4 g/mL溶液 5 mL/100 mL(即2%)基礎上，選擇初始pH(X1)、培養(yǎng)時間(X2)和培養(yǎng)溫度(X3)三因素進行后續(xù)CCD試驗。

表3 PBD試驗設計及結果Table 3 Design and results of PBD test

表4 PBD試驗結果分析Table 4 Result analysis on PBD test

3.3 CCD試驗結果

根據(jù)表5和表6分析可知：進行回歸分析后擬合可得OD和d的最適模型為二次多項式函數(shù)，兩模型P值分別為< 0.000 1和0.004 0，均小于0.05(顯著)，失擬值分別為0.079 2和0.950 7，均大于0.05(不顯著)，表明OD和d的真實值與預測值之間擬合度較好，且隨機誤差對試驗結果的影響較小，可用此模型來預測兩種指標的實際情況。

表5 CCD試驗設計及結果Table 5 Design and results of CCD test

表6 方差分析結果及R2Table 6 ANOVA results and R2

圖3 三種顯著影響因素對吸光度和抑菌圈直徑的交叉影響等高線圖Fig.3 Cross-effect contour map of three significant influencing factors on OD and d

根據(jù)圖3可知，圖a1、b1、c1的考察指標為OD，圖a2、b2、c2的考察指標為d。圖中中心深色圓圈處表示兩種指標達到最優(yōu)，即OD≥0.52，d≥19 mm。綜合考慮各因素影響，最終確定特基拉芽孢桿菌WRN032的最佳發(fā)酵條件為：接種量1%，搖瓶裝液量40%，葡萄糖濃度2%，搖床轉速220 rpm，初始pH6.5，培養(yǎng)時間48 h，培養(yǎng)溫度30 ℃。

3.4 驗證試驗結果

圖4為初始發(fā)酵條件和優(yōu)化發(fā)酵條件分別為：接種量1%和1%，搖瓶裝液量40%和40%，葡萄糖濃度1%和2%，搖床轉速180和220 rpm，初始pH 5.5和6.5，培養(yǎng)時間24和48 h，培養(yǎng)溫度37和30 ℃，對OD和d兩指標的驗證對比圖。優(yōu)化條件下OD為0.536，抑菌圈直徑d為22.31 mm，較初始發(fā)酵條件的OD為0.187，抑菌圈直徑d為8.78 mm，分別增長了186.63%和154.10%，增長幅度明顯，優(yōu)化后的抗菌活性較優(yōu)化前有明顯提高。

圖4 初始發(fā)酵與優(yōu)化發(fā)酵對兩種指標的驗證對比圖Fig.4 Verification and comparison of two indicators for initial fermentation and optimized fermentation

5 討論

本研究通過牛津杯法抑菌試驗篩選得到特基拉芽孢桿菌WRN032菌株對稻瘟病菌有較好的抗菌活性，然后利用單因素試驗、PBD設計試驗和CCD設計試驗對該菌株的發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，優(yōu)化結果顯示與初始發(fā)酵條件相比，在最優(yōu)發(fā)酵條件下，特基拉芽孢桿菌WRN032菌株的發(fā)酵液吸光度OD提高了186.63%，抑菌圈直徑d增大了154.10%，優(yōu)化效果明顯，說明采用單因素試驗結合響應面設計能夠有效提高該菌株發(fā)酵液的抗菌活性。

經(jīng)驗證，在試驗范圍，此發(fā)酵條件下，特基拉芽孢桿菌WRN032發(fā)酵液的吸光度和有機溶劑萃取物的抑菌圈直徑均為最優(yōu)，說明本次發(fā)酵條件優(yōu)化的結果較為理想，特基拉芽孢桿菌有可能會成為天然抗菌活性物質(zhì)的重要資源，展現(xiàn)出了其較高的研究和應用價值，為后續(xù)進一步對該菌發(fā)酵產(chǎn)物進行分離和抗菌活性物質(zhì)的分析鑒定打下基礎。