王娜娜,李柏良,李 娜,史佳璐,宋 月,霍貴成,李艾黎

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150030)

炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease,IBD)是一種慢性和復(fù)發(fā)性胃腸道炎癥性疾病,主要包括克羅恩病(Crohn’s disease,CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis,UC)[1]。IBD病因復(fù)雜,其發(fā)病機(jī)制與嚴(yán)重程度受到多種因素影響,其發(fā)病機(jī)制與嚴(yán)重程度受到多種因素影響,其中主要包括遺傳因素、免疫反應(yīng)、腸道菌群和氧化應(yīng)激等因素[2]。目前治療IBD的藥物主要是抗炎或免疫抑制藥物,如氨基水楊酸、皮質(zhì)類(lèi)固醇和硫嘌呤,但這些藥物往往會(huì)引起嚴(yán)重的副作用[3]。

色氨酸為動(dòng)物體內(nèi)必需氨基酸,對(duì)腸道免疫、抑制炎癥具有重要的調(diào)節(jié)作用[4]。最新的研究表明色氨酸調(diào)節(jié)腸道免疫的本質(zhì)并不是色氨酸本身,而是在腸道菌群的作用下,色氨酸分解為吲哚及吲哚酸衍生物,例如吲哚丙烯酸、吲哚乙酸、吲哚-3-乳酸等可作為芳香烴受體(Aryl hydrocarbon receptor,AHR)的配體,激活免疫系統(tǒng),增強(qiáng)腸上皮屏障,以及腸道激素的分泌,從而發(fā)揮抗炎、抗氧化或抗毒性作用[5-8]。Takamura等[9]發(fā)現(xiàn)乳酸菌OLL1181激活芳基烴受體途徑,抑制結(jié)腸炎。目前研究發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌、梭狀芽孢桿菌、擬桿菌、消化鏈球菌具有降解色氨酸的功能,馬梅蕾[10]從豬結(jié)腸中篩選出一株能夠利用色氨酸的腸球菌屬,但菌株存在安全性問(wèn)題。乳酸菌作為有益于宿主健康的微生物,在降解色氨酸方面還未引起人們的重視。本研究以實(shí)驗(yàn)室保藏的16株乳酸桿菌為研究對(duì)象,篩選出一株具有降解色氨酸能力最高的菌株植物乳桿菌KLDS1.0386,其中植物乳桿菌KLDS1.0386具有降膽固醇、生長(zhǎng)性能優(yōu)良、黏附性較好等益生功能[11-12]。將植物乳桿菌KLDS1.0386作為目標(biāo)菌株用于葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠進(jìn)行體內(nèi)預(yù)防實(shí)驗(yàn),從而評(píng)估目標(biāo)菌株對(duì)腸炎小鼠的預(yù)防作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌(KLDS1.0317、KLDS1.0318、KLDS1.0386、KLDS1.0344、1-2、2-2、4-5、1-5、4-4、8-6)、嗜酸乳桿菌(KLDS1.0901、KLDS1.0902、KLDS1.1003)、鼠李糖乳桿菌(1.0911、1.0912、LGG) 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏;C57BL/6N小鼠 雄性,清潔級(jí),8周齡,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,許可證號(hào):SCXK(京)2016-0006;甲醇 天津市大茂化學(xué)試劑廠(chǎng);L-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品 天津市津科精細(xì)化工研究所;葡聚糖硫酸鈉(DSS) 天津阿爾法生物科技有限公司;便隱血試劑盒 上海源葉生物科技有限公司;IL-6試劑盒、IL-10試劑盒 泉州科諾迪生物技術(shù)有限公司。

DHP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;LDZF-50KB-Ⅱ立式蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng);CJ-2D超凈工作臺(tái) 天津泰斯特儀器有限公司;TGL-16G離心機(jī) 上海安亭科技儀器廠(chǎng);UV-2401PC型紫外分光光度計(jì) 日本島津公司;Waters 2695高效液相色譜儀 配2996二極管陣列檢測(cè)器,美國(guó)Waters公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 MRS培養(yǎng)基 蛋白胨5.0 g,胰蛋白胨10.0 g,乙酸鈉5.0 g,酵母提取物5.0 g,葡萄糖20.0 g,吐溫-80 1.0 g,硫酸錳0.25 g,檸檬酸氫二銨2.0 g,硫酸鎂0.58 g,磷酸氫二鉀2.0 g,牛肉膏5.0 g,用蒸餾水定容至1 L,調(diào)節(jié)pH至5.8,121 ℃條件下滅菌15 min。

1.2.2 色氨酸培養(yǎng)基 按照上述MRS培養(yǎng)基配方的劑量溶解于800 mL蒸餾水,調(diào)節(jié)pH至5.8,121 ℃條件下滅菌15 min。稱(chēng)取2 g色氨酸加入200 mL無(wú)菌水中,使其充分溶解,用0.22 μm水系濾膜過(guò)濾除菌之后加入滅完菌的MRS培養(yǎng)基,混勻后即為色氨酸培養(yǎng)基。

1.2.3 菌株的活化 將凍存于-80 ℃條件下的16株乳酸桿菌以2%的接種量接種在MRS培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)24 h,連續(xù)培養(yǎng)兩代,37 ℃培養(yǎng)18 h備用。

1.2.4 可降解色氨酸乳酸菌的篩選

1.2.4.1 色氨酸含量的測(cè)定 配制1 g/L的色氨酸溶液,并依次將濃度稀釋至0.020、0.030、0.035、0.045、0.100、0.200、0.300 g/L,進(jìn)樣前經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾。HPLC條件:色譜柱為島津C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相為0.03%磷酸二氫鉀溶液∶甲醇=90∶10 (V∶V),使用前需經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾,超聲脫氣;流速為1.0 mL/min;二極管檢測(cè)器,檢測(cè)波長(zhǎng)為278 nm;柱溫為39 ℃;進(jìn)樣量設(shè)置為20 μL[13]。色氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為y=3.2×107x-6638.6,R2=0.9997,具有良好的相關(guān)系數(shù),可用于樣品中色氨酸含量的測(cè)定。

1.2.4.2 色氨酸降解率的計(jì)算

式中:A為各菌株發(fā)酵后培養(yǎng)液的色氨酸含量,g/L;C為空白對(duì)照組的色氨酸含量,g/L;重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次,取平均值。

1.2.4.3 發(fā)酵液樣品的處理 將活化好的乳酸菌接種于色氨酸培養(yǎng)基,以未接菌的色氨酸培養(yǎng)基作為空白對(duì)照,培養(yǎng)24 h后,4 ℃ 8000 r/min離心15 min,將上清液稀釋一定的倍數(shù),混合均勻后取1 mL上清液于無(wú)菌EP管,0.22 μm水系濾膜過(guò)濾置于液相進(jìn)樣小瓶測(cè)定樣品中色氨酸的含量。

1.2.5 DSS誘導(dǎo)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的預(yù)防效果探究

1.2.5.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 將75只8周齡C57BL/6N雄鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后隨機(jī)分為5組,每組15只,即正常組、模型組、色氨酸組、1.0386組、1.0386+色氨酸組。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后,正常組和模型組在整個(gè)實(shí)驗(yàn)階段內(nèi)正常飲食與用水,每天灌胃無(wú)菌PBS 0.2 mL;色氨酸組每天灌胃無(wú)菌色氨酸溶液0.2 mL(含2 mg色氨酸)[14],1.0386組每天灌胃109CFU/mL的菌懸液0.2 mL;1.0386+色氨酸組每天灌胃109CFU/mL的色氨酸菌懸液(含2 mg色氨酸)。

表1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案Table 1 The experimental design

除正常組外,其它四組從第22 d飲用2.5% DSS水溶液7 d;同時(shí),造模期間,根據(jù)疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分細(xì)則每天進(jìn)行評(píng)分,灌胃結(jié)束后,眼球取血,斷頸處死小鼠,對(duì)所需指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5.2 疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)的測(cè)定 在小鼠造模及灌胃期間每天觀(guān)察記錄小鼠的生長(zhǎng)狀態(tài),包括眼神毛發(fā)、體重變化、糞便形狀及便血狀況。參照J(rèn)oh等[15]的評(píng)分方法,計(jì)算小鼠的疾病活動(dòng)指數(shù)DAI,評(píng)分細(xì)則如表2所示。

表2 DAI評(píng)分細(xì)則Table 2 DAI score rules

1.2.5.3 小鼠結(jié)腸組織長(zhǎng)度的測(cè)定 小鼠處死后,測(cè)量盲腸末端和近端直腸之間的結(jié)腸,測(cè)量結(jié)腸長(zhǎng)度[16]。

1.2.5.4 小鼠器官指數(shù)的測(cè)定 小鼠解剖后,分離心臟、脾臟、肝臟、腎臟,用生理鹽水清洗并用濾紙吸干表面水分,然后迅速稱(chēng)量[17]。

器官指數(shù)(%)=器官重量(g)/體重(g)×100

1.2.5.5 小鼠結(jié)腸組織病理評(píng)估 取小鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸(距肛門(mén)1 cm處)1 cm浸泡于甲醛中固定組織,然后石蠟包埋切片,經(jīng)二甲苯脫蠟后染色,用于結(jié)腸組織病理評(píng)估[18]。

1.2.5.6 小鼠血清細(xì)胞因子的測(cè)定 灌胃結(jié)束后,眼球取血,室溫下自然凝固1～2 h,7000 r/min離心5 min,收集血清,凍存于-20 ℃冰箱,收集完畢后,通過(guò) ELISA 試劑盒,用于IL-6、IL-10的檢測(cè)[19]。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 17.0進(jìn)行顯著性差異分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Mean±SD表示,P<0.05為差異有顯著性意義,Origin 9.0 進(jìn)行繪圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 降解色氨酸的乳酸菌的篩選

根據(jù)高效液相色譜儀檢測(cè)發(fā)酵液中色氨酸的含量,乳酸菌對(duì)色氨酸的降解作用如圖1所示,其中植物乳桿菌對(duì)色氨酸具有更好的降解作用,植物乳桿菌KLDS1.0317、KLDS1.0386、KLDS1.0344、4-5對(duì)色氨酸的降解率分別為12.78%、20.43%、18.77%、15.45%,顯著高于其他菌株(P<0.05)。嗜酸乳桿菌和鼠李糖乳桿菌對(duì)色氨酸的降解作用較弱,其中參考菌株LGG對(duì)色氨酸的降解率為5.51%。16株乳酸菌對(duì)色氨酸均具有不同程度的降解作用,不同菌株之間具有差異性,降解率為3.83%～20.43%,根據(jù)乳酸菌對(duì)色氨酸的降解作用的不同,選取植物乳桿菌KLDS1.0386作為后續(xù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的優(yōu)良菌株。馬梅蕾[10]從豬腸道內(nèi)分離出一株可以利用色氨酸的腸球菌,其降解率為21.59%,而本研究篩選出的植物乳桿菌KLDS1.0386對(duì)色氨酸的降解率為20.43%,兩者對(duì)色氨酸的利用程度相似,但腸球菌可能是一種具有潛在致病性的菌株,菌株的安全性不能保證,而本研究所使用的乳酸菌作為益生菌的主要來(lái)源,是被公認(rèn)為安全的食品級(jí)微生物,因此篩選出一株能夠高效降解色氨酸的乳酸菌,為開(kāi)發(fā)具有緩解結(jié)腸炎的功能性乳酸菌提供理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支持。

圖1 16株乳酸菌對(duì)色氨酸的降解作用 Fig.1 The degradation effect oftryptophan by 16 lactic acid bacteria注:不同小寫(xiě)字母表示各組差異性顯著(P<0.05);字母相同表示差異不顯著(P>0.05);圖4同。

2.2 KLDS1.0386聯(lián)合色氨酸對(duì)DSS誘導(dǎo)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的預(yù)防作用

2.2.1 潰瘍性結(jié)腸炎小鼠體重變化 在造模期間,每日稱(chēng)量小鼠體重,各組小鼠的體重變化如圖2所示,正常組小鼠體重平緩增加,實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)體重達(dá)到(27.83±0.77) g;模型組在造模前4 d時(shí),體重保持緩慢增加,而第5 d之后,體重開(kāi)始大幅度下降,在第7 d時(shí),體重降到最低為(19.76±1.08) g,顯著低于正常組(P<0.05),這與王碧瑩[20]的結(jié)果一致;而其它處理組的體重也從第5 d開(kāi)始出現(xiàn)不同程度的降低,在第7 d時(shí),色氨酸組體重為(21.25±1.22) g,1.0386組小鼠體重為(21.73±0.98) g,1.0386+色氨酸組小鼠體重為(23.35±0.89) g。造模之前的初始體重雖略有差異,但差異不顯著,而隨著飲用DSS時(shí)間的延長(zhǎng),DSS組小鼠體重下降幅度較大,1.0386+色氨酸組能夠明顯緩解小鼠體重降低的趨勢(shì)。

圖2 各處理組對(duì)各組小鼠體重的影響Fig.2 Effect of different treatments on body weight in mice

2.2.2 KLDS1.0386聯(lián)合色氨酸對(duì)DSS誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠DAI的影響 DAI可以反映出小鼠體重變化、大便狀態(tài)以及便血情況三個(gè)方面的總體特征,DAI評(píng)分越高,說(shuō)明腸炎癥狀越明顯[21]。由圖3可知,正常組小鼠的糞便正常,DAI基本為0,小鼠毛色光澤,眼神靈敏,行動(dòng)反應(yīng)迅速;模型組小鼠飲用DSS第4 d開(kāi)始大便呈現(xiàn)松散的情況,部分小鼠糞便出現(xiàn)血跡,體重大幅度下降,DAI值逐漸升高,隨著飲用DSS時(shí)間延長(zhǎng),模型組小鼠的糞便不成型,出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的紅褐色血跡,黏附于肛門(mén),DAI值達(dá)到最大值,為7.21±0.21,且小鼠毛色無(wú)光澤,精神萎靡,行動(dòng)遲鈍,體型消瘦,易聚堆;其它處理組在一定程度上均緩解了與模型組相似的癥狀,降低DAI值,色氨酸組的DAI值為3.67±0.59,1.0386組的DAI值為5.01±0.93,1.0386+色氨酸組小鼠DAI值為2.96±0.41,數(shù)據(jù)表明1.0386+色氨酸顯著降低了小鼠DAI值(P<0.05)。

圖3 各處理組對(duì)各組小鼠 DAI 指數(shù)的影響Fig.3 Effect of different treatments on DAI index in mice

2.2.3 KLDS1.0386聯(lián)合色氨酸對(duì)DSS誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度的影響 飲用DSS可使小鼠結(jié)腸縮短,結(jié)腸長(zhǎng)度可直接反映結(jié)腸炎癥的嚴(yán)重程度[22]。由圖4可看出正常組的結(jié)腸長(zhǎng)度最長(zhǎng),為(7.03±0.25) cm,而模型組小鼠結(jié)腸顯著縮短,為(3.80±0.1) cm;而與模型組相比,其它處理組在一定程度上都增加了小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度,色氨酸組和1.0386組的結(jié)腸長(zhǎng)度分別為(4.30±0.2)和(4.27±0.06) cm,而1.0386+色氨酸組的結(jié)腸長(zhǎng)度為(4.77±0.06) cm,與單獨(dú)使用色氨酸、1.0386相比,色氨酸+1.0386混合處理改善結(jié)腸組織縮短的效果最佳,且具有顯著性(P<0.05)。

圖4 各處理組對(duì)小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度的影響Fig.4 Effects of different treatmentson colon length in colitis mice

2.2.4 KLDS1.0386聯(lián)合色氨酸對(duì)DSS誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠器官指數(shù)的影響 器官指數(shù)可表明不同處理組小鼠的生長(zhǎng)狀態(tài)。由表3可知,模型組的脾臟指數(shù)明顯高于正常組(P<0.05),色氨酸組和1.0386組的脾臟指數(shù)低于模型組,但差異不顯著(P>0.05),而1.0386+色氨酸組的脾臟指數(shù)明顯低于模型組(P<0.05),與正常組無(wú)顯著差異(P>0.05)。在心臟指數(shù)、肝臟指數(shù)和腎臟指數(shù),各處理組無(wú)顯著差異(P>0.05),這說(shuō)明1.0386+色氨酸可有效改善腸炎小鼠的脾臟指數(shù)。脾臟與機(jī)體免疫情況相關(guān),腸道炎癥增加,使免疫系統(tǒng)活化,便會(huì)引起脾臟重量的增加,因此模型組的脾臟指數(shù)顯著高于正常組,這與劉凌云等[23]的研究一致。

表3 各處理組對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響Table 3 Effects of different treatments on organ coefficients of mice

表4 各組小鼠血清炎癥因子含量Table 4 Serum inflammatory factors in each group

2.2.5 KLDS1.0386聯(lián)合色氨酸對(duì)DSS誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)的影響 HE組織染色可以反映出腸道的病變狀態(tài),腸道上皮作為腸道粘膜的重要組成部分,以自身的更新能力來(lái)保護(hù)腸道受到不同的損傷[24]。由圖5 HE染色可知,正常組小鼠正常的結(jié)腸黏膜層見(jiàn)有豐富的杯狀細(xì)胞,黏膜表層黏膜上皮細(xì)胞呈高柱狀,排列整齊;隱窩呈瓶狀結(jié)構(gòu),中央見(jiàn)有小腔或無(wú)明顯腔狀結(jié)構(gòu);模型組黏膜全層固有結(jié)構(gòu)消失,結(jié)締組織增生及炎性細(xì)胞浸潤(rùn);與模型組相比,其它各處理組的都在一定程度上緩解了結(jié)腸組織的損傷,其中1.0386+色氨酸組明顯改善了飲用DSS對(duì)小鼠結(jié)腸帶來(lái)的腸道損傷,由圖5e可以看出,1.0386+色氨酸組結(jié)腸粘膜層保留了大部分的杯狀細(xì)胞,腸上層結(jié)構(gòu)完整,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)顯著減輕,說(shuō)明1.0386+色氨酸對(duì)結(jié)腸結(jié)構(gòu)組織的保護(hù)效果最好。

圖5 各處理組小鼠結(jié)腸 HE染色(×100)Fig.5 Colonic HE staining results of different groups(×100)注:a為正常組;b為模型組;c為色氨酸組;d為1.0386組;e為色氨酸+1.0386組。

2.2.6 KLDS1.0386聯(lián)合色氨酸對(duì)血清細(xì)胞因子的影響 潰瘍性結(jié)腸炎與炎癥因子水平密切相關(guān),采用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒在450 nm處采用酶標(biāo)儀檢測(cè)小鼠血清 IL-6和IL-10的含量[25]。細(xì)胞因子的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)相關(guān)系數(shù)良好,如圖6所示。與正常組相比,DSS組的促炎性細(xì)胞因子IL-6含量顯著升高,抑炎性細(xì)胞因子IL-10的含量顯著下降(P<0.05)。與模型組相比,色氨酸組、1.0386組、1.0386聯(lián)合色氨酸組均可顯著降低IL-6水平(P<0.05)。其次,色氨酸組和1.0386組可一定程度上提高IL-10水平,與模型組相比無(wú)顯著性差異(P>0.05),而1.0386聯(lián)合色氨酸可顯著提高IL-10水平(P<0.05)。

圖6 細(xì)胞因子的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖Fig.6 Standard curve of the serum levels of cytokines

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)高效液相色譜法篩選出一株高效降解色氨酸的乳酸菌作為優(yōu)勢(shì)菌株,并對(duì)優(yōu)勢(shì)菌株和色氨酸對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎的預(yù)防作用進(jìn)行研究。通過(guò)飲用DSS建立潰瘍性腸炎小鼠模型,以使用色氨酸、1.0386以及兩者聯(lián)合對(duì)小鼠結(jié)腸炎進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn),根據(jù)小鼠臨床狀態(tài)表現(xiàn)、體重變化、DAI指數(shù)、結(jié)腸長(zhǎng)度、器官指數(shù)、結(jié)腸組織病理學(xué)以及細(xì)胞因子為指標(biāo)評(píng)估,發(fā)現(xiàn)1.0386與色氨酸聯(lián)合對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎的緩解作用明顯優(yōu)于其它兩組,在兩者的聯(lián)合作用下,有效降低DAI指數(shù),增加結(jié)腸長(zhǎng)度,減小脾臟指數(shù),減輕結(jié)腸組織損傷,下調(diào)促炎因子IL-6含量,并上調(diào)抑炎因子IL-10的含量。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看,KLDS1.0386聯(lián)合色氨酸能夠更好的改善潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的效果,但具體的作用機(jī)制尚未明確,有待深入研究。