王斯彤

(1.遼寧省沙地治理與利用研究所，遼寧 阜新 123000;2.遼寧章古臺(tái)科爾沁沙地生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家定位觀測(cè)研究站，遼寧 阜新 123000)

文冠果Xanthocerassorbifolia為無(wú)患子科文冠果屬多年生木本植物，素有“千花一果”之稱。文冠果是中國(guó)特有的溫帶木本油料植物[1]，由于其種子和種仁都具有較高的含油量，因此也被譽(yù)為“北方油茶”[2]。作為落葉喬木或灌木的文冠果具有根系發(fā)達(dá)、萌蘗力強(qiáng)的特點(diǎn)，可廣泛用于固沙造林、綠化荒山[3]，是良好的水土保持樹種。由于對(duì)文冠果需求和利用量不斷增加，如何提高其產(chǎn)量迫在眉睫。目前，文冠果的主要繁殖方式為種子繁殖，但其種子發(fā)芽率僅為6%[4]，且種子繁殖的弊端在于個(gè)體性狀差異顯著，子代很難保持親本的優(yōu)良性狀，而嫁接繁殖成功率較低，人工費(fèi)用較高。因此，通過(guò)研究文冠果組織培養(yǎng)及器官再生，可以從根本上解決種源不足的問(wèn)題，快速繁殖文冠果苗，提高產(chǎn)量并保持個(gè)體優(yōu)良性狀[5-6]。

目前，已有利用文冠果無(wú)性器官進(jìn)行離體培養(yǎng)研究的報(bào)道，柳金鳳等[6]采用文冠果莖段及種子萌發(fā)獲得的嫩莖作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，成功獲得無(wú)菌苗；宋群雁[7]等用文冠果葉片作外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)，成功獲得生根苗。雖然目前通過(guò)離體培養(yǎng)方式能夠獲得無(wú)菌苗，但為實(shí)現(xiàn)工廠化育苗及降低工廠化育苗成本，需要對(duì)整個(gè)無(wú)菌體系進(jìn)行優(yōu)化。

本研究以章古臺(tái)地區(qū)篩選獲得的文冠果優(yōu)系4號(hào)莖段為外植體，通過(guò)器官直接發(fā)生途徑對(duì)不定芽進(jìn)行誘導(dǎo)，對(duì)不定芽誘導(dǎo)的無(wú)菌體系建立進(jìn)行系統(tǒng)研究，為文冠果快速繁殖建立系統(tǒng)的無(wú)菌體系，為文冠果組培苗增殖和生根研究提供豐富材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以文冠果優(yōu)系4號(hào)嫁接苗1年生莖段為外植體。一般5月中旬，在章古臺(tái)地區(qū)采集生長(zhǎng)良好、無(wú)病蟲害的新萌發(fā)枝條，每隔15 d采集1次外植體，直至1年生枝條完全木質(zhì)化。采回的枝條去除葉片，放入4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方 法

1.2.1 外植體預(yù)處理

將枝條剪成長(zhǎng)約2.5 cm帶腋芽或頂芽的小段，去除葉片，加少量洗衣粉并用軟刷清洗表面雜質(zhì)，將莖段置于廣口瓶中用流水沖洗1～2 h，用蒸餾水沖洗6次，放在超凈工作臺(tái)上備用。

1.2.2 消毒時(shí)間優(yōu)化

先用75%乙醇20 s消毒2次，然后用無(wú)菌水沖洗2次，用0.1%HgCl2分別消毒3、6、9、12 min，用2%NaClO消毒5、10、15、20 min，再用無(wú)菌水震蕩清洗3次。將處理后的莖段切除底端和頂端，每個(gè)小莖段上留1個(gè)腋芽，最后將莖段在無(wú)菌操作下接入培養(yǎng)基中培養(yǎng)。每個(gè)處理重復(fù)3次，共接種30個(gè)莖段。接種后4周記錄污染率和萌發(fā)率。

1.2.3 外植體最佳取材時(shí)間

選擇生長(zhǎng)健壯、無(wú)明顯病蟲害的文冠果優(yōu)系4號(hào)，以當(dāng)年萌發(fā)的莖段作為外植體，分別于5、6、7、8、9、10月采集，每隔15 d采集1次。采后的莖段去葉沖洗后置于超凈工作臺(tái)上備用。先用75%乙醇20 s消毒2次，再用0.1%HgCl2消毒9 min，無(wú)菌水沖洗6次。消毒后的莖段用無(wú)菌濾紙吸干表面水漬，切去頂端和底端，保留1個(gè)腋芽，將莖段接種到DKW培養(yǎng)基中，每瓶2個(gè)莖段，每次接種40瓶，接種后4周記錄污染率和萌發(fā)率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2007處理數(shù)據(jù)并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒試劑對(duì)外植體的消毒效果

從表1可以看出，消毒效果最好的處理是0.1% HgCl2消毒12 min，污染率49.3%；雖然0.1% HgCl2消毒9 min的污染率54.4%，但萌發(fā)率最高35.6%?？梢缘贸觯m然增加消毒時(shí)間可以降低污染率，但處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)對(duì)萌發(fā)造成影響。2%NaClO對(duì)文冠果莖段有一定的消毒作用，但消毒效果和萌發(fā)率都不如0.1%HgCl2，因此0.1%HgCl2更適合用于文冠果莖段消毒處理。

表1 不同消毒試劑的消毒效果

2.2 取材時(shí)期對(duì)外植體污染率和萌發(fā)率的影響

不同取材時(shí)期對(duì)外植體消毒和誘導(dǎo)影響很大，如圖1所示，污染率在5月偏高，6、7月較低，8、9、10月逐漸上升，且外植體表面會(huì)有絨毛狀菌絲，難以通過(guò)表面消毒而抑制細(xì)菌的滋生。而萌發(fā)率在5月較低，6、7月逐漸升高，且萌發(fā)的組培苗生長(zhǎng)健壯；8、9、10月萌發(fā)率逐漸下降。因此，文冠果最好在6-7月采集莖段。

圖1 不同取材時(shí)期對(duì)污染率及萌發(fā)率的影響

3 結(jié) 論

章古臺(tái)地區(qū)春季風(fēng)沙較大，導(dǎo)致長(zhǎng)期暴露在野外的文冠果枝條表面有較多雜質(zhì)和細(xì)菌，且莖段皮孔多，頂芽及腋芽周圍滋生大量細(xì)菌，極易造成污染，且難以徹底消除，有的細(xì)菌甚至滲透到組織內(nèi)部，因此文冠果莖段的滅菌處理成功與否會(huì)直接影響后續(xù)試驗(yàn)的成敗。在文冠果組織培養(yǎng)時(shí)不僅選擇消毒效果好的消毒試劑，還得掌握消毒時(shí)間，消毒時(shí)間短易造成滅菌不徹底，污染率高，而消毒時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，則會(huì)給外植體的生長(zhǎng)造成損傷，影響誘導(dǎo)率。

本試驗(yàn)使用75%乙醇、0.1%HgCl2、2%NaClO對(duì)外植體進(jìn)行消毒，設(shè)置不同滅菌時(shí)間，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)75%酒精20 s消毒2次，0.1%HgCl2消毒9 min，能有效降低污染率，獲得較高萌發(fā)率，且獲得的組培苗生長(zhǎng)健壯。

除了消毒試劑和消毒時(shí)間對(duì)外植體污染的影響外，選擇合適的采條時(shí)間也很重要。通常情況下，春季和夏季，天氣晴朗，植株生長(zhǎng)旺盛，外植體生長(zhǎng)活性強(qiáng)，所攜帶的微生物相對(duì)較少，滅菌相對(duì)容易。而秋季莖段已木質(zhì)化，植株的代謝活動(dòng)也相對(duì)減弱，活力降低，自身攜帶的微生物也較多，污染率較高。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在6-7月份取材效果最好，不僅污染率低且組培苗生長(zhǎng)狀態(tài)好。