鐘 珍,侯莉莉,王俊南,侯溫甫,3,王宏勛,3,王麗梅,3,*

(1.武漢輕工大學食品科學與工程學院,湖北武漢 430023;2.武漢輕工大學生物與制藥工程學院,湖北武漢 430023;3.湖北省生鮮食品工程技術研究中心,湖北武漢 430023)

菱角又名腰菱、水栗、菱實,是一種菱科菱屬的一年生草本水生植物菱(TrapabispinosaRoxb.)的果實,其營養(yǎng)豐富,用途廣泛,是天然的藥食兼用型水生草本作物[1],在我國已有上千年的栽種歷史。菱角在我國是一種分布廣、產(chǎn)量大的水生經(jīng)濟作物,我國菱角主要分布于長江流域和亞熱帶地區(qū)[2],全國約有將近4萬hm2的種植面積,年產(chǎn)量約為25萬t,其中湖北省菱角的產(chǎn)量為400～500 kg/667 m2[3]。在對菱角的加工中,人們一般只采用其果實部分,菱角殼被直接廢棄或者作為燃料使用而造成嚴重的浪費[4]。據(jù)《中藥大辭典》歸納,菱殼可治“泄瀉、脫肛、痔瘡、療腫、黃水瘡、天皰瘡”。研究表明,菱角殼富含多糖、黃酮等多種生理活性成分而逐漸受到食品和醫(yī)藥行業(yè)的青睞[5],菱角殼中的黃酮類化合物具有一定的抗氧化性[6-7]、抗腫瘤[8]等功效。

近年來,從植物中分離出的天然產(chǎn)物因其低毒、高效的特點,獲得眾多科研工作者的青睞。黃酮具有抑菌[9]、抗癌[10]、抗氧化[11]、降血糖[12]、降血脂[13]、抗骨質(zhì)疏松[14]等多種生物活性。現(xiàn)對菱角殼的研究多為其活性成分以及藥理作用方面的研究[15-16],而對其在抑菌保鮮方面的研究相對較少[17],其中劉永等[18]利用菱角殼提取物的生理活性作用與殼聚糖制成活性涂膜,發(fā)現(xiàn)其對豬肉保鮮有較好的效果,能有效延長冷鮮豬肉的貨架期。本實驗以湖北種植的二角菱的殼為原材料,提取菱角殼中的黃酮,采用抑菌圈、最低抑菌濃度、液體體系中生長曲線評價菱角殼黃酮提取物對食品中六種常見微生物的抑菌效果,建立假單胞菌在經(jīng)菱角殼黃酮提取物處理后鴨肉基質(zhì)中的一級生長預測模型,為開發(fā)冷鮮鴨肉天然抑菌劑及菱角殼中活性成分的有效利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菱角殼 兩角菱,采自湖北蔡甸種植地;黃酮粗提物、黃酮純提物 本實驗室制備;鴨肉 湖北鴻翔農(nóng)業(yè)有限公司;大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、假單胞菌、熱殺索絲菌、乳酸菌、酵母菌 均由本實驗室從其它來源分離純化后進行16s rDNA鑒定培養(yǎng);曲酸 國藥集團;鴨肉 湖北鴻翔農(nóng)業(yè)有限公司提供;營養(yǎng)瓊脂、假單胞選擇性培養(yǎng)基、熱殺索絲選擇性培養(yǎng)基 青島海博科技公司;AB-8型大孔吸附樹脂 天津市海光化工有限公司。

FW177高速萬能粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司;SHZ-D(III)兩抽頭循環(huán)水式真空泵 鞏義市英峪予華儀器廠;RE-2000A旋轉蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責任公司;HL-1恒流泵、層析柱 上海嘉鵬科技有限公司;XZ-10DTD超聲波清洗器 寧波新芝生物科技股份有限公司;SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司;DNP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設備有限公司;芬蘭Bioscreen全自動生長曲線分析儀 上海謂載商貿(mào)發(fā)展有限公司;VORTEX-GENIE1單速漩渦混合器 上海書俊儀器設備有限公司;CP214電子分析天平 奧豪斯儀器(上海)有限公司;YXQ-LS-50SII立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博訊;HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇區(qū)白塔新寶儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 菱角殼黃酮提取物的制備 將新鮮采摘的菱角去殼后,將殼置于40 ℃烘箱中干燥至質(zhì)量恒定后粉碎,裝入密封袋中,備用。黃酮提取液:準確稱取1.0 g菱角殼粉末置三角瓶中,以1∶30的料液比加入50%的乙醇30 mL,在60 ℃下水浴加熱30 min過濾得到菱角殼黃酮提取液[19]。黃酮純化提取液:采用AB-8樹脂純化菱角殼黃酮提取液,純化工藝為:吸附流速0.8 mL/min,上樣體積110 mL,340 mL的70%乙醇溶液洗脫,洗脫樣品的流速0.8 mL/min,經(jīng)純化后得到菱角殼黃酮純化提取液,將兩種提取液經(jīng)50 ℃下減壓濃縮后再經(jīng)冷凍干燥得到的粉末即為菱角殼黃酮粗提物和純化物,其黃酮含量分別為17.50%和36.75%。

1.2.2 菱角殼黃酮提取物抑菌效果的測定 分別稱取菱角殼黃酮粗提物、純化物0.5 g,溶于10 mL的無菌水,經(jīng)超聲、旋渦混合器混合均勻后配制成濃度為50 mg/mL的樣液。滅菌后的培養(yǎng)基以每15 mL倒入平板內(nèi),培養(yǎng)基溫度下降凝固后,將滅菌后冷卻到50 ℃的5 mL培養(yǎng)基混入100 μL試驗菌(菌懸液濃度為105～106CFU/mL),將試管中的5 mL培養(yǎng)基均勻地鋪在已凝固的第一層培養(yǎng)基上,待第二層有供試菌的培養(yǎng)基凝固后,用鑷子在其表面上放入牛津杯,并用鑷子輕輕按壓,使其與培養(yǎng)基表面更好地接觸而沒有縫隙;在牛津杯內(nèi)加入200 μL濃度為50 mg/mL經(jīng)0.22 μm無菌濾頭處理的樣液,勿使其外溢,無菌水做空白;加完樣液后酵母菌、乳酸菌于37 ℃培養(yǎng)48 h,其它菌于30 ℃培養(yǎng)24 h,觀察結果,量取直徑[20],以出現(xiàn)的抑菌圈大小為判定標準,直徑小于8 mm為無抑菌作用。

1.2.3 菱角殼黃酮提取物的最低抑菌濃度(MIC)的測定 取濃度為50 mg/mL的菱角殼黃酮樣液,采用二倍稀釋法[20],稀釋為25、12.5、6.25、3.125、1.563 mg/mL 5個濃度梯度的樣品溶液,分別加入培養(yǎng)基中,將受試菌菌懸液接種于各試管中,搖床培養(yǎng),酵母菌、乳酸菌于37 ℃培養(yǎng)48 h[21-22],其它菌30 ℃培養(yǎng)24 h,比濁法觀察試管中培養(yǎng)基的亮度,以透亮無菌生長的最高稀釋度為最低抑菌濃度,考察菱角殼黃酮的抑菌性能。

1.2.4 菱角殼黃酮提取物對液體體系中細菌生長的抑制特性 配制2.5、5、10 mg/mL濃度的樣液,用移液槍吸取0.5 mL懸液濃度為105～106CFU/mL的假單胞、金黃色葡萄球菌分別注入5 mL LB培養(yǎng)基中,按照濃度梯度分別添加0.5 mL菱角殼黃酮粗提物、純化物,漩渦儀混勻后吸取200 μL混有接種菌與藥品的培養(yǎng)基接至Bioscreen蜂窩狀樣品板中,每個樣品濃度三個平行,無菌蒸餾水做對照,放置于Bioscreen全自動分析儀檢測器上,設定30 ℃培養(yǎng)3 d,每隔2 h自動測定一次,收集數(shù)據(jù),處理并繪圖[23]。

1.2.5 不同溫度下經(jīng)菱角殼黃酮提取物處理的鴨肉中假單胞菌測定 采用1.2.4實驗中抑制效果較好濃度的菱角殼黃酮提取物浸沒新鮮宰殺的凈膛鴨肉,浸泡10 min后,瀝干,進行氣調(diào)包裝(50% O2+30% CO2+20% N2)后,放置于(0±1)、(5±1)、(10±1)、(15±1)、(20±1) ℃的恒溫培養(yǎng)箱中貯藏。無菌操作條件下隔天測定菱角殼黃酮提取物處理的鴨肉樣品中假單胞菌(參照GB/T 4789.2-2010的測定方法,采用CFC培養(yǎng)基)[24]含量變化。在相同的條件下,用曲酸代替菱角殼黃酮提取物處理鴨肉樣品,無菌操作條件下測定假單胞菌含量變化,作為曲酸處理對照組。

1.2.6 生長預測模型的擬合 Gompertz方程如下:

lgN(t)=N0+C·exp{-exp[-B(t-M)]}

式中:N0是初始菌數(shù),lg CFU/g;C為隨時間無限增加時菌增量的對數(shù)值,lg CFU/g;M是達到相對最大生長速率(U)所需要的時間,d;B是在時間為M時的相對最大比生長速率,d-1[25]。得到以上參數(shù)后,代入公式求得最大比生長速率(U)、延滯期(LPD)值。其中,最大比生長速率U=B×C/e,e=2.7182d-1;延滯期LPD=M-(1/B),d。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用Microsoft Excel 2007、SAS 9.1進行,數(shù)值表示為Mean±SD。

2 結果與分析

2.1 菱角殼黃酮提取物抑菌效果的測定

抑菌圈法評價菱角殼黃酮粗提取物、純化物對6種微生物生長的抑制作用,以出現(xiàn)的抑菌圈大小為判定標準。由表1可見,菱殼黃酮純化物對假單胞菌、金黃色葡萄球菌有較好的抑制作用,其抑菌圈直徑分別為(47.01±0.43)和(45.06±0.35) mm,菱殼黃酮粗提物對這兩種菌有一定的抑菌效果。菱角殼黃酮提取物對熱殺索絲菌的抑制作用較弱,粗提物和純化物的抑菌圈直徑分別為(19.33±0.29)和(18.22±0.23) mm。菱角殼黃酮提取物對大腸桿菌和乳酸菌、酵母菌無抑菌圈,顯示無抑菌效果。不同的菌群對菱角殼黃酮敏感度不同。抑菌結果如圖1和圖2。

表1 菱角殼黃酮提取物對六種菌的抑菌圈直徑Table 1 Diameter of inhibition zone formed by Trapa bispinosaRoxb.shell flavonoids extract to six types of bacteria

圖1 菱角殼黃酮粗提物對六種菌的抑菌圈Fig.1 Inhibition zone formed by Trapa bispinosa Roxb.shell flavonoids crude extract to six types of bacteria注:a:假單胞菌,b:金黃色葡萄球菌,c:熱殺索斯菌,d:大腸桿菌,e:酵母菌,f:乳酸菌;圖2同。

圖2 菱角殼黃酮純化物對六種菌的抑菌圈Fig.2 Inhibition zone formed by Trapa bispinosa Roxb.shell flavonoids extract purification to six types of bacteria

菱角黃酮殼提取物對假單胞菌、金黃色葡萄球菌和熱殺索斯菌有一定的抑菌效果,對大腸桿菌無明顯的抑制作用,這與相關文獻[26]研究結果一致,但在該研究中顯示,菱角殼黃酮提取物對乳酸菌也存在抑制作用,而在本實驗中,菱角殼黃酮粗提物和純化物均對乳酸菌無抑制作用,據(jù)相關文獻[27]可知,用水蒸氣蒸餾法和超臨界流體CO2萃取法提取的不同來源菱角的皮或仁的揮發(fā)性成分對同種菌的抑制作用不同,這可能是由于菱角的來源、氣候、種植方式等導致菱角生物活性成分組成上的差異,也可能是其組成成分比較復雜,成分含量的差別影響了其抑菌效果。

2.2 菱角殼黃酮提取物的最低抑菌濃度(MIC)

根據(jù)2.1結果可知,菱殼黃酮粗提物和純化物對假單胞菌、金黃色葡萄球菌均有較明顯的抑制作用,且這兩種菌是食品中典型的腐敗致病菌,具有一定的代表性,因此挑出這兩種菌完成MIC實驗,評價菱角殼黃酮粗提物、純化物的抑菌性能,表明其抑菌強弱。結果見表2。菱角殼黃酮粗提物和純化物對假單胞菌的MIC值均為3.125 mg/mL,其純化前后效果一樣,但其抑菌圈有明顯的差別,這可能是因為提取物本身抑菌濃度相對較高,純化前后最低抑菌濃度沒有變化,但抑菌IC50值有變化,使得抑菌圈變大。菱角殼黃酮粗提物和純化物對金黃色葡萄球菌的MIC值分別為12.000和3.125 mg/mL,顯示了黃酮提取物純化后對金黃色葡萄球菌的抑菌效果優(yōu)于純化前。

表2 菱角殼黃酮粗提取物、純化物最低抑菌濃度(MIC)Table 2 The minimum bacteriostasis concentration ofTrapa bispinosa Roxb. shell flavonoids crude extract purification

2.3 菱角殼黃酮提取物對液體體系中細菌抑菌的特性

由圖3可知,菱角殼黃酮純化物對假單胞菌的抑制效果優(yōu)于黃酮粗提物,其中菱角殼黃酮純化物三個濃度梯度抑制假單胞菌的吸光度增加值小于0.100,對假單胞菌的抑制作用非常明顯,基本使之處于未生長的狀態(tài);菱角殼黃酮提取物對金黃色葡萄球菌具有一定的效果,但濃度為10 mg/mL的黃酮提取物對金黃色葡萄球菌的抑制作用較差,僅在后期保持穩(wěn)定狀態(tài)。結果表明,添加了不同濃度菱角殼黃酮提取物的假單胞菌和金黃色葡萄球菌生長曲線變化明顯,兩種菌的吸光值增長幅度相比空白組明顯減少。對于同一供試菌而言,不同添加濃度的菱角殼黃酮粗提物和純化物對微生物生長均有很好的抑制作用,其抑制作用與黃酮提取物的濃度有關;對于菱角殼黃酮粗提物和純化物而言,純化物的抑制效果較優(yōu)于粗提物。所以在液體體系下,菱角殼黃酮提取物能有效抑制供試菌的生長,延緩其生長期,并在后期完全抑制其生長,而結合菱角殼黃酮粗提物、純化物對假單胞菌和金黃色葡萄球菌的生長曲線來看,濃度為2.5 mg/mL的菱角殼黃酮純化物對供試菌的抑菌效果最好。

圖3 經(jīng)菱角殼黃酮提取物處理后的假單胞菌和金黃色葡萄球菌的液體生長曲線Fig.3 The liquid growth curve of Pseudomonas and Staphylococcus aureus by Trapa bispinosa Roxb. shell flavonoids extract注:圖a、b分別為經(jīng)菱角殼黃酮粗提物、純化物處理后的假單胞菌的液體生長曲線;圖c、d為經(jīng)菱角殼黃酮粗提物、純化物處理后的金黃色葡萄球菌的液體生長曲線。

2.4 鴨肉上菱角殼黃酮純化物對假單胞菌菌落數(shù)的影響

由2.3實驗結果可知,濃度為2.5 mg/mL的菱角殼黃酮純化物對供試菌的抑菌效果最好,且對假單胞菌有明顯的抑制作用,因此選用濃度2.5 mg/mL的菱角殼黃酮純化物處理鴨肉。由圖4可知,在10、15和20 ℃件下,菱角殼黃酮純化物對假單胞菌的抑制作用較弱,當假單胞菌數(shù)超過107CFU/g[28]說明鴨肉變質(zhì)。15和20 ℃組的冷鮮鴨肉貨架期為2 d;在0和5 ℃條件下,菱角殼黃酮純化物能有效地抑制假單胞菌的增殖,在第10 d,5 ℃條件下,假單胞菌數(shù)為7.42 lg CFU/g>7 lg CFU/g,達到腐敗標準;在整個儲藏期間,0 ℃條件下的冷鮮鴨肉未達到腐敗標準,與高溫組相比,低溫組可將冷鮮鴨肉的貨架期延長至8 d以上。

圖4 不同溫度下菱角殼黃酮純化物處理鴨肉后鴨肉中假單胞菌菌落數(shù)變化Fig.4 The change of total Pseudomonas on duck meat treatedunder Trapa bispinosa Roxb. shell flavonoids extract at 0～20 ℃

2.5 菱角殼黃酮純化物處理后鴨肉中假單胞菌生長預測模型構建

鑒于生活中肉類的新鮮程度不一,因此其鴨肉中假單胞菌的初始菌落數(shù)也存在差別,所以采用生長預測模型來評價鴨肉中假單胞菌的增殖狀況。在本實驗中,菱角殼黃酮純化物處理鴨肉和對照組曲酸處理的鴨肉中假單胞菌的生長曲線應用Gompertz模型擬合。

運用SAS軟件擬合回歸獲得不同恒定溫度下鴨肉中假單胞菌的各參數(shù)。由表3、表5可以看出決定系數(shù)R2的值較高,在0～20 ℃范圍內(nèi)隨溫度升高R2值逐漸變大,表明Gompertz方程能很好地擬合不同溫度下假單胞菌的增殖動態(tài),溫度高的決定系數(shù)值高,擬合效果好。利用Gompertz模型擬合得出的假單胞菌生長動力學參數(shù)見表4表、6,在0～15 ℃下,經(jīng)菱角殼黃酮純化物處理后的鴨肉中假單胞菌最大比生長速率(U)均小于曲酸對照組,20 ℃時,曲酸對照組的最大比生長速率(U)大于菱角殼黃酮提取物,表現(xiàn)了其在0～15 ℃儲藏時,菱角殼黃酮提取物作為保鮮劑的抑菌效果較好,能夠有效延長食品保質(zhì)期,但隨溫度升高,其抑菌能力逐漸減弱。

表3 不同溫度下假單胞菌菱角殼黃酮純化物處理后生長動力學模型Table 3 Growth kinetics model of Pseudomonas treated under Trapa bispinosa Roxb. shell flavonoids extract at 0～20 ℃

表4 不同溫度下假單胞菌菱角殼黃酮純化物處理后生長動力學參數(shù)Table 4 Growth kinetics parameters of Pseudomonas treatedunder Trapa bispinosa Roxb. shell flavonoids extract at 0～20 ℃

表5 不同溫度下假單胞菌曲酸處理后的生長動力學模型Table 5 Growth kinetics model of Pseudomonas added preservative at 0～20 ℃

表6 不同溫度下假單胞菌曲酸處理后的生長動力學參數(shù)Table 6 Growth kinetics parameters of Pseudomonasadded preservative at 0～20 ℃

3 結論

菱角殼黃酮提取物對假單胞菌、金黃色葡萄球菌有明顯的抑制作用,對熱殺索絲菌有一定的抑制效果,其中黃酮純化物對假單胞菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果更好,抑菌圈直徑分別為(47.01±0.43)、(45.06±0.35) mm;菱角殼黃酮提取物對大腸桿菌和乳酸菌、酵母菌無抑菌效果。菱角殼黃酮粗提物和純化物對假單胞菌的MIC值均為3.125 mg/mL,可能是因為提取物本身抑菌濃度相對較高,純化前后最低抑菌濃度沒有變化,其對金黃色葡萄球菌的MIC值分別為12.000和3.125 mg/mL,顯示了黃酮純化物對金黃色葡萄球菌的抑菌效果優(yōu)于粗提物;而在液體體系下,菱角殼黃酮提取物能有效抑制假單胞菌和金黃色葡萄球菌的生長,延緩其生長期,并在后期完全抑制其生長,且初步確定濃度為2.5 mg/mL的菱角殼黃酮純化物對供試菌的抑菌效果最好。繼而采用對供試菌抑菌效果最好的菱角殼黃酮純化物濃度(2.5 mg/mL)處理后的鴨肉儲藏在不同溫度下,發(fā)現(xiàn)0和5 ℃可將冷鮮鴨肉的貨架期延長至8 d以上,并且通過建立假單胞菌在經(jīng)濃度為2.5 mg/mL的菱角殼黃酮純化物處理后的鴨肉基質(zhì)中的一級模型可知,在0～15 ℃儲藏時,菱角殼黃酮提取物作為保鮮劑的抑菌效果較好,能夠有效延長食品保質(zhì)期,有開發(fā)為天然抑菌劑的潛力。