陳 琦,薛 剛,何 易,張有做,許光治

(浙江農(nóng)林大學農(nóng)業(yè)與食品科學學院,浙江省農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)改良技術(shù)研究重點實驗室,浙江臨安 311300)

丁香酚是丁香精油中的主要成分,具有較好的抑菌和抗氧化活性[1]。但水溶性差、穩(wěn)定性差和易揮發(fā)等缺點限制了其在食品、化妝品等領域的應用[2]。為了延長抑菌時間和提高生物利用度[3-4],目前主要采用微膠囊或納米乳液技術(shù)對丁香酚進行包埋,但是利用明膠、殼聚糖等作為壁材制成的微膠囊包埋率50%左右[4],利用殼聚糖和三聚磷酸鈉制成的納米乳液包埋率僅為10%左右[5],存在包埋率低的問題。

以卵磷脂等兩親性分子為壁材的脂質(zhì)體對不同極性物質(zhì)均具有包埋率高、可變形性好等優(yōu)點。脂質(zhì)體壁材可溶于乙醇,非常適合醇溶性的化合物的包埋,具有包埋率高、可變形性好等優(yōu)點[6],已經(jīng)被廣泛地用于包埋茶多酚、姜黃素等不穩(wěn)定的物質(zhì)[7-8]。但脂質(zhì)體也存在壁材易氧化、聚集從而導致包埋的活性物質(zhì)泄露等問題。親水性高分子化合物如聚乙二醇[9]、殼聚糖[10-11]等對其進行修飾能增強脂質(zhì)體雙分子層穩(wěn)定性,延緩脂質(zhì)體中活性物質(zhì)釋放的作用。

果膠是來源于植物細胞壁富含半乳糖醛酸的酸性多糖,作為膠凝劑、穩(wěn)定劑或增稠劑廣泛應用于食品行業(yè)[12]。此外,也有研究將果膠包覆于微膠囊表面,其可以通過氫鍵、離子鍵等化學鍵與脂質(zhì)體表面基團作用,可提高微膠囊的穩(wěn)定性,改善被包埋活性物質(zhì)的緩釋效果,甚至靶向性[13-14]。但不同來源的果膠,其分子量、側(cè)鏈基團、乙?；?、酯化度、酸性糖含量等有較大差異,對包埋穩(wěn)定性、緩釋性效果會產(chǎn)生很大的影響[15-16]。因此,研究不同來源果膠包覆對脂質(zhì)體的影響,對脂質(zhì)體在食品領域的應用有一定的意義。

為此,本論文比較了梔子花果膠和蘋果果膠對丁香酚脂質(zhì)體(eugenol liposome,EP)緩釋性能的影響,以期為脂質(zhì)體包埋丁香酚在食品中的應用及梔子花果膠資源的利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮梔子花 來源于浙江農(nóng)林大學平山試驗基地的山梔子;蘋果果膠 美國Sigma-Aldrich公司(NO93854);葡萄糖(>99%)、葡萄糖醛酸(>99%)、間羥聯(lián)苯(99%)、卵磷脂(>98%)、丁香酚(99%)和吐溫20(分析純) 均購于阿拉丁試劑(上海)有限公司;無水乙醇、氫氧化鈉、氯化鈉、氯化鉀、十二水合磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀等其他試劑 分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

ZetaPALS電位及粒度分析儀 美國Brookhaven公司;UV-5500紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司;JY92-Ⅱ超聲波細胞粉碎機 寧波新藝超聲設備有限公司;TP-350S智能數(shù)顯磁力加熱攪拌器 杭州米歐儀器有限公司;JEM-1400 Plus 120KV高襯度透射電子顯微鏡 日本電子株式會社(JEOL)。

1.2 實驗方法

1.2.1 梔子花果膠的提取 根據(jù)Tabarsa等[17]的方法略作修改。將新鮮的梔子花在60 ℃烘箱中干燥24 h,用高速多功能粉碎機磨成粉,過40目篩備用。取干燥的梔子花粉與蒸餾水以1∶40 (W/V)的比例在90 ℃下攪拌2 h。將混合物以5000×g離心20 min,取上清液。整個提取過程重復兩次,合并上清液,并通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在60 ℃濃縮至原體積的一半,然后加入3倍體積的無水乙醇沉淀并在4 ℃下靜置過夜。通過抽濾分離沉淀物,并用無水乙醇脫水。將得到的梔子花果膠在40 ℃下干燥。

1.2.2 果膠的成分分析 對梔子花果膠和蘋果果膠的主要成分進行分析。中性糖含量以D-葡萄糖作為標準品,采用苯酚-硫酸法進行測定[18]。酸性糖含量以半乳糖醛酸為標準品,采用硫酸-間羥聯(lián)苯法進行測定[19]。蛋白質(zhì)含量以牛血清蛋白為標準品,采用考馬斯亮藍法進行測定[20]。酯化度采用滴定法進行測定[21]。

1.2.3 EP的制備 根據(jù)Jin等的方法略作修改[22]。將100 μL丁香酚溶液(終濃度為0.25%,V/V)和吐溫20加入無水乙醇中,于37 ℃,350 r/min下,持續(xù)磁力攪拌10 min,然后向上述體系中加入大豆卵磷脂,于37 ℃下保持轉(zhuǎn)速為350 r/min,持續(xù)磁力攪拌10 min,再用注射器向上述體系中緩慢勻速地加入一定體積的超純水,整個操作過程處于密閉狀態(tài),于37 ℃下調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為1000 r/min,持續(xù)磁力攪拌5 min后,立即取出,將溶液倒入圓底離心管中,于冰浴上300 W超聲2 min(每持續(xù)超聲5 s,間隔1 s)后過0.22 μm的有機濾膜,即得EP,封口膜封口放入4 ℃冰箱備用。

1.2.4 單因素實驗 采用1.2.3中EP的制備方法。在丁香酚終濃度0.25%(V/V),吐溫20終濃度為1.0%(W/V)和乙醇終濃度為20%(V/V)的條件下探究大豆卵磷脂濃度(終濃度為0.25%、0.5%、1%、1.5%和2%,W/V)對EP粒徑、多分散系數(shù)(Polydispersity,PDI)和包埋率的影響。

在丁香酚終濃度0.25%(V/V),卵磷脂終濃度為1.5%(W/V)和乙醇終濃度為20%(V/V)的條件下探究吐溫20濃度(終濃度為0%、0.25%、0.5%、1%和1.5%,W/V)對EP粒徑、PDI和包埋率的影響。

在丁香酚終濃度0.25%(V/V),卵磷脂終濃度為1.5%(W/V)和吐溫20終濃度為0.5%(W/V)的條件下探究乙醇濃度(終濃度為10%、15%、20%、25%和30%,V/V)對EP粒徑、PDI和包埋率的影響。

1.2.5 果膠包覆丁香酚脂質(zhì)體的制備

1.2.5.1 果膠溶液的制備 稱取一定量的蘋果果膠和梔子花果膠溶解在超純水中,在室溫下磁力攪拌過夜,分別配制濃度為(0.1%、0.2%、0.4%和0.6%,W/V)的蘋果果膠和梔子花果膠,備用。

1.2.5.2 果膠包覆丁香酚脂質(zhì)體的制備 根據(jù)Zhou等[13]的方法略作修改。在單因素實驗確定制備EP的最優(yōu)條件下,將EP按果膠溶液與脂質(zhì)體溶液體積比1∶1勻速滴入不同濃度的果膠溶液中,于室溫下,800 r/min磁力攪拌30 min后于冰浴300 W超聲45 s,過0.45 μm的有機濾膜,置于4 ℃冰箱備用。用與果膠溶液體積相同的超純水代替果膠溶液重復上述操作制備實驗的對照組。

1.2.6 EP和果膠包覆丁香酚脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)表征

1.2.6.1 粒徑、電位及EP的測定 取一定量的EP和果膠包覆丁香酚脂質(zhì)體,用超純水稀釋10倍后,通過布魯克海文ZetaPALS高分辨Zeta電位及粒度分析儀對樣品的粒徑、ζ-電位和PDI進行測定,每個樣品重復測定三次。測試溫度為25 ℃,散射角度為90 °,掃描波長為658 nm。樣品的粒徑以有效粒徑表示,以直徑計;粒徑的分布以多分散系數(shù)(PDI)表示[23]。

1.2.6.2 包埋率的測定 丁香酚標準曲線的測定:稱取一定量的丁香酚溶液溶解在95%的乙醇中,配制成濃度為0.08 mg/mL的丁香酚母液。用95%的乙醇稀釋成濃度為0.005～0.04 mg/mL的丁香酚溶液。以95%的乙醇作為空白對照,于278 nm處用紫外分光光度計測定吸光值,繪制丁香酚標準曲線方程:y=18.8x+0.0078,R2=0.9997[24]。

包埋率的測定:脂質(zhì)體中丁香酚的包埋率采用超濾離心法測定[23]。取300 μL的EP、梔子花果膠包覆丁香酚脂質(zhì)體(gardenia flower pectin-coated eugenol liposomes,GLMP-EP)和蘋果果膠包覆丁香酚脂質(zhì)體(apple pectin-coated eugenol liposomes,ALMP-EP)于分子截留為100 kD的超濾離心管中,5000 r/min離心25 min,取適量濾液用95%的乙醇稀釋20倍于278 nm處測濾液中丁香酚的濃度。另外取適量的EP、GLMP-EP和ALMP-EP用95%的乙醇溶液稀釋20倍,5000 r/min離心20 min,取上清液于278 nm處測丁香酚的濃度,每個樣品平行測定三次。

丁香酚包埋率的計算公式如下:

式中:m-樣品溶液中丁香酚的總質(zhì)量,mg;m0-根據(jù)標曲計算得到的游離丁香酚的質(zhì)量,mg。

1.2.6.3 透射電鏡觀察 采用負染法[25]對EP、GLMP-EP和ALMP-EP的形貌進行觀察。取一定濃度的樣品溶液,滴幾滴在碳涂覆的銅網(wǎng)上,放置3 min后用1%的磷鎢酸對其染色5 min并在室溫下進行干燥。采用透射電鏡在120 KV下對EP、GLMP-EP和ALMP-EP進行觀察。

1.2.7 EP、GLMP-EP和ALMP-EP貯藏穩(wěn)定性的研究

1.2.7.1 貯藏溫度的影響 根據(jù)張偉華[26]的方法將丁EP、GLMP-EP和ALMP-EP于4和25 ℃貯藏60 d,分別于0、30和60 d取樣,測定樣品的粒徑、PDI及包埋率。

1.2.7.2 蔗糖濃度的影響 調(diào)節(jié)蔗糖在EP、GLMP-EP和ALMP-EP的濃度為0、50和100 mg/mL。分別于25 ℃貯藏60 d,于第0、30和60 d取樣,測定樣品的粒徑、PDI和包埋率。

1.2.7.3 氯化鈉濃度的影響 根據(jù)Shao等[27]的方法。調(diào)節(jié)氯化鈉在EP、GLMP-EP和ALMP-EP的濃度為0、50和100 mmol/L,分別于25 ℃貯藏60 d,于第0、30和60 d取樣,測定樣品的粒徑、PDI和包埋率。

1.2.8 EP、GLMP-EP和ALMP-EP釋放性能的研究 參考鄒立強的方法略作修改[28]。分別取5 mL的EP、GLMP-EP和ALMP-EP于分子截留為8000 Da的透析袋中,將透析袋分別放置于pH1.2的鹽酸溶液和pH7.4的PBS溶液兩種釋放介質(zhì)中,在溫度為25 ℃,磁力攪拌器轉(zhuǎn)速為100 r/min的條件下,分別于1、2、3、4、6、8、12和24 h取出3 mL的釋放介質(zhì),于278 nm處測定釋放介質(zhì)的吸光值,并補充等溫等量的釋放介質(zhì),計算不同釋放介質(zhì)中丁香酚的含量和丁香酚的累積釋放率。丁香酚的累積釋放率的計算公式如下[5]:

式中:m0-丁香酚總質(zhì)量,mg;mt-每個采樣時間點丁香酚的累積釋放量,mg。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 果膠的成分分析

不同來源的果膠,其結(jié)構(gòu)和組成不同,可能導致對脂質(zhì)體包覆的效果也不同,因此本文首先對提取的梔子花果膠和蘋果果膠的成分進行了比較(如表1)。梔子花果膠與蘋果果膠的中性糖含量沒有顯著性差異(P>0.05),蘋果果膠的酸性糖含量顯著大于梔子花果膠的酸性糖含量(P<0.05),分別為64.11%和35.21%。梔子花果膠和蘋果果膠的酯化度分別為32.76%和5.89%,表明蘋果果膠與梔子花果膠均為低甲氧基果膠，且蘋果果膠的酯化度更低。

表1 蘋果果膠與梔子花果膠的成分對比Table 1 Comparison of the composition ofapple pectin and gardenia flower pectin

2.2 EP制備工藝的優(yōu)化

2.2.1 卵磷脂濃度對EP制備的影響 在丁香酚濃度為0.25%(V/V),吐溫20濃度為1.0%(W/V)和乙醇濃度為20%(V/V)條件下探究了卵磷脂濃度對EP的影響。隨著卵磷脂濃度的增大,EP的粒徑和PDI均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢,當卵磷脂濃度為1.5%時,EP的PDI值最小(如圖1),表明在卵磷脂濃度為1.5%時EP的分散性最好,此時制備得到的EP粒徑也較小。當卵磷脂濃度由0.25%增大到0.5%時,包埋率上升較快,當卵磷脂濃度由0.5%增大到1.5%時,包埋率上升緩慢(如圖1),這可能是由于卵磷脂濃度過低時無法將丁香酚全部包裹住,導致包埋率較低;卵磷脂濃度為1.5%時對丁香酚的包埋已經(jīng)達到了飽和狀態(tài),所以包埋率基本不變。因此,綜合粒徑、PDI及包埋率三個因素,選擇卵磷脂濃度為1.5%進行后續(xù)實驗。

圖1 卵磷脂濃度對EP粒徑、PDI及包埋率的影響Fig.1 Effect of concentrations of lecithinon particle size,PDI and embedding rate of EP

2.2.2 吐溫20濃度對EP制備的影響 在丁香酚濃度為0.25%(V/V),卵磷脂濃度為1.5%(W/V)和乙醇濃度為20%(V/V)條件下探究了吐溫20濃度對EP的影響。從圖2中可以看出,加入吐溫20可以減小EP的粒徑和PDI值,且當吐溫20濃度為0.5%時粒徑最小。吐溫20從0%增大到0.5%時,包埋率迅速增長,當吐溫20濃度大于1%后,包埋率又有所下降(如圖2),這可能是由于吐溫是一種非離子型親水性表面活性劑,含有親水性和疏水性的長鏈。向脂質(zhì)體中加入吐溫后,其聚氧乙烯基會從脂質(zhì)體的磷脂雙分子層中伸出,致密地覆蓋在脂質(zhì)體表面,對脂質(zhì)體形成保護作用,使得丁香酚不易發(fā)生泄露[29]。但是,較高濃度的吐溫也會破壞脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)導致包埋的丁香酚泄露。因此,綜合粒徑、PDI值和包埋率的考慮,選擇吐溫20濃度為0.5%進行后續(xù)實驗。

圖2 吐溫20濃度對EP粒徑、PDI及包埋率的影響Fig.2 Effect of tween 20 concentrationson particle size,PDI and embedding rate of EP

2.2.3 乙醇濃度對EP制備的影響 在丁香酚濃度為0.25%(V/V),卵磷脂濃度為1.5%(W/V)和吐溫20濃度為0.5%(W/V)條件下探究了乙醇濃度對EP的影響。圖3表明,隨著乙醇濃度的增加,EP的粒徑和PDI值均呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢。當乙醇濃度大于20%后,包埋率下降較明顯,這可能是由于乙醇可以增強脂質(zhì)體的流動性,較高濃度的乙醇會破壞脂質(zhì)體的囊泡結(jié)構(gòu)使得丁香酚發(fā)生泄漏,導致包埋率減小[6]。因此,綜合粒徑、PDI值和包埋率的考慮,選擇乙醇濃度為20%進行后續(xù)實驗。

圖3 乙醇濃度對EP粒徑、PDI及包埋率的影響Fig.3 Effect of concentrations of ethanolon particle size,PDI and embedding rate of EP

通過單因素實驗確定EP的制備工藝為:卵磷脂濃度1.5%,吐溫20濃度0.5%,乙醇濃度20%。此時,EP的包埋率為77.40%±0.06%,粒徑為(43.2±0.9) nm,PDI為0.116±0.023。與傳統(tǒng)的乙醇注入結(jié)合微射流法[28]制得的丁香酚納米脂質(zhì)體相比(粒徑58.6±3.4 nm,PDI 0.381±0.053,包埋率59.2%±4.7%),本法制得的EP粒徑較小,分散性較好且包埋率較高。

2.3 果膠包覆對EP制備的影響

表2表示的是不同濃度的梔子花果膠對EP粒徑、PDI、電位和包埋率的影響。隨著果膠濃度的增大,EP的粒徑和PDI值均逐漸增大,可能是由于果膠與脂質(zhì)體發(fā)生了氫鍵相互作用,使得果膠包覆在了EP的表面導致粒徑增大[13]。

表2 不同濃度的梔子花果膠對EP粒徑、PDI、電位和包埋率的影響Table 2 Effect of different gardenia flower pectin concentrations on the particle size,PDI,zeta potential and embedding rate of EP

表3 不同濃度的蘋果果膠對EP粒徑、PDI、電位和包埋率的影響Table 3 Effect of different apple pectin concentrations on the particle size,PDI,zeta potential and embedding rate of EP

果膠終濃度從0.2%增大到0.3%時,電位值減小了6 mV左右,但不存在顯著性差異(P>0.05),而包埋率顯著下降(P<0.05),這表明終濃度為0.2%(W/V)的梔子花果膠在脂質(zhì)體表面可能已經(jīng)達到了飽和[13]。加入蘋果果膠后也能看到類似的現(xiàn)象(如表3)。但是在相同果膠濃度的條件下,GLMP-EP的ζ-電位值比ALMP-EP的更低。

因此,綜合粒徑、電位、PDI和包埋率的影響,選擇梔子花果膠和蘋果果膠終濃度均為0.2%進行后續(xù)實驗。

2.4 EP、GLMP-EP和ALMP-EP透射電鏡圖

用梔子花果膠和蘋果果膠包覆后的EP如圖4所示。通過對比發(fā)現(xiàn),EP呈現(xiàn)圓形,分布較均勻。經(jīng)過梔子花果膠包覆后的EP呈現(xiàn)橢圓形且發(fā)生了鏈狀的聚集。經(jīng)過蘋果果膠包覆后的EP呈現(xiàn)圓形,粒徑有所增大,也有輕微的聚集現(xiàn)象。這可能是由于果膠分子與脂質(zhì)體的外層磷脂頭端發(fā)生了橋聯(lián)、成環(huán)、懸掛等作用,使得EP相互連接在了一起[30]。

圖4 EP、GLMP-EP和ALMP-EP的透射電鏡圖Fig.4 TEM imagines of EP,GLMP-EP and ALMP-EP

從圖中可以看出,部分EP的囊泡狀結(jié)構(gòu)發(fā)生了破裂,但是經(jīng)過梔子花果膠和蘋果果膠包覆的EP的結(jié)構(gòu)均較為完整,這也可以說明EP經(jīng)過果膠包覆后更加穩(wěn)定。

2.5 EP、GLMP-EP和ALMP-EP貯藏穩(wěn)定性的研究

2.5.1 貯藏溫度對EP、GLMP-EP和ALMP-EP粒徑、PDI和包埋率的影響 如圖5所示,在4和25 ℃下貯藏60 d后,EP的粒徑均增大了5 nm左右,包埋率分別降低了3.35%和2.45%;GLMP-EP的粒徑均增大了2 nm左右,包埋率分別降低了1.16%和0.77%;ALMP-EP的粒徑分別增大了4.6 nm左右和增大了2.1 nm左右,包埋率分別降低了1.46%和3.05%。在4 ℃下貯藏60 d后,ALMP-EP的PDI值均沒有顯著性變化(P>0.05);與0 d相比,EP和GLMP-EP的PDI值顯著變大。在25 ℃下貯藏60 d后,GLMP-EP的PDI值沒有顯著性變化(P>0.05);與0 d相比,EP的PDI值顯著變大,ALMP-EP的PDI值顯著減小。經(jīng)過60 d的貯藏,所有樣品的包埋率均在70%以上,表明在4 ℃和25 ℃下三種樣品均具有較高的穩(wěn)定性。

圖5 不同貯藏溫度對EP、GLMP-EP和ALMP-EP粒徑、PDI和包埋率的影響Fig.5 Effects on particle size,PDI and encaopsulation efficiency of EP,GLMP-EP and ALMP-EP at different temperatures注:A:4 ℃對粒徑的影響;B:4 ℃對PDI的影響;C:4 ℃對包埋率的影響;D:25 ℃對粒徑的影響;E:25 ℃對PDI的影響;F:25 ℃對包埋率的影響;不同的小寫字母代表同一樣品在不同天數(shù)的粒徑、PDI及包埋率存在顯著性差異,P<0.05。

2.5.2 蔗糖濃度對EP、GLMP-EP和ALMP-EP粒徑、PDI和包埋率的影響 為研究EP、GLMP-EP和ALMP-EP在不同蔗糖濃度條件下的穩(wěn)定性,對EP、GLMP-EP和ALMP-EP在25 ℃不同濃度的蔗糖溶液(0、50和100 mg/mL)下進行了為期60 d的貯藏穩(wěn)定性實驗。如圖6所示,EP、GLMP-EP和ALMP-EP在不同蔗糖濃度(0、50和100 mg/mL)的情況下,隨著蔗糖濃度的增大,粒徑均增大,但是增長幅度均小于5 nm。與0 d相比,GLMP-EP在100 mg/mL的蔗糖溶液中貯藏60 d時,PDI值和包埋率均顯著減小(P<0.05);ALMP-EP在50 mg/mL的蔗糖溶液中貯藏60 d時,PDI值顯著減小(P<0.05);ALMP-EP在100 mg/mL的蔗糖溶液中貯藏60 d時包埋率顯著減小(P<0.05)。但是,貯藏60 d時所有樣品的PDI值均小于0.3,包埋率均大于70%,表明EP、GLMP-EP和ALMP-EP在不同濃度的蔗糖(0、50和100 mg/mL)溶液中均具有良好的穩(wěn)定性。

圖6 不同濃度的蔗糖對EP、GLMP-EP和ALMP-EP穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of sucrose concentrations on stability ofEP,GLMP-EP and ALMP-EP注:A:蔗糖濃度對粒徑的影響;B:蔗糖濃度對PDI的影響;C:蔗糖濃度對包埋率的影響;E0、G0和A0分別代表未添加蔗糖的EP、GLMP-EP和ALMP-EP;E50、G50和A50分別代表添加了50 mg/mL蔗糖的EP、GLMP-EP和ALMP-EP;E100、G100和A100分別代表添加了100 mg/mL蔗糖的EP、GLMP-EP和ALMP-EP，不同小寫字母表示同一樣品，相同添加量，不同天數(shù)之間差異顯著(P<0.05)。

2.5.3 氯化鈉濃度對EP、GLMP-EP和ALMP-EP粒徑、PDI和包埋率的影響 為研究EP、GLMP-EP和ALMP-EP在不同鹽濃度條件下的穩(wěn)定性,對EP、GLMP-EP和ALMP-EP在25 ℃不同濃度的氯化鈉(0、50和100 mmol/L)下進行了為期60 d的貯藏穩(wěn)定性實驗。結(jié)果如圖7所示,隨著氯化鈉濃度的增大,EP的粒徑逐漸增大,GLMP-EP和ALMP-EP的粒徑均逐漸減小。與0 d相比,EP在0和50 mmol/L的氯化鈉溶液中貯藏60 d時,PDI值顯著增大(P<0.05);GLMP-EP在50和100 mmol/L的氯化鈉溶液中貯藏60 d時,PDI值也顯著增大(P<0.05);ALMP-EP在0和50 mmol/L中貯藏60 d時包埋率顯著降低(P<0.05)。但是,貯藏60 d時所有樣品的PDI值均小于0.3,包埋率均大于70%,表明EP、GLMP-EP和ALMP-EP在不同濃度的氯化鈉(0、50 和100 mmol/L)存在的條件下均具有良好的穩(wěn)定性。

圖7 不同濃度的氯化鈉對EP、GLMP-EP和ALMP-EP穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of NaCl concentrations on stability ofEP,GLMP-EP and ALMP-EP注:A:氯化鈉濃度對粒徑的影響;B:氯化鈉濃度對PDI的影響;C:氯化鈉濃度對包埋率的影響;E0、G0和A0分別代表未添加氯化鈉的EP、GLMP-EP和ALMP-EP;E50、G50和A50分別代表添加了50 mmol/L氯化鈉的EP、GLMP-EP和ALMP-EP;E100、G100和A100分別代表添加了100 mmol/L氯化鈉的EP、GLMP-EP和ALMP-EP，不同小寫字母表示同一樣品，相同添加量，不同天數(shù)之間差異顯著(P<0.05)。

2.6 丁香酚溶液、EP、GLMP-EP和ALMP-EP的釋放特性分析

為研究在不同pH下的緩釋效果,本文探究了酸性(pH=1.2)和弱堿性(pH=7.4)兩種情況下丁香酚溶液,EP、GLMP-EP和ALMP-EP的緩釋情況(如圖8所示)。

圖8 丁香酚溶液、EP、GLMP-EP和ALMP-EP在不同pH溶液中的緩釋情況Fig.8 Cumulative release rate of Eugenol,EP,GLMP-EP and ALMP-EP in different pH solutions注:A:在pH1.2的鹽酸溶液中的緩釋情況;B:在pH7.4的PBS溶液中的緩釋情況，不同小寫字母表示相同釋放時間，不同樣品間差異顯著(P<0.05)。

在酸性環(huán)境下,丁香酚溶液中的丁香酚釋放速率較快,前4 h釋放了89.9%,但是,丁香酚在EP、GLMP-EP和ALMP-EP中存在著持續(xù)釋放的現(xiàn)象(如圖8A)。前6 h,EP、GLMP-EP和ALMP-EP中丁香酚的釋放率分別為62.9%、49.8%和57.0%,且存在顯著性差異(P<0.05)。EP具有緩釋性能可能是因為丁香酚被包裹在囊泡狀脂質(zhì)體的內(nèi)部,磷脂雙分子層對丁香酚有一定保護作用[25]。有部分游離的丁香酚會附著在脂質(zhì)體的表面,而加入果膠后果膠會包覆在脂質(zhì)體的表面,與表面的丁香酚結(jié)合從而導致釋放速率減慢[25]。在弱堿性環(huán)境中也可以看到類似的現(xiàn)象(如圖8B),但是ALMP-EP中丁香酚的釋放情況和EP無顯著性差異(P>0.05),前6 h分別釋放了57.4%和56.1%,而GLMP-EP中的丁香酚僅釋放了43.4%,存在著顯著性差異(P<0.05)。

3 結(jié)論

確定了梔子花果膠和蘋果果膠包覆EP的最佳終濃度為0.2%。此時,GLMP-EP和ALMP-EP的粒徑分別為51.3和63.5 nm,PDI分別為0.157和0.299,包埋率分別為76.39%和75.43%。透射電鏡表明EP和ALMP-EP呈現(xiàn)圓形結(jié)構(gòu),GLMP-EP呈現(xiàn)橢圓形結(jié)構(gòu)。果膠包覆脂質(zhì)體后粒徑的增大、電位值的下降、TEM圖中的聚集現(xiàn)象都表明果膠成功包覆在了脂質(zhì)體的表面。在不同溫度(4和25 ℃),不同蔗糖濃度(0、50和100 mg/mL)和不同氯化鈉濃度(0、50和100 mmol/L)的條件下貯藏60 d后,EP和經(jīng)過梔子花果膠及蘋果果膠包覆的EP仍具有較強的穩(wěn)定性。緩釋實驗表明梔子花果膠在酸性環(huán)境和弱堿性環(huán)境中均能增強EP的緩釋性能且效果優(yōu)于蘋果果膠。