張文君,王 穎,李慧冬,王東升,李俊才,李紅旭,李 勇,陳子雷,2,*

(1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所,山東濟(jì)南 250100;2.山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東濟(jì)南 250014;3.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院,河南鄭州 450002;4.遼寧省果樹(shù)科學(xué)研究所,遼寧營(yíng)口 115009;5.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院,甘肅蘭州 730070;6.河北省農(nóng)林科學(xué)院,河北石家莊 050061)

作為梨起源中心之一,我國(guó)具有豐富的梨種質(zhì)資源,在世界梨產(chǎn)業(yè)中占有重要地位。近幾年,無(wú)論栽培面積還是產(chǎn)量都迅速發(fā)展,梨屬新品種也在逐年增加[1-2]。梨產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展不僅源于梨果數(shù)量及品種更迭方面,梨果品質(zhì)更是決定其快速發(fā)展及競(jìng)爭(zhēng)力提高的至關(guān)重要的因素。果實(shí)香氣由不同類型揮發(fā)性芳香物質(zhì)組成,其種類與含量不同影響果實(shí)特征香氣,且在梨的生長(zhǎng)過(guò)程中受各類因素影響,可以客觀反映果實(shí)的風(fēng)味特性及成熟程度[3-4],直接決定著果實(shí)及其加工品的品質(zhì),顯著影響其市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力,近年來(lái)受到了大量學(xué)者的廣泛關(guān)注。

固相微萃取(SPME)與氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)[5-7]是研究香氣組分最常用的方法,其操作簡(jiǎn)單,可匹配數(shù)據(jù)庫(kù)豐富、能夠較真實(shí)地反應(yīng)果實(shí)的香氣成分?，F(xiàn)在已有學(xué)者應(yīng)用此研究了套袋[8]、成熟度[9]、采收期[10]、貯藏期[11-12]等對(duì)梨果揮發(fā)性香氣組分的影響,不同處理方式下梨果中香氣物質(zhì)均有一定的變化規(guī)律;分析了我國(guó)白梨、砂梨、秋子梨及新疆梨等四大系統(tǒng)梨果中揮發(fā)性香氣物質(zhì),通過(guò)不同類別香氣物質(zhì)比較與主成分分析確定不同系統(tǒng)梨果之間的差異[3,13-15];上述研究建立了良好的香氣組分萃取方法,并對(duì)影響梨果香氣的因素、梨果中香氣組分差異及形成相關(guān)性進(jìn)行詳細(xì)闡述,為梨果生產(chǎn)、貯藏過(guò)程中如何保證果品質(zhì)量及香氣育種提供了較好的數(shù)據(jù)支持。不同種間雜交品種梨果,品種新穎,市場(chǎng)前景較好,但對(duì)其揮發(fā)性香氣成分的研究不多。李國(guó)鵬[14]曾應(yīng)用電子鼻對(duì)黃冠梨香氣成分進(jìn)行了研究;李杰等[15]以黃冠梨為基質(zhì)研究了7種不同萃取頭對(duì)梨果實(shí)香氣萃取的影響;其他參試?yán)婀鶡o(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。

保留指數(shù)法是一種穩(wěn)定的色譜定性參數(shù),具有較好的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性[16],與譜庫(kù)檢索相結(jié)合能充分發(fā)揮兩種方法各自的優(yōu)勢(shì),提高分析效率,大大增加定性分析的準(zhǔn)確性和可靠性[17]。由此本研究在已有基礎(chǔ)上,優(yōu)化固相微萃取條件,結(jié)合譜庫(kù)檢索與保留指數(shù)綜,對(duì)不同種間雜交品種梨果進(jìn)行SPME-GC/MS評(píng)價(jià)分析,以期為不同種間雜交梨果香氣性狀的評(píng)價(jià)提供參考依據(jù),同時(shí)進(jìn)一步為梨果實(shí)中香氣成分測(cè)定提供一定數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

不同種間雜交品種梨果 來(lái)自國(guó)家梨產(chǎn)業(yè)體系試驗(yàn)站,所有參試?yán)婀墒於纫恢?、無(wú)機(jī)械損傷和病蟲(chóng)害;早金酥(蘋(píng)果梨×身不知) 來(lái)自于遼寧營(yíng)口試驗(yàn)站;紅早酥(蘋(píng)果梨×身不知) 來(lái)自于河南鄭州試驗(yàn)站;玉露香(庫(kù)爾勒香梨×雪花梨)、早酥(蘋(píng)果梨×身不知) 來(lái)自于甘肅蘭州試驗(yàn)站;黃冠(雪花梨×新世紀(jì)) 來(lái)自于河北昌黎試驗(yàn)站;2-壬酮(99.0%) 德國(guó)Dr. Ehrensorfer公司;甲醇(HPLC級(jí)) 美國(guó)Fisher公司。

Agilent 7890A氣相色譜儀(配備Agilent 5977 MSD質(zhì)譜儀) 美國(guó)安捷倫公司;SUPELCO固相微萃取裝置(包括50/30 μm DVB/CAR/PDMS、85 μm Carboxen/PDMS、75 μm Carboxen/PDMS、100 μm PDMS、85 μm Polyacrylate五種萃取頭) 美國(guó)色譜科公司;CORNING PC-420 D磁力攪拌器 美國(guó)康寧公司;Sartorius BSA224S-CW分析天平 德國(guó)賽多利斯公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 稱取0.1 g(精確至0.0001 g)2-壬酮標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇定容至10 mL,配制成10000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液;將2-壬酮用甲醇稀釋至200 mg/L備用;所有標(biāo)準(zhǔn)溶液于-18 ℃冰箱中貯存。

1.2.2 氣相色譜質(zhì)譜條件 參照已有測(cè)試方法[18]調(diào)整程序升溫設(shè)置條件,確定色譜質(zhì)譜方法如下:色譜Agilent 7890A氣相色譜儀串聯(lián)5977 MSD質(zhì)譜儀測(cè)定;色譜條件為:色譜柱為DB-5 ms(30 m×250 μm×0.25 μm),升溫程序:起始溫度30 ℃,保持2 min;以3 ℃/min的速度升至102 ℃,以2 ℃/min的速度,升至126 ℃,以1 ℃/min的速度,升至148 ℃,以4 ℃/min的速度,升至190 ℃,再以10 ℃/min的速度,升至270 ℃并保持3 min;載氣為高純氦氣,流速為1 mL/min;進(jìn)樣口、檢測(cè)器和連接桿溫度分別為270、270和280 ℃;質(zhì)譜條件為:質(zhì)譜為EI離子源,電子能量70 eV,電子倍增器電壓1382.3 V,掃描范圍為45～450 amu,離子源溫度230 ℃,四級(jí)桿溫度150 ℃;電子能量模式:全程掃描。

1.2.3 揮發(fā)性香氣成分萃取與檢測(cè) 按照四分法將每個(gè)梨果劃分為4部分,隨機(jī)選擇梨果的一個(gè)部分豎切0.5 cm厚的梨片,去掉核果,每次取5個(gè)梨果上果肉,帶皮切成0.5 cm×0.5 cm梨塊,混合均勻,取6 g裝入萃取瓶中,加入50 μL 200 mg/L 2-壬酮于梨塊上,蓋緊塞子靜置10 min,在40 ℃條件下萃取40 min,然后將固相微萃取頭插入氣相色譜端進(jìn)樣口,于270 ℃下解析10 min,在1.2.2條件下進(jìn)行檢測(cè)。每個(gè)品種梨果重復(fù)試驗(yàn)3次。

定性分析:各色譜峰的質(zhì)譜碎片首先經(jīng)NIST/WILEY.11檢索,選擇匹配度大于80%揮發(fā)性香氣物質(zhì)。然后按照1.2.3步驟對(duì)50 μL 200 mg/L(C5～C20)正構(gòu)烷烴混標(biāo)進(jìn)行測(cè)試,得到正構(gòu)烷烴保留時(shí)間,參照公式[14]計(jì)算各香氣組分的保留指數(shù),同時(shí)根據(jù)文獻(xiàn)中的保留指數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行確認(rèn)。

單一線性程序升溫的條件下保留指數(shù)計(jì)算公式為:

式中:RI-待測(cè)組分保留指數(shù);RTunknown-待測(cè)組分保留時(shí)間;RTn、RTn+1-待測(cè)組分前后正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間;n-正構(gòu)烷烴的碳數(shù)。

定量分析:采用內(nèi)標(biāo)定量。以2-壬酮作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行濃度計(jì)算,其濃度為200 mg/L,體積50 μL。計(jì)算公式參照秦改花[13]等的方法,各香氣組分含量(ng/g)=[各組分的峰面積/內(nèi)標(biāo)的峰面積×內(nèi)標(biāo)濃度(mg/L)×50 μL]×1000/樣品量(g)。所有計(jì)算數(shù)據(jù)均為1.3.3中測(cè)試數(shù)據(jù)的平均值。

統(tǒng)計(jì)分析:采用SPSS 22.0進(jìn)行主成分分析(PCA)分析及聚類分析(CA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 萃取條件優(yōu)化

2.1.1 固相微萃取頭的選擇 固相微萃取是影響揮發(fā)性芳香物質(zhì)萃取效果的核心因素[14],其選擇取決于化學(xué)物特性。由此本實(shí)驗(yàn)首先考察50/30 μm DVB/CAR/PDMS、65 μm PDMS/DVB、75 μm Carboxen/PDMS、100 μm PDMS、85 μm Polyacrylate五種萃取頭對(duì)梨果揮發(fā)性芳香物質(zhì)萃取的效果,通過(guò)揮發(fā)性芳香物質(zhì)的總數(shù)及總量、不同類型揮發(fā)性芳香物質(zhì)的所占比例及數(shù)量確定最佳的固相微萃取頭,試驗(yàn)以早金酥梨為基質(zhì)。

分析發(fā)現(xiàn),五種萃取頭萃取中50/30 μm DVB/CAR/PDMS、75 μmCarboxen/PDMS兩種萃取頭能夠萃取的香氣物質(zhì)的總量相差不大,且含量較高,分別為1839.5、1847.9 ng/g,其次為65 μm PDMS/DVB萃取頭(1647.2 ng/g),均遠(yuǎn)大于100 μm PDMS(936.4 ng/g)、85 μm Polyacrylate(891.5 ng/g)萃取頭;由表1中看出,50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭萃取的香氣物質(zhì)種類多達(dá)60種,其次是65 μm PDMS/DVB萃取頭、75 μm Carboxen/PDMS萃取頭,均明顯多于100 μm PDMS、85 μm Polyacrylate萃取頭。從不同類型揮發(fā)性芳香物質(zhì)的相對(duì)百分含量及種數(shù)來(lái)看,75 μm Carboxen/PDMS萃取的酯類物質(zhì)的相對(duì)含量、種類均高于其他四種萃取頭,相對(duì)含量高達(dá)86.92%,但其烯烴類物質(zhì)的相對(duì)含量非常低、種數(shù)較少;50/30 μm DVB/CAR/PDMS、65 μm PDMS/DVB萃取的酯類物質(zhì)的相對(duì)含量高于50%,均高于100 μm PDMS萃取頭和85 μm Polyacrylate萃取頭,這四種萃取頭的烯烴類物質(zhì)的相對(duì)含量在20.23%～45.30%,其中50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取的烯烴類物質(zhì)的種類最多,含量低于100 μm PDMS萃取頭,但高于其余兩種萃取頭;此外,50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取的醇類、醛類物質(zhì)的相對(duì)含量高于其他四種微萃取頭,同時(shí)其萃取的醛類物質(zhì)與酮類物質(zhì)的種數(shù)多于其他四種微萃取頭。不同類型的香氣成分以一定比例組合構(gòu)成不同梨果的特殊風(fēng)味[13],每種類型都是梨果風(fēng)味必不可少的一部分。由此綜合考慮確定50/30 μm DVB/CAR/PDMS纖維頭為最佳萃取頭。

表1 萃取頭種類對(duì)不同類型揮發(fā)性芳香物質(zhì)的萃取效果的影響Table 1 The effect of different extraction head on extractive effect of different types of volatile aromatic compounds

2.1.2 萃取溫度對(duì)萃取效果的影響 溫度作為催化劑,對(duì)各類揮發(fā)性芳香物質(zhì)在微萃取頭的吸附均有明顯影響。由此本實(shí)驗(yàn)在30～50 ℃之間,每5 ℃設(shè)置溫度梯度進(jìn)行研究,考察不同溫度條件下50/30 μm DVB/CAR/PDMS纖維頭萃取香氣物質(zhì)的種數(shù)及總含量的變化。由圖1看出,揮發(fā)性香氣物質(zhì)的種數(shù)隨著溫度的升高顯著增加,當(dāng)溫度為40 ℃或者更高時(shí),其種數(shù)基本在57～61種之間;揮發(fā)性香氣物質(zhì)的總含量隨著溫度的升高明顯增加,且一直處于增加狀態(tài),當(dāng)溫度高于40 ℃后,其增加緩慢。過(guò)高的溫度會(huì)使萃取效率下降[18],影響梨塊的風(fēng)味,同時(shí)加快褐變程度。由此最終確定40 ℃為最佳萃取溫度。

圖1 萃取溫度對(duì)揮發(fā)性芳香物質(zhì)的萃取效果的影響Fig.1 The effect of temperature on extractiveeffect of aromatic substances

2.1.3 萃取時(shí)間對(duì)萃取效果的影響 分析物在樣品與涂層之間達(dá)到平衡需要一定時(shí)間,通常萃取過(guò)程均在剛開(kāi)始時(shí)萃取頭的吸附量迅速增加,當(dāng)其達(dá)到一定狀態(tài)的時(shí)候萃取量的增加就趨于平緩[18]。由此,本實(shí)驗(yàn)在20～60 min之間每10 min設(shè)置時(shí)間梯度進(jìn)行研究。根據(jù)文獻(xiàn)[3,13-14]及試驗(yàn)中香氣物質(zhì)的含量情況,選擇梨果中主要香氣成分考察萃取時(shí)間對(duì)萃取效果的影響,由圖2看出,己酸乙酯、乙酸乙酯含量具有一定的波動(dòng),受萃取時(shí)間影響不大;乙酸丁酯含量略有下降,在40 min之后穩(wěn)定;丁酸己酯含量不斷增加;其他香氣成分含量在萃取時(shí)間為40 min時(shí)萃取效果最好,或者40 min之后相對(duì)較為穩(wěn)定。由此確定40 min為最優(yōu)萃取時(shí)間。

圖2 萃取時(shí)間對(duì)揮發(fā)性芳香物質(zhì)的萃取效果的影響Fig.2 The effect of extraction timeon extractive effect of aromatic substances注:a:乙酸己酯;b:α-法呢烯;c:己酸乙酯;d:乙酸乙酯;e:E-2-己烯醛;f:乙酸丁酯;g:癸酸乙酯;h:庚酸乙酯;i:辛酸甲酯;j:丁酸己酯。

2.2 梨果實(shí)揮發(fā)性香氣物質(zhì)的GC-MS分析

早金酥、紅早酥、玉露香、早酥、黃冠等品種的香氣成分GC/MS總離子流圖見(jiàn)圖3～圖7。通過(guò)NIST/WILEY.11譜庫(kù)檢索,同時(shí)結(jié)合保留時(shí)間指數(shù)計(jì)算與比對(duì)確定了受檢梨果的主要香氣成分及含量(表2)、不同種間雜交梨果中不同類型香氣成分的相對(duì)含量及種數(shù)(表3)。經(jīng)統(tǒng)計(jì),5種梨果中共檢出122種香氣成分,主要包括52種酯類、23種烯烴類、12種烷烴類、11種芳烴類、9種醛類、6種醇類、3種酮類及6種其他類等物質(zhì)。從香氣含量上看,黃冠梨中香氣總量最高,為7048.60 ng/g,是其他四種梨果的4～5倍;其次是早金酥(1839.52 ng/g)、紅早酥(1548.68 ng/g),均高于早酥(1493.99 ng/g)和玉露香(1450.74 ng/g);從香氣數(shù)量上看,早金酥梨果香氣種數(shù)最多(60種),其次是黃冠梨(54種),早酥梨香氣種數(shù)最少(44種),略少于紅早酥(45種)和玉露香(48種);黃冠梨與早金酥梨是參試?yán)婀袡z出香氣含量較高、香氣數(shù)量較多的梨果。

表2 不同種間雜交品種梨果的香氣組成及含量Table 2 Aroma composition and content of pear of interspecific hybridization

續(xù)表

續(xù)表

續(xù)表

表3 不同種間雜交梨果中不同類型香氣成分的相對(duì)含量及種數(shù)Table 3 The relative content and number of different types of aroma components in interspecific hybridization pears

圖3 黃冠梨果香氣成分總離子圖Fig.3 Total ion chromatograms of aromaticcomponents of Huangguan pear

圖4 早金酥梨果香氣成分總離子圖Fig.4 Total ion chromatograms of aromaticcomponents of Zaojinsu pear

圖5 早酥梨果香氣成分總離子圖Fig.5 Total ion chromatograms of aromaticcomponents of Zaosu pear

圖6 紅早酥梨果香氣成分總離子圖Fig.6 Total ion chromatograms of aromaticcomponents of Hongzaosu pear

圖7 玉露香梨果香氣成分總離子圖Fig.7 Total ion chromatograms of aromaticcomponents of Yuluxiang pear

2.2.1 酯類物質(zhì) 本文共鑒定出52種酯類,每種梨果中酯類物質(zhì)含量在290.62～5115.82 ng/g,占總揮發(fā)物的19.45%～72.58%。黃冠梨和早金酥梨中酯類物質(zhì)所占比例均大于50%,其中黃冠梨中比例高達(dá)72.58%;其次是紅早酥和玉露香,早酥梨中相對(duì)含量最小。黃冠梨和玉露香中酯類總數(shù)在30種左右,其次是早金酥梨,均多于紅早酥和早酥梨。不論從相對(duì)含量還是種數(shù)上看,酯類物質(zhì)都是參試?yán)婀兄饕銡馕镔|(zhì)之一。各個(gè)梨果中共有香氣成分為乙酸己酯、丁酸己酯、己酸己酯,其中乙酸己酯的含量在213.68～1766.91 ng/g之間,在每種梨果的酯類香氣中均占最高比例,具有草莓、青草、蘋(píng)果的氣味[19]。有文獻(xiàn)報(bào)道,C10以下的酯類具有水果的風(fēng)味,相比長(zhǎng)鏈脂肪酸酯風(fēng)味閾值較低,在酯類香氣構(gòu)成中發(fā)揮主要作用[20]。在本研究中,除(E,Z)-2,4-癸二烯酸乙酯、鄰苯二甲酸二異丁酯、辛酸乙酯、己酸己酯、癸酸乙酯外,上述各個(gè)梨果中含量較高的酯類物質(zhì)的碳數(shù)均在10以下。碳數(shù)較高酯類中(E,Z)-2,4-癸二烯酸乙酯僅在黃冠梨中檢出,含量較高,為123.99 ng/g,具有果香,似梨子香[19],是西洋梨“巴梨”中主要特征香氣組分[21],是秋子梨中重要特征香氣組分[13];鄰苯二甲酸二異丁酯在黃冠梨及早金酥中鑒定出,含量分別為78.34、11.23 ng/g。此外,本研究還在早金酥梨果中鑒定出棕櫚酸甲酯,但含量較低,僅為0.36 ng/g。本文鑒定的酯類物質(zhì)中有21種含有不飽和碳碳雙鍵的烯酯,其中(E,Z)-2,4-癸二烯酸乙酯、(E)-3-己烯-1-醇乙酸酯、(Z)-2-己烯-1-醇乙酸酯、(E)-2-己烯-1-醇乙酸酯、2-甲基-2-丁烯酸乙酯含量較高。

2.2.2 烴類物質(zhì) 本文鑒定出12種烷烴,但其含量相對(duì)很低,為2.48～25.62 ng/g,占總揮發(fā)物的0.16%～1.16%。其中包括C11～C20系列正構(gòu)烷烴,同時(shí)還有三種環(huán)烷烴,丁基環(huán)己烷、戊基環(huán)戊烷及辛基環(huán)丙烷。烯烴類物質(zhì)共鑒定出23種,與酯類含量所占比例之和均大于74%,在梨果中含量在412.89～1630.99 ng/g,占揮發(fā)性物總量的22.45%～65.88%,同樣是本文參試?yán)婀闹饕獡]發(fā)性香氣化合物,其包括脂肪族烯烴(4種)、芳香族烯烴(1種)、萜烯(18種)。早酥梨中烯烴類物質(zhì)相對(duì)含量最高,高達(dá)65.88%,其次是紅早酥(49.92%)和玉露香(38.14%),黃冠梨和早金酥梨果中相對(duì)含量接近,且較低,分別為23.14%、22.45%。萜烯類物質(zhì)在所有烯烴類物質(zhì)中含量最高,包括單萜(1種)和倍半萜(17種),其由異戊二烯衍生成的一類天然化合物,呈現(xiàn)出木質(zhì)氣味、一定的花香味[22]。紅早酥和玉露香中鑒定出單萜化合物檸檬烯,含量分別為1.27、2.24 ng/g,其主要存在于柑橘類水果中,貢獻(xiàn)檸檬樣香氣[23]。五種梨中共有的倍半萜物質(zhì)為α-法呢烯和Α-姜黃烯,其中α-法呢烯是所有烯烴類物質(zhì)中含量最高的物質(zhì),其含量在316.08～1363.41 ng/g之間,具有花香氣味[24],廣泛存在于水果中[22-25];A-姜黃烯的含量在3.41～34.67 ng/g之間,首次在梨中發(fā)現(xiàn)。本研究還鑒定出了α-法呢烯的3種同分異構(gòu)體,分別為(E,Z)-α-法呢烯、(Z,E)-α-法呢烯和(Z,Z)-α-法呢烯,西洋梨中也發(fā)現(xiàn)部分α-法呢烯的同分異構(gòu)體[25]。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)2種β-法呢烯異構(gòu)體,黃冠梨與玉露香梨中鑒定出(Z)-β-法呢烯,其余三種梨果中鑒定出(E)-β-法呢烯。本文在參試?yán)婀惺状舞b定出發(fā)現(xiàn)2,6-二甲基-6-(4-甲基-3-戊烯基)雙環(huán)[3.1.1]庚-2-烯、(-)-大根香葉烯、白菖烯、姜烯、(+)-喇叭烯等物質(zhì),這些在多種受檢梨果都有檢出,這些物質(zhì)的含量均高于1.45 ng/g;其中2,6-二甲基-6-(4-甲基-3-戊烯基)雙環(huán)[3.1.1]庚-2-烯含量較高,為14.27～38.15 ng/g,除黃冠梨外,其余四種梨果中均有檢出。本研究還鑒定出α-雪松烯、脫氫香橙烯、γ-杜松烯;除玉露香外,其余四種梨果中均檢出α-雪松烯,含量在22.96～71.85 ng/g;脫氫香橙烯、γ-杜松烯分別在紅早酥(0.82 ng/g)、早金酥(3.19 ng/g)中檢出;有專家在梨果中也曾檢出過(guò)這三種物質(zhì)[25-26]。此外,本研究共鑒定11種芳烴化合物,其在梨果中總含量在1.60～29.36 ng/g,占總揮發(fā)物的0.03%～1.97%,主要為苯同源化合物及多環(huán)芳烴類。

與飽和烴類相比,烯烴類物質(zhì)閾值較低[27],且在受檢梨果中的含量普遍較高,由此說(shuō)明其對(duì)本文受檢梨果香氣具有較為重要的貢獻(xiàn)作用。

2.2.3 醇類物質(zhì) 5種梨果中共發(fā)現(xiàn)6種醇類物質(zhì),總含量在15.80～206.48 ng/g,占梨果總揮發(fā)物的1.02%～14.23%。玉露香中檢出種數(shù)為3種,所占比例最高,為14.23%,紅早酥中種數(shù)最多(4種),但是僅占梨果總揮發(fā)物的1.02%;其余梨果均檢出2種醇類物質(zhì),所占比例為1.87%～8.24%。正己醇是主要的醇類化合物,除紅早酥外,其余梨果中均有檢出,玉露香中最高183.50 ng/g,其次是早金酥和黃冠,含量分別為132.76和121.97 ng/g,早酥梨中最低,為64.10 ng/g。早酥、紅早酥及玉露香中還鑒定出(E)-2-己烯-1-醇,含量為7.94～22.14 ng/g。有文獻(xiàn)報(bào)道C6醇類是主要醇類化合物,具有青草味[13]。此外,本文黃冠、早金酥梨中還鑒定出2-乙基己醇,含量分別為10.15、18.87 ng/g;紅早酥中鑒定出碳數(shù)大于6的直鏈醇有正庚醇、正辛醇、正壬醇,含量分別為0.27、0.61、0.26 ng/g,其中正庚醇具有青草香、甜木香及芍藥香[19];正辛醇具有脂肪、蘑菇香氣[19];正壬醇有柑橘香、脂肪氣味[19];同時(shí)本文還在玉露香中鑒定出正壬醇,含量較低,為0.84 ng/g。

2.2.4 醛酮類物質(zhì) 醛類化合物是受檢梨果中第三大揮發(fā)性香氣物質(zhì),含量范圍22.25～191.95 ng/g,占梨果總揮發(fā)物的0.32%～11.0%。由表3看出,早金酥中醛類數(shù)量最多(6種),占總揮發(fā)物的10.44%,其次是紅早酥(5種),占總揮發(fā)物的11%,其余三種梨果僅檢測(cè)出3種醛類化合物。C6醛類被認(rèn)為是青香型化合物的代表[13],本研究中共檢出三種C6醛,其中己醛含量最高,濃度范圍為42.21～115.74 ng/g,(E)-2-己醛含量(17.67～61.15 ng/g)次之,除黃冠梨外,其余四種梨果中均含有上述兩種醛類;紅早酥梨中還鑒定出(E,E)-2,4-己二烯醛,含量較低,為2.18 ng/g,貢獻(xiàn)油脂香和草香[19]。C10以上的醛鑒定出4種,癸醛在5種梨果中均能檢測(cè)到,含量為0.91～10.31 ng/g,是花香味及柑橘味氣味[19]的貢獻(xiàn)者。早金酥和紅早酥中檢出十二醛,含量分別為8.56、1.30 ng/g,具有強(qiáng)烈脂肪香氣[19]。十三醛僅在黃冠梨中檢出,含量為10.22 ng/g,具有辛香味[19]。肉豆蔻醛賦予梨果奶油香蠟香和果香[28],本研究中僅在早金酥梨中檢測(cè)到。同時(shí)本文還鑒定出2種苯甲醛類香氣物質(zhì),分別為黃冠中3-乙基苯甲醛(1.72 ng/g)、早金酥中2-乙基苯甲醛(0.73 ng/g)。

本研究共發(fā)現(xiàn)3種酮類化合物,其中6-甲基-5-庚烯-2-酮類化合物是5種梨果中共有的酮類物質(zhì),具有脂肪、綠色、柑橘氣味[19]。此外早金酥梨果中發(fā)現(xiàn)苯乙酮與香葉基丙酮,含量分別為5.99、5.04 ng/g,苯乙酮具有甜香香氣[19],在紅早酥梨果中也有檢出,但含量較低。香葉基丙酮廣泛存在煙草中[29],是具有清香型香氣特征[19],也是茶葉中主要酮類物質(zhì)[30]。

2.2.5 其他類物質(zhì) 5種不同種間雜交梨果中共鑒定出苯甲腈、甲基苯基肟等其他類化合物6種,總含量為4.45～115.36 ng/g,占梨果總揮發(fā)物的0.26%～4.44%。雖然其含量低,但對(duì)梨的整體風(fēng)味也具有重要貢獻(xiàn)。苯甲腈首次是在木瓜葉片中發(fā)現(xiàn)的一種揮發(fā)性香氣物質(zhì)[13],梨果中首次發(fā)現(xiàn)是在秋子梨中[13],本研究中僅在早金酥梨中檢測(cè)到。本文5種梨果中還檢出甲基苯基肟,含量為4.45～115.36 ng/g,黃冠與早金酥梨果中較高,其余三種均低于10 ng/g,有研究在棗花[24]、食用菌[26]及藍(lán)莓[27]中也曾發(fā)現(xiàn)甲氧基苯基肟;在其他類揮發(fā)物中,草蒿腦、茴香腦這兩種醚類化合物也得到了鑒定,草蒿腦呈樹(shù)根香略帶甜味[19],是“錦香”、“福安尖把”、“龍香”和“延邊謝花甜”等梨品種中特有的一種揮發(fā)性芳香物質(zhì)[13];茴香腦是天然辛香料的重要組成成分,具有甘草和草藥味[31],在日照紅茶[32]、釀酒葡萄[33]中均有鑒定。這兩物質(zhì)僅在早酥梨中檢測(cè)到,含量分別為29.60、0.99 ng/g。本文在早酥梨中還鑒定了2種酚類物質(zhì),分別為甲基丁子香酚、2,6-二叔丁基對(duì)甲酚,其中甲基丁子香酚屬于苯丙烷類化合物,貢獻(xiàn)辛香氣味與丁香氣味[34]。2,6-二叔丁基對(duì)甲酚為抗氧化劑,曾在葡萄汁香氣[35]中檢測(cè)到。

2.3 不同梨果香氣物質(zhì)的PCA分析

通過(guò)SPSS 22.0軟件對(duì)5種不同種間雜交的梨樣品中揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行PCA,分析得到各主成分的特征值、方差貢獻(xiàn)率、累積方差貢獻(xiàn)率見(jiàn)表4。從表4可知,特征值大于1的共4個(gè)主成分,總方差100.00%的貢獻(xiàn)率來(lái)自前4個(gè)主成分,其方差貢獻(xiàn)率依次為54.29%、27.27%、13.36%和5.08%;說(shuō)明4個(gè)主成分反映了原始變量的全部信息。

表4 主成分方差貢獻(xiàn)率Table 4 Principal component variance contribution rate

由載荷得分可知,PC1中載荷較高的正影響揮發(fā)性物質(zhì)主要有(E)-3-己烯-1-醇乙酸酯、己酸乙酯、戊酸乙酯、庚酸乙酯、十二烷、苯甲酸乙酯、乙酸庚酯、辛酸乙酯、十三烷、乙酸己酯、十四烷、(-)-大根香葉烯、白菖烯、α-雪松烯、癸醛、Α-姜黃烯、α-法呢烯、甲氧基苯基肟,其中(E)-3-己烯-1-醇乙酸酯的載荷量最高為0.997;載荷較高的負(fù)影響揮發(fā)性物質(zhì)有己醛,其載荷量為0.847。PC2中載荷較高的正影響揮發(fā)性物質(zhì)主要有異戊酸己酯、苯乙酮、己酸己酯、乙酸丁酯、(E)-2-己烯-1-丙酸甲酯、甲基庚烯酮、(E)-2-己烯己酸酯、丁酸己酯,其中異戊酸己酯的載荷量最高為0.985;PC3載荷較高的正影響揮發(fā)性物質(zhì)主要有十一烷、正己醇,其中十一烷載荷量為0.859。

PC1中得分較高的主要是酯類、醛類、烷烴類、烯烴類物質(zhì),PC2中得分較高的主要是酯類和酮類物質(zhì),PC3中得分較高的物質(zhì)為烷烴類和醇類物質(zhì)。由此看出,酯類物質(zhì)、醛類、烷烴類、酮類、烯烴類及醇類物質(zhì)是受檢梨果香氣差異性的主要貢獻(xiàn)物質(zhì)。雖然烷烴類物質(zhì)在梨果中的含量普遍較低,但是對(duì)于梨果香氣差異性貢獻(xiàn)也有不可替代的作用。

2.4 不同梨果香氣物質(zhì)CA分析

通過(guò)SPSS 22.0軟件對(duì)5種不同種間雜交的梨樣品中揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行CA分析,得到了受檢梨果分類樹(shù)狀圖(圖8),如圖顯示受檢梨果主要分為兩個(gè)組,黃冠梨與其他四種梨果明顯不同,沒(méi)有任何交集;早金酥、早酥與紅早酥的雜交親本一致,但是當(dāng)歐氏平方距離越來(lái)越小的時(shí)候,它們也分成不同組,而玉露香梨與早酥梨及紅早酥梨的香氣組成有較為類似的地方,這可能是由于香氣的產(chǎn)生及變化受多種因素的影響而導(dǎo)致的[8-11,36-37]。

圖8 不同種間雜交梨果的聚類分析樹(shù)狀圖Fig.8 Dendrogram plot obtained from clusteranalysis of pear of interspecific hybridization

3 結(jié)論

本文通過(guò)萃取條件的優(yōu)化,確定固相微萃取最優(yōu)條件,實(shí)現(xiàn)不同種間雜交梨果的GC-MS分析。從香氣組分含量上看,酯類與烯烴類物質(zhì)是上述不同種間雜交梨果的主要香氣組分;醇、醛、酮類、飽和烴類及其他類物質(zhì)以其自身的香氣特性同樣對(duì)梨果香氣的貢獻(xiàn)具有不可替代的作用;通過(guò)主成分分析,發(fā)現(xiàn)酯類物質(zhì)、醛類、烷烴類、酮類、烯烴類及醇類物質(zhì)是受檢梨果的香氣差異性的主要貢獻(xiàn)物質(zhì),雖然烷烴類物質(zhì)在梨果中的含量普遍較低,但也是梨果香氣差異性的重要貢獻(xiàn)者;通過(guò)聚類分析發(fā)現(xiàn),受檢梨果主要分為兩個(gè)組,基本與其雜交親本的親緣關(guān)系相一致,但隨著歐氏平方距離的變小,也出現(xiàn)不一致的地方,推測(cè)可能是由于香氣的產(chǎn)生及變化受多種因素的影響而導(dǎo)致的。