熊昌艷，李雪嬌，黃新祥

(江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

傷寒沙門菌(Salmonellaentericaserovar Typhi，S.Typhi)是一種重要的革蘭陰性人類病原菌，可通過多種毒力因子作用，引起輕度腹瀉甚至是嚴(yán)重的全身性感染.沙門氏菌毒力基因的集中區(qū)域被稱為沙門氏菌致病島(Salmonellapathogenicityislands，SPIs)，可位于細(xì)菌染色體或質(zhì)粒上.S.Typhi與宿主能產(chǎn)生交互作用，有些毒力基因能保護細(xì)菌免受宿主免疫系統(tǒng)的攻擊[1-2]．

病原菌在感染過程中通過調(diào)控其毒力基因的表達，可以快速適應(yīng)環(huán)境的變化.許多非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)通過堿基配對相互作用形成與DNA或蛋白質(zhì)的復(fù)合物，參與復(fù)雜的基因表達調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò).以前，許多ncRNA被認(rèn)為是不參與蛋白質(zhì)編碼的轉(zhuǎn)錄噪聲，然而近年研究已經(jīng)證實，大多數(shù)ncRNA可通過調(diào)節(jié)細(xì)菌中許多基因的表達來發(fā)揮生理作用，包括ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)、群體感應(yīng)、氧化應(yīng)激、耐酸性能和毒力等[3-4]．

前期本實驗室對傷寒沙門菌野生株進行了全基因組序列分析，獲得了基因組結(jié)構(gòu)精細(xì)圖.通過轉(zhuǎn)錄組序列分析發(fā)現(xiàn)有大量ncRNA序列位于一千余個基因的反義鏈上，有的拼接長度甚至超過了1 000 nt.ArpH就是新發(fā)現(xiàn)的ncRNA之一，前期研究確定其分子全長為3 508 nt，位于基因rpoH對側(cè)鏈，5′端位于yhhk起始密碼子上游411 nt，3′端位于rpoH起始密碼子上游238 nt，與rpoH完全重疊，為rpoH的反義RNA，因此命名為ArpH.研究發(fā)現(xiàn)ArpH高表達后能提高rpoHmRNA表達水平[5].RpoH是由rpoH基因編碼的σ32(σH)，現(xiàn)已知腸道細(xì)菌的σ因子之間存在相互作用，如RpoE可促進RpoH和RpoS的表達[6-7].RpoH能激活小RNA的伴侶分子基因hfq的表達，而Hfq也可調(diào)節(jié)RpoH介導(dǎo)的環(huán)境應(yīng)答反應(yīng).在沙門菌中也發(fā)現(xiàn)RpoH和RpoE可促進抗氧化作用[8].高滲應(yīng)激可激活大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌中依賴σE和σS的基因表達.σE是一種啟動一系列基因轉(zhuǎn)錄并對應(yīng)激作出反應(yīng)的細(xì)胞外因子.而σS是極端條件下細(xì)菌生存和發(fā)揮毒力所需的主要調(diào)節(jié)因子[7].另外，原核生物體內(nèi)ncRNA的含量除了與其表達生成有關(guān)，與其降解也有重要關(guān)系.細(xì)菌體內(nèi)存在多種RNase來降解RNA.本文通過研究σ因子和RNase對ArpH表達的影響，并結(jié)合全基因組芯片的結(jié)果，初步探討ArpH對細(xì)菌侵襲力和胞內(nèi)生存力的影響．

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 菌株：S.Typhi 野生株GIFU 10007 (WT)，σE缺陷株 (ΔrpoE)[6]，σS缺陷株 (ΔrpoS)[7]，RNase III缺陷株(ΔRNase III)[9]，RNase G缺陷株(ΔRNase G)[9]，RNase E缺陷株(ΔRNase E)[9]由本實驗室保存，缺陷株使用自殺質(zhì)粒法制備.arpH缺陷株 (ΔarpH)，WT-pBAD (WT含pBAD/Myc-hisA)，WT-pBAD-arpH(WT含pBAD-arpH) 由本實驗室制備[5]．

質(zhì)粒：pBAD/Myc-hisA (Ampr)購自Invitrogen公司，pBAD-arpH(pBAD/Myc-hisA連接了arpH序列) 由本實驗室制備[5]．

1.1.2 主要試劑DNA聚合酶Taq、T4 DNA連接酶(Takara公司)；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)；RNA提取試劑盒 (QIAGEN公司)；PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 (Takara公司)；Cy3-dCTP、Cy5-dCTP(Amersham公司)；傷寒沙門菌基因組芯片由本實驗室制備[10]．

1.1.3 主要儀器電穿孔系統(tǒng)Gene Pulsero Ⅱ(Bio-Rad公司)；PCR儀2720 Thermal Cycler (ABI公司)；實時熒光定量PCR儀CFX96TMReal-Time System (Bio-Rad公司)；基因芯片雜交儀hydridiser HB-3d(Roller-Blot公司)；基因芯片掃描分析系統(tǒng)Genepix personal 4100A (Axon Instruments公司)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱MODEL 3111 S/N 305713-7757(Thermo公司)．

1.1.4 引物利用Oligo6軟件，根據(jù)arpH的核苷酸序列設(shè)計qRT-PCR特異性引物ArpH-qF和ArpH-qR.5S rRNA為內(nèi)參.qRT-PCR引物見表1．

表1 本研究中所用引物序列Tab.1 The sequence of primers used in this study

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng)及RNA提取 將單克隆細(xì)菌于LB液體37 ℃過夜培養(yǎng)，按1∶100轉(zhuǎn)接于相同條件LB液體培養(yǎng)基，需要時加入0.2%L-阿拉伯糖誘導(dǎo)30 min.采用TRIzol法提取細(xì)菌總RNA后，用DNase I(RNase free)去除混雜的少量DNA，酚仿-乙醇法純化.取適量RNA用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量．

1.2.2 qRT-PCR分析 各取純化的總RNA 4 μg，用PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 (Takara公司)分別反轉(zhuǎn)錄生成cDNA后，再進行qRT-PCR.內(nèi)參基因為5S rRNA，用于qRT-PCR分析的引物序列如表1所示.每次實驗均按照說明書進行3次．

1.2.3 全基因組芯片檢測 將WT-pBAD、WT-pBAD-ArpH培養(yǎng)至對數(shù)期 (A600為0.4) 后加入2 g·L-1L-阿拉伯糖誘導(dǎo)30 min，然后在氧應(yīng)激下(H2O25 mmol·L-1)的LB中37 ℃振蕩(250 r·min-1)培養(yǎng)4 h，總RNA用RNA提取試劑盒提取.取上述菌株的總RNA各20 μg進行逆轉(zhuǎn)錄，用隨機引物N9、傷寒沙門菌GNP引物和PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，反轉(zhuǎn)錄生成cDNAs的同時摻入Cy3-dCTP或Cy5-dCTP，將cDNAs進行相互配對并標(biāo)記，經(jīng)提純后與S.Typhi基因組DNA芯片進行雜交，清洗后用雙通道熒光掃描，將熒光信號進行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換并經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理后行統(tǒng)計分析[11]．

1.2.4 HeLa細(xì)胞侵襲實驗 用含10%小牛血清的RIPM-1640于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HeLa細(xì)胞，實驗前24 h按每孔2×105接種于24孔.將S.Typhi野生株(WT)、ArpH缺陷變異株(ΔarpH)、空質(zhì)粒對照株(WT-pBAD)和ArpH高表達菌株(WT-pBAD-ArpH)培養(yǎng)至對數(shù)生長期，按20∶1的細(xì)菌與細(xì)胞比(multiplicity of infection，MOI)分別加入24孔板，培養(yǎng)90 min(37 ℃、5% CO2)，以預(yù)熱的PBS洗細(xì)胞3次后，加入0.1% PBS-DOC作用10 min破膜，將破膜液中的細(xì)菌收集起來涂抹于LB平板，經(jīng)37 ℃溫箱培養(yǎng)12 h后計算菌落數(shù)(t0)；平行板每孔再加入終濃度為100 μg·mL-1的慶大霉素，再培養(yǎng)(37 ℃，5% CO2)，讓細(xì)菌侵襲HeLa細(xì)胞，90 min后加入1% Triton X-100作用10 min破膜，收集破膜液中的細(xì)菌，涂LB平板，37 ℃過夜培養(yǎng)后計數(shù)菌落數(shù)(t90).以菌落數(shù)t90/t0的比值作為細(xì)菌的侵襲力指標(biāo)．

1.2.5 巨噬細(xì)胞內(nèi)增殖試驗 將THP-1單核細(xì)胞用含10%小牛血清的RIPM-1640培養(yǎng)基于24孔板培養(yǎng)(37 ℃，5% CO2)，加100 ng·mL-1PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate)培養(yǎng)24 h，誘導(dǎo)成巨噬細(xì)胞.將WT、ΔarpH及WT-pBAD、WT-pBAD-ArpH培養(yǎng)至對數(shù)生長期，WT-pBAD、WT-pBAD-ArpH加入0.2% L-阿拉伯糖誘導(dǎo)1 h，按細(xì)菌與細(xì)胞比20∶1，分別加入含巨噬細(xì)胞的24孔板，感染30 min后，每孔再加入慶大霉素(終濃度100 μg·mL-1)1 h以殺死胞外菌，吸取上清，用PBS將每孔吹洗3次.一部分孔加入1 mL 0.5%(V/V)Triton裂解細(xì)胞，反應(yīng)10 min后將裂解物涂于LB平板，37 ℃過夜培養(yǎng)后的單克隆數(shù)用t0表示基礎(chǔ)細(xì)菌吞噬水平；另一部分孔細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)12或24 h后同樣以1 mL 0.5%(V/V)Triton裂解細(xì)胞，過夜培養(yǎng)后計算克隆數(shù)代表胞內(nèi)細(xì)菌增殖水平(以t12或t24表示).細(xì)菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)生存12 h及24 h的增殖力分別以t12/t0及t24/t0表示．

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)分析用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示3個獨立實驗的平均值.利用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析，組間差異采用方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義．

2 結(jié)果

2.1 RpoE和RpoS在不同應(yīng)激條件下對ArpH表達的影響

應(yīng)用qRT-PCR分析野生株和rpoE、rpoS缺陷株在等滲非應(yīng)激條件和環(huán)境酸、氧和高滲應(yīng)激下ArpH的mRNA表達水平.結(jié)果顯示(圖1)，ArpH表達在酸應(yīng)激下明顯下降，在氧和高滲應(yīng)激下略有增高.在rpoE缺陷株中，ArpH的表達水平在各種條件下均有明顯下降.在rpoS缺陷株中，ArpH表達水平在氧應(yīng)激時下降較為明顯．

No Stress:無應(yīng)激;HCl:酸應(yīng)激;H2O2:氧應(yīng)激;NaCl:高滲應(yīng)激.*為P<0.05，**為P<0.01圖1 qRT-PCR檢測在WT、ΔrpoE和ΔrpoS中不同應(yīng)激下ArpH的mRNA表達水平Fig.1 The mRNAexpression of ArpH in WT and mutants at different stresses

2.2 RNase III、RNase G和RNase E對ArpH降解的影響

S.Typhi野生株、RNase III、RNase G、RNase E缺陷變異株培養(yǎng)至A600=0.8后，經(jīng)利福平處理0、5、10、20 min，RNase III缺陷株中ArpH水平明顯高于野生株，而RNase G和RNase E這兩種RNA酶缺陷株中ArpH水平無明顯差異(圖2)．

圖2 WT、RNase III、RNase G和RNase E缺陷株中不同時間的ArpH水平(**為P<0.01)Fig.2 The ArpH levels at different times in WT，RNase III，RNase G and RNase E deficient strains

2.3 ArpH高表達菌株氧應(yīng)激下的基因表達譜分析

將空質(zhì)粒對照株(WT-pBAD)和ArpH高表達菌株(WT-pBAD-arpH)培養(yǎng)至對數(shù)期(A600為0.4)后加入質(zhì)量濃度為2 g·L-1的阿拉伯糖誘導(dǎo)30 min，然后在氧應(yīng)激下的繼續(xù)培養(yǎng)4 h.提取RNA后，經(jīng)熒光標(biāo)記、逆轉(zhuǎn)錄、芯片雜交等步驟后進行全基因組芯片分析.數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示(表2)，和空質(zhì)粒對照株比較，ArpH高表達菌株中基因表達有顯著差異的基因共113個，包括89個上調(diào)基因和24個下調(diào)基因.上調(diào)的基因主要涉及鞭毛相關(guān)基因flhDC、fliACJHLSZ和鞭毛基體修飾蛋白基因flgBCDEFHIJKL，超氧化物歧化酶sodB等.下調(diào)的基因主要涉及致病島1效應(yīng)蛋白prgHIK、sipACD，侵襲相關(guān)基因iagA、invAG、tviACDE、spaIKMN和營養(yǎng)代謝相關(guān)基因astB、msyB和glpD等．

表2 空質(zhì)粒對照株和ArpH高表達菌株在氧應(yīng)激下的部分差異表達基因Tab.2 Differential genes in control strain and ArpH overexpressing strain of S.Typhi induced by H2O2

續(xù)表2

2.4 ArpH對細(xì)菌侵襲HeLa細(xì)胞活性的影響

為了探討ArpH對傷寒沙門菌侵襲上皮細(xì)胞的能力，應(yīng)用S.Typhi野生株(WT)、ArpH缺陷變異株(ΔarpH)、空質(zhì)粒對照株(WT-pBAD)和ArpH高表達菌株(WT-pBAD-arpH)對HeLa細(xì)胞進行侵襲實驗(圖3).當(dāng)arpH基因缺失后，缺陷株的侵襲水平明顯強于野生株，約為野生株的1.5倍，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05).與空質(zhì)粒對照株相比，ArpH高表達菌株的侵襲能力下降且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)．

圖3 ArpH各菌株對HeLa上皮細(xì)胞侵襲力的影響(*為P<0.05)Fig.3 Invasion of HeLa cells by wild-type，ΔarpH，and WT-pBAD-arpH strains

2.5 ArpH對細(xì)菌在THP-1胞內(nèi)生存力的影響

為了觀察ArpH是否會對細(xì)菌在THP-1細(xì)胞內(nèi)生存產(chǎn)生影響，應(yīng)用WT、ΔarpH、WT-pBAD和WT-pBAD-arpH菌株進行THP-1細(xì)胞內(nèi)生存實驗.與時間零點的胞內(nèi)細(xì)菌初始水平相比，野生株、空質(zhì)粒對照株在感染12 h和24 h后的細(xì)菌水平均達到3倍以上，且此兩種菌株的胞內(nèi)增殖趨勢沒有明顯差異.然而，ArpH缺陷變異株在感染12 h和24 h后，其胞內(nèi)細(xì)菌水平則分別為初始水平的1.9 ± 0.3倍和1.2 ± 0.2倍，ArpH高表達菌株在感染12 h和24 h后，其胞內(nèi)細(xì)菌水平則分別為初始水平的5.1 ± 0.5倍和3.7 ± 0.3倍(圖4).另外，細(xì)菌在感染24 h后的胞內(nèi)水平均較12 h有所下降，可能是由于細(xì)菌的感染導(dǎo)致部分細(xì)胞死亡并裂解，其胞內(nèi)的細(xì)菌被釋放到胞外被慶大霉素殺死．

圖4 傷寒沙門菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的生存力比較(**為P<0.01)Fig.4 The intracellular survival ability comparison of S.Typhi in macrophages

3 討論

ncRNA的功能是目前ncRNA研究領(lǐng)域的熱點.ncRNA可以在DNA水平、mRNA水平和蛋白質(zhì)水平上發(fā)揮作用[12].現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)ncRNA具有廣泛的生物學(xué)功能，包括作為信號分子、分子誘餌作用、引導(dǎo)功能和參與組成染色質(zhì)支架等4個方面[13].某些ncRNA的生成具有組織和時間特異性，它們的表達是細(xì)胞針對特定刺激(如細(xì)胞應(yīng)激和溫度等)引起反應(yīng)的產(chǎn)物[14]，這些ncRNA可作為信號分子引起細(xì)胞功能的變化.在此，本文初步探討了前期發(fā)現(xiàn)的ncRNA ArpH的部分表達特征和功能．

細(xì)菌屬原核生物，其基因表達均是由σ因子介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄起始[15].許多ncRNA表達受應(yīng)激反應(yīng)σ因子的正向調(diào)節(jié)，如RpoE和RpoS、雙組分系統(tǒng)PhoP/Q[16].ncRNA通過作用于自己的調(diào)節(jié)子來進行反饋調(diào)控[17].腸道細(xì)菌在高滲應(yīng)激或穩(wěn)態(tài)期條件下，可以誘導(dǎo)產(chǎn)生σE、σH和σS.σH是大腸桿菌中首先被發(fā)現(xiàn)的σ因子.rpoH有4個啟動子，其中一個啟動子rpoH3P可被σE激活[18].本研究模擬體內(nèi)酸、氧和高滲應(yīng)激，檢測了σ因子對ArpH表達的影響，結(jié)果顯示在rpoE缺陷株中，ArpH的表達在各種應(yīng)激條件下均有明顯下降.ArpH作為rpoH對側(cè)鏈的反義RNA[5]，提示ArpH的轉(zhuǎn)錄可能通過RpoE激活RpoH而介導(dǎo).hfq編碼的蛋白是一種能與RNA結(jié)合的調(diào)節(jié)性蛋白，而σH能激活hfq的表達.反之，Hfq也可調(diào)節(jié)σH介導(dǎo)的胞質(zhì)應(yīng)答反應(yīng).同時，Hfq對于rpoS的翻譯也起決定作用.在沙門菌中也發(fā)現(xiàn)，通過增加σS的水平，σH和σE可促進抗氧化作用[19].σS主要與穩(wěn)態(tài)期和應(yīng)激條件下基因的表達相關(guān).前期研究顯示ArpH在對數(shù)晚期至穩(wěn)態(tài)期的表達量最高[5]，表明ArpH的表達有可能受到σS的調(diào)控.本研究在rpoS缺陷株中發(fā)現(xiàn)ArpH的表達水平在氧應(yīng)激時下降較為明顯，這可能是由于σS表達的降低引起σH表達水平的下降，從而導(dǎo)致σH抗氧化作用的減弱，位于rpoH對側(cè)鏈的反義RNA ArpH也隨之下降.這些調(diào)控機制的深入研究可能為控制傷寒沙門菌感染提供有效的靶向基因．

RNase III是一種作用于雙鏈 RNA 的核糖核酸內(nèi)切酶，對 ncRNA 和靶 mRNA 配對的雙鏈區(qū)進行切割，可以同時降解 ncRNA 和其配對的靶 mRNA.而RNase G和RNase E一樣，主要降解單鏈，并且多水解5′末端含有單磷酸基團的 RNA 和富含 AU 堿基的區(qū)域[20-21].ncRNA能保護靶基因mRNA來對抗RNase E的降解[22].本研究分析了RNase III，RNase G和RNase E對ArpH的降解特性.結(jié)果顯示這些RNA酶缺陷株經(jīng)利福平處理后，RNase III缺陷株中ArpH水平明顯高于野生株，而RNase G和RNase E這兩種RNA酶缺陷株中ArpH水平無明顯差異，以上表明RNase III可能是ArpH的主要降解酶.ArpH主要以ArpH/RpoH雙鏈形式被降解，提示ArpH可能參與調(diào)控RpoH mRNA的穩(wěn)定性來影響靶向mRNA的表達．

基因芯片技術(shù)可以對一些ncRNA的主要靶基因進行鑒定[23].前期研究發(fā)現(xiàn)ArpH的高表達能促進S.Typhi在氧應(yīng)激條件下的生長[5].因此，本研究在氧應(yīng)激下對ArpH高表達株應(yīng)用全基因組芯片技術(shù)進行了基因表達譜分析，結(jié)果顯示超氧化物歧化酶sodB基因表達上調(diào)明顯.而sodB對S.Typhi在巨噬細(xì)胞中的生存力具有重要作用.這進一步驗證了ArpH直接或間接調(diào)節(jié)氧應(yīng)激環(huán)境下的某些基因表達.進一步實驗觀察了ArpH對S.Typhi在THP-1細(xì)胞內(nèi)生存力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ArpH可以提高S.Typhi在THP-1的胞內(nèi)生存力，可能是影響S.Typhi細(xì)胞內(nèi)生存的正向調(diào)節(jié)因子，提示ArpH可促進S.Typhi抵抗氧化損傷[24-25].另外，下調(diào)基因中包括致病島1效應(yīng)蛋白prgHIK、sipACD，侵襲相關(guān)基因如iagA、invAG、tviACDE、spaIKMN等.這提示ArpH可能是影響傷寒沙門菌侵襲的負(fù)向調(diào)節(jié)因子.為此，本研究進行了HeLa細(xì)胞侵襲實驗.當(dāng)arpH基因缺失后，菌株的侵襲水平高于野生株，約為野生株的1.5倍.與空質(zhì)粒對照株相比，ArpH高表達株的侵襲能力下降，這表明ArpH可以減弱S.Typhi對上皮細(xì)胞的侵襲能力，可能是影響傷寒沙門菌侵襲的負(fù)向調(diào)節(jié)因子，這與芯片分析結(jié)果一致.ArpH高表達后能提高rpoHmRNA的表達水平[5].ArpH作為rpoH對側(cè)鏈的反義RNA，ArpH對rpoH表達的影響可能通過順式作用在轉(zhuǎn)錄后水平得以實現(xiàn).σH可介導(dǎo)沙門菌SPI-1表達的負(fù)向調(diào)控，從而影響沙門菌對細(xì)胞的侵襲作用.有研究表明，σH分別在轉(zhuǎn)錄前和轉(zhuǎn)錄水平上負(fù)向調(diào)節(jié)HilD和HilA這兩種沙門菌SPI-1特異性的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子[26].因此，ArpH可能通過rpoH來間接調(diào)控鞭毛、侵襲等基因的表達，其具體機制尚待進一步研究.基因芯片還篩選到諸多涉及營養(yǎng)代謝等功能的基因發(fā)生了變化，ArpH對這些基因的調(diào)控機制尚待研究．

本文探討了ArpH的轉(zhuǎn)錄和降解特性，進而分析了ArpH對傷寒沙門菌侵襲力的影響和對胞內(nèi)生存力的作用，研究結(jié)果將增強對傷寒沙門菌在感染環(huán)境下的基因表達調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)和致病機制的認(rèn)識，也為控制細(xì)菌感染提供了新的研究策略．