龐發(fā)虎,徐 鴿,李 敏，謝涵珠，陳兆進

(1.南陽師范學院 農業(yè)工程學院，河南 南陽 473061；2.南水北調中線水源區(qū)水安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 南陽 473061)

發(fā)展可再生能源取代化石能源成為全球共識，其中,生物質能源是可再生能源的重要組成。芒草(Miscanthus)作為第二代能源植物的代表，因其生物量大、纖維素含量高、適應性強、生產成本低等諸多優(yōu)點，被認為是目前最具開發(fā)潛力的高產纖維類能源植物之一，成為國內外研究的熱點[1-4]。土壤和植物體內存在大量的細菌，能通過溶磷、固氮等途徑改善植物營養(yǎng)以及分泌植物激素、鐵載體、特異性酶(ACC脫氨酶等)促進植物在逆境條件下的生長，在植物的生長中起到重要作用[5-7]。因此，開展能源植物不同生境中細菌群落組成，特別是具有促生功能的細菌功能研究具有重要意義[8-9]。FARRAR等[8]系統(tǒng)總結了芒草、甘蔗、楊樹等能源植物內生細菌組成，并指出有效利用植物與有益微生物之間的良好關系，為能源植物在各種生境中的生長提供幫助。關于芒草根際和內生細菌群落組成和功能研究已有開展，COPE-SELBY等[10]對芒草根際、根部、莖部、葉部和種子可培養(yǎng)細菌群落組成進行測定，發(fā)現其由β、γ變形菌門和厚壁菌門3個門、5個科組成，表現出群落組成的豐富性。目前，研究者已從芒草根際、內部分離篩選了細菌資源，包括Bacillusbarbaricus、Lysinibacillusfusiformis、Serratiasp.、Pseudomonassp.等[10]，及PseudomonaskoreensisAGB-1[11]、Azospirillumlipoferum、Herbaspirillum[12]、Azospirillumdoereineraesp.nov.GSF71[13]、HerbaspirillumfrisingenseGSF30[14]、Clostridiumspp.[15]，這些研究結果探明了不同生境中芒草細菌群落組成，并為后續(xù)研究促生細菌促進芒草生長提供了菌種資源[16]。

我國是世界芒草資源分布中心，全世界芒屬植物有14種，中國有7種，并且還有許多不同的變種、生態(tài)型和基因型，種質資源極為豐富[1]。但目前我國不同生境中芒草細菌群落組成研究鮮見報道，限制了有益微生物輔助芒草生長技術的應用，相關工作亟待開展。因此，本研究采用傳統(tǒng)平板分離方法分離篩選、鑒定芒草根際和根部、莖部、葉部內生細菌群落組成，并對其植物促生特性進行測定，以期探明芒草根際、內生可培養(yǎng)細菌多樣性，初步分析其功能，并篩選到具有良好促生效果的菌種資源。

1 材料和方法

1.1 供試材料

芒草于2013年5月種植于河南省南陽國家農業(yè)科技園區(qū)能源植物栽培示范基地(坐標為32°56′45.34″N和112°24′56.28″E)，本試驗于2017年5月15日采集植物，采用抖落法收集根際土壤，芒草植株和收集的土壤樣品分別置于滅菌信封內，運回實驗室用于后續(xù)試驗。

1.2 根際和內生可培養(yǎng)細菌分離純化

采用有氮培養(yǎng)基(YN培養(yǎng)基)[17]和R2A培養(yǎng)基[18]分離芒草根際和內生可培養(yǎng)細菌，具體過程：根際細菌分離采用稀釋梯度平板法，將1.0 g根際土壤加入100 mL無菌水中，稀釋到合適梯度，取100 μL涂布于YN和R2A培養(yǎng)基，培養(yǎng)5 d，平板上生長的為可培養(yǎng)根際細菌。芒草內生菌分離參考文獻[19]的方法，先將芒草分為根部、莖部和葉部，分別稱取9、12、5 g組織，用75%乙醇和2.5%次氯酸鈉各消毒5 min，用無菌水洗滌數遍后置于滅菌研缽中研磨至勻漿，加30 mL磷酸鈉緩沖液稀釋，取100 μL涂布于YN和R2A培養(yǎng)基，培養(yǎng)5 d。根據菌落形態(tài)、顏色、大小分別挑取不同細菌，并在相應平板上劃線純化，純化后的細菌用含25%甘油的培養(yǎng)基于-20 ℃保存，備用。

1.3 DNA提取、PCR擴增及系統(tǒng)進化分析

將菌株接種于分離時對應的YN和R2A培養(yǎng)基中，搖床振蕩培養(yǎng)18 h后取菌液于離心管中，12 000 r/min離心收集菌體后參考文獻[19]的方法提取細菌基因組DNA。采用通用引物27F和1492R對細菌16S rRNA基因進行PCR擴增。PCR反應條件和反應體系參考文獻[19]的方法，將擴增好的PCR產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。將測序結果與EzBioCloud網站(https://www.ezbiocloud.net)模式菌株的16S rRNA基因序列相比對，判定菌株所屬類群。根據序列比對結果，下載相近的模式菌株序列，經Clustal X對齊后，通過軟件MEGA 7(方法為Neighbour-Joining，Bootstrap值取1 000)構建系統(tǒng)進化樹。

1.4 促生特性分析

根據序列比對結果，挑選不同種的細菌進行促生特性分析，分別測定菌株產吲哚乙酸(IAA)能力、產精氨酸脫羧酶(ADC)能力以及溶解難溶性磷酸鹽能力。菌株產IAA能力采用Salkowski顯色法進行測定，產ADC能力采用平板顯色法進行測定，具體步驟參考文獻[20]。溶磷試驗采用鉬銻抗比色法測定培養(yǎng)液中有效磷含量，具體步驟參考文獻[21]。

2 結果與分析

2.1 芒草根際細菌群落組成

對于平板上生長的根際細菌，根據菌落形態(tài)、顏色、大小分別挑取不同菌株，經純化、保藏最終從YN和R2A培養(yǎng)基各成功分離到13株菌，共計26株根際細菌。對其16S rRNA基因進行PCR擴增，序列測定后與EzBioCloud網站中模式菌株進行比對，確定其分類學地位，結果如表1所示。結果表明，根際細菌分布于放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)4個門，放線菌綱(Actinobacteria)、黃桿菌綱(Flavobacteria)、芽孢桿菌綱(Bacilli)和α-、β-、γ-變形桿菌綱(Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria、Gammaproteobacteria)6個綱，短小桿菌屬(Curtobacterium)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、根瘤菌屬(Rhizobium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)等12個屬(表1)。其中，屬于芽孢桿菌屬的菌株數為8株、根瘤菌屬4株、短小桿菌屬3株，占根際細菌總數比例分別為30.77%、15.38%和11.54%，為其優(yōu)勢種群。

表1 芒草根際、內生可培養(yǎng)細菌組成Tab 1 Cultivable rhizosphere and endophytic bacteria isolated from Miscanthus

注：表格中不同植物部位對應數字為菌株數量。
Note:The number corresponding to different plant parts in the table represents the number of strains.

本試驗通過YN和R2A培養(yǎng)基分離根際細菌，對其組成差異進行分析，結果如下：YN和R2A培養(yǎng)基各分離到根際細菌13株，均分布于放線菌門、擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門4個門，放線菌綱、黃桿菌綱、芽孢桿菌綱等6個綱。在屬的水平上，YN培養(yǎng)基分離的菌株分布于短小桿菌屬、芽孢桿菌屬、根瘤菌屬等6個屬，其中，芽孢桿菌屬、短小桿菌屬、根瘤菌屬菌株數分別為4、3、3株，為優(yōu)勢種群；R2A培養(yǎng)基分離的菌株分布于芽孢桿菌屬、劍菌屬(Ensifer)、根瘤菌屬等8個屬，其中，芽孢桿菌屬、劍菌屬菌株數分別為4、2株，為優(yōu)勢種群(表1)。分離到的12個屬的細菌經比較發(fā)現，YN培養(yǎng)基和R2A培養(yǎng)基共有的屬只有芽孢桿菌屬和根瘤菌屬。芽孢桿菌屬在2種培養(yǎng)基中菌株數量均為4株，但后續(xù)通過序列比對發(fā)現，YN培養(yǎng)基中與B.acidicelerCBD 119(1株)、B.altitudinis41KF2b(1株)、B.safensisFO-36b(1株)、B.tequilensisKCTC 13622(1株)相似性最高，R2A培養(yǎng)基中與B.aryabhattaiB8W22(1株)、B.megateriumNBRC 15308(3株)相似性最高。

2.2 芒草內生細菌群落組成

YN和R2A培養(yǎng)基各成功分離到13株和12株，共計25株根部內生細菌(表1)。對其分類學地位進行分析發(fā)現，根部內生細菌與根際細菌類似，分布于放線菌門、擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門4個門、6個綱，短小桿菌屬、芽孢桿菌屬、根瘤菌屬、假單胞菌屬、伯克霍爾德菌屬(Burkholderia)等9個屬(表1)。其中，屬于短小桿菌屬的菌株數為5株、伯克霍爾德菌屬5株、根瘤菌屬4株，占根部內生細菌總數比例分別為20.00%、20.00%、16.00%，為其優(yōu)勢種群。同時對不同培養(yǎng)基根部內生細菌群落組成進行分析，YN培養(yǎng)基分離的細菌分布于2個門、4個綱、4個屬，其中伯克霍爾德菌屬(5株)、假單胞菌屬(3株)為獨有種群；R2A培養(yǎng)基分離的細菌分布于4個門、6個綱、7個屬，其中芽孢桿菌屬(3株)、草螺菌屬(Herbaspirillum，2株)、黃單胞菌屬(Xanthomonas，1株)、金黃桿菌屬(Chryseobacterium，1株)和細小桿菌屬(Microbacterium，1株)為獨有種群；短小桿菌屬和根瘤菌屬為2種培養(yǎng)基共有種群(表1)。

YN和R2A培養(yǎng)基各成功分離到7株和15株，共計22株莖部內生細菌(表1)。這些細菌分布于放線菌門、擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門4個門，放線菌綱、芽孢桿菌綱、鞘脂桿菌綱(Sphingobacteriia)等5個綱，短小桿菌屬、細小桿菌屬、Mucilaginibacter、鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)、水棲菌屬(Enhydrobacter)等9個屬(表1)。其中，屬于短小桿菌屬菌株數為8株、鞘脂單胞菌屬4株、Mucilaginibacter3株，占莖部內生細菌總數比例分別為36.36%、18.18%和13.64%，為其優(yōu)勢種群。同時對不同培養(yǎng)基莖部內生細菌群落組成進行分析，YN培養(yǎng)基分離的細菌分布于2個門、3個綱、3個屬，沙雷氏菌屬(Serratia，1株)為獨有種群；R2A培養(yǎng)基分離的細菌分布于4個門、5個綱、8個屬，其中Mucilaginibacter(3株)、芽孢桿菌屬(2株)、葡萄球菌屬(Staphylococcus，1株)等6個屬為獨有種群；短小桿菌屬和鞘脂單胞菌屬為2種培養(yǎng)基共有種群，菌株數均為4株和2株。根據KIM等[22]的方法將16S rRNA基因序列相似度98.65%作為種間的臨界值，對芒草細菌群落組成進行分析時發(fā)現，莖部分離的菌株13和14與已發(fā)表的模式種16S rRNA基因序列最大相似度分別為97.36%～98.70%和97.23%～97.78%，可能為潛在的新種(表2)。后續(xù)試驗中，菌株14與參比菌株之間的平均核苷酸同源性(Average nucleotide identity，ANI)介于78.5%～78.7%，基于基因組數據計算所得的DNA雜交同源率(In silico DNA-DNA hybridization，In silico DDH)介于22.2%～22.6%，低于相應的閾值，結合生理生化特性等表型特征和化學組分分析，判定其為Pedobacter屬的1個新種，命名為Pedobactermiscanthisp.nov.[23]。與之類似，菌株13經過分子鑒定、生理生化特性和化學組分分析，判定其為Mucilaginibacter屬的1個新種，命名為Mucilaginibacterendophyticussp.nov.[24]。

表2 篩選的44種細菌群落組成及其植物促生特性Tab 2 Community composition and plant growth promoting activities of the filtered bacteria belonging to 44 different species

續(xù)表2 篩選的44種細菌群落組成及其植物促生特性Tab 2(Continued) Community composition and plant growth promoting activities of the filtered bacteria belonging to 44 different species

續(xù)表2 篩選的44種細菌群落組成及其植物促生特性Tab 2(Continued) Community composition and plant growth promoting activities of the filtered bacteria belonging to 44 different species

注：表格中不同植物部位對應數字為菌株數量；+為產ADC，-為不產ADC。
Note:The number corresponding to different plant parts in the table represents the number of strains,+ means production of ADC,- means no production of ADC.

YN和R2A培養(yǎng)基各成功分離到8株和5株，共計13株葉部內生細菌(表1)。這些細菌分布于放線菌門、厚壁菌門和變形菌門3個門，放線菌綱、芽孢桿菌綱和α-變形桿菌綱3個綱，短小桿菌屬、芽孢桿菌屬和鞘脂單胞菌屬3個屬，群落組成較為單一。其中短小桿菌屬菌株數為9株，占葉部內生細菌總數比例為69.2%，為其優(yōu)勢種群。芽孢桿菌屬和鞘脂單胞菌屬菌株數均為2株。同時對不同培養(yǎng)基葉部內生細菌群落組成進行分析，YN培養(yǎng)基分離的細菌組成單一，均屬于放線菌門的短小桿菌屬，經后續(xù)序列比對，發(fā)現其分別與C.albidumDSM 20512(2株)、C.citreumDSM 20528(2株)、C.oceanosedimentumATCC 31317(4株)相似性最高；R2A培養(yǎng)基分離的細菌分布于放線菌門、厚壁菌門和變形菌門3個門的3個屬，其中芽孢桿菌屬(2株)和鞘脂單胞菌(2株)為獨有種群。

2.3 芒草根際、內生細菌促生特性分析

在進行菌株分離時，同一菌株可能被重復挑選，之前的研究多采用16S rRNA基因限制性酶切多態(tài)性分析其組成，挑取代表菌株進行序列測定，準確度有限[21]。因此，本試驗將全部分離的86株菌進行16S rRNA基因序列測定，將測序結果與EzBioCloud網站模式菌株相比對，EzBioCloud數據庫中最高相似度種一致的菌株，結合菌落顏色、形態(tài)、大小等特征分析，認定為同一菌株。根據分析篩選出44種細菌(圖1)，繼而對這44種細菌進行促生潛在性評價(表2)。根際細菌根據序列比對，分布于20個種，其產IAA能力介于0.80～22.28 mg/L，其中產量超過10.00 mg/L的菌株占總數的61.54%；能產ADC的菌株9種，占菌株總數的34.62%；溶磷能力介于15.94～203.57 mg/L，其中超過100.00 mg/L的菌株占總數的46.15%。對不同培養(yǎng)基分離菌株促生特性分析表明，YN培養(yǎng)基分離的優(yōu)勢菌株29(最高相似性種RhizobiumradiobacterATCC 19358T)和菌株3(CurtobacteriumoceanosedimentumATCC 31317T)具有良好的溶磷能力，分別為203.57、131.60 mg/L，菌株41(BacillustequilensisKCTC 13622T)和菌株22(PseudomonashunanensisLVT)同時具有較好的產IAA、ADC和溶磷能力；R2A培養(yǎng)基分離的優(yōu)勢菌株40(BacillusmegateriumNBRC 15308T)具有較高產IAA能力，菌株31(EnsiferadhaerensCasida AT)具有良好產IAA能力和溶磷能力，分別為10.03、113.61 mg/L。25株根部內生細菌分布于14個種，其產IAA能力介于2.11～44.08 mg/L，其中產量超過10.00 mg/L菌株占總數的48.00%；能產ADC的菌株9種，占菌株總數的36.00%；溶磷能力介于23.65～203.57 mg/L，其中超過100.00 mg/L菌株占總數的52.00%。對不同培養(yǎng)基分離菌株促生特性分析表明，具有良好促生能力的菌株多屬于YN培養(yǎng)基分離的菌株，如菌株15(BurkholderiagladioliNBRC 13700T)和菌株20(PseudomonaspsychrotoleransDSM 15758T)能產ADC，同時具有較強的溶磷能力；菌株21(PseudomonassimiaeOLiT)同時具有較強的產IAA能力和溶磷能力，菌株1(CurtobacteriumcitreumDSM20528T)同時具有3種促生特性(表2)。22株莖部內生細菌分布于17個種，其產IAA能力介于0.11～28.56 mg/L，其中產量超過10.00 mg/L菌株占總數的38.89%；能產ADC的菌株9種，占菌株總數的66.67%；溶磷能力介于23.65～175.30 mg/L，其中超過100.00 mg/L菌株占總數的54.55%。對不同培養(yǎng)基分離菌株促生特性分析表明，具有良好產IAA能力的菌株主要分離自R2A培養(yǎng)基，YN培養(yǎng)基分離優(yōu)勢菌株3具有良好的溶磷能力。菌株24(SerratiamarcescensATCC 13880T)、菌株44(StaphylococcushaemolyticusMTCC 3383T)和菌株1同時具有3種促生特性(表2)。13株葉部內生細菌分布于6個種，其產IAA能力介于8.31～22.28 mg/L，其中產量超過10.00 mg/L菌株占總數的53.85%；能產ADC的菌株8株，占菌株總數的61.54%；溶磷能力介于59.63～131.60 mg/L，其中超過100.00 mg/L菌株占總數的53.85%。對不同培養(yǎng)基分離菌株促生特性分析表明，YN培養(yǎng)基分離的優(yōu)勢菌株3(CurtobacteriumoceanosedimentumATCC 31317T)具有良好的溶磷能力，R2A培養(yǎng)基分離的優(yōu)勢菌株36(SphingomonaspaucimobilisNBRC 13935T)具有產ADC能力(表2)。

圖1 基于可培養(yǎng)細菌16S rRNA基因序列構建的NJ系統(tǒng)進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of the culturable bacteria constructed by the Neighbor-Joining method based on the 16S rRNA gene sequences

3 結論與討論

微生物在植物生長過程中起到重要作用，因此開展植物根際土壤、內生細菌群落組成研究具有重要意義[25]。目前關于芒草根際土壤和內生細菌群落組成研究開展較少，特別是針對國內生境中芒草細菌群落研究鮮見報道。筆者之前采用16S rDNA Miseq高通量測序技術的方法研究了芒草根際細菌群落組成，發(fā)現其主要由變形菌門、擬桿菌門、放線菌門等31個門、343個屬的細菌組成，表現出群落組成的豐富性[26]。純培養(yǎng)菌株的獲得是微生物資源開發(fā)利用的重要前提和關鍵因素，因此本試驗采用傳統(tǒng)平板分離方法對種植5 a的芒草根際細菌和不同部位內生細菌群落進行研究。結果表明，根際細菌由放線菌門、擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門4個門、6個綱、12個屬的細菌組成，與高通量測序結果相比群落組成較為單一，絕大多數細菌同時出現在可培養(yǎng)和高通量測序結果中，但節(jié)桿菌屬、劍菌屬和Pseudoduganella只出現在可培養(yǎng)結果中，推測這些菌株在土壤中占比較低，通過培養(yǎng)基富集培養(yǎng)從而被分離出來。該結果與COPE-SELBY等[10]關于芒草根際可培養(yǎng)細菌群落組成研究類似，芽孢桿菌屬均為優(yōu)勢種群。從芒草根部、莖部和葉部共分離60株內生細菌，對其群落分析表明，由放線菌門、擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門4個門、7個綱、15個屬的細菌組成，其中短小桿菌屬在根、莖、葉中占比分別為20.00%、36.36%、69.23%，為內生細菌優(yōu)勢種群，同時伯克霍爾德菌屬為根部優(yōu)勢種群，鞘脂單胞菌屬為莖部優(yōu)勢種群，這些菌株也廣泛存在于水稻等植物體內[27-28]，但因芒草品種和土壤等外界環(huán)境不同，與COPE-SELBY等[10]關于芒草內生細菌群落組成研究有所差異。對比根際和內生細菌群落可以發(fā)現，根際優(yōu)勢種群短小桿菌屬存在于根部、莖部和葉部，且同時為其優(yōu)勢種群。與此類似，土壤優(yōu)勢種群芽孢桿菌屬菌株廣泛存在于芒草不同組織內部。以上結果與內生細菌來源于土壤等外界環(huán)境，進入植物體內定殖和適度繁殖的觀點相一致[29]。同時根部優(yōu)勢種群伯克霍爾德菌屬、莖部優(yōu)勢種群Mucilaginibacter和葉部的黃桿菌屬等只出現在相應的組織中，其中，菌株13、14只存在于芒草莖部，經分子鑒定、生理生化特性和化學組分分析，判定其為2個新種，分別命名為Mucilaginibacterendophyticussp.nov.[24]和Pedobactermiscanthisp.nov.[23]，表現出不同組織群落組成的差異。同時不同培養(yǎng)基因其營養(yǎng)物質成分、離子含量等條件的差異，導致對微生物具有不同的選擇性。對YN和R2A 2種培養(yǎng)基分離菌株進行分析發(fā)現，其群落組成互相補充，因此，后續(xù)研究時應考慮培養(yǎng)基種類及其組合以獲得盡可能全面的芒草細菌群落組成[30]。

TIMMUSK等[31]研究表明，具有促生特性功能的可培養(yǎng)細菌在植物生長中起到重要的作用。植物促生細菌PseudomonaskoreensisAGB-1分離自芒草根部，芒草接種試驗表明其能提高芒草生物量和重金屬積累量[11]。本試驗對芒草根際和內生細菌促生特性進行分析，發(fā)現很多菌株具有良好的促生特性。其中產IAA能力超過10.00 mg/L的菌株數為42株，占菌株總數的48.84%；產ADC的菌株36株，占菌株總數的41.86%；溶磷能力超過100.00 mg/L的菌株44株，占菌株總數的51.16%。這些菌株分布于放線菌門、擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門4個門，7個綱，21個屬，其中短小桿菌屬、根瘤菌屬、芽孢桿菌屬、伯克霍爾德菌屬、鞘脂單胞菌屬為其主要組成，該結果與之前的關于促生細菌群落組成研究類似[32-34]。其中菌株29(RhizobiumradiobacterATCC 19358T)、菌株21(PseudomonassimiaeOLiT)、菌株22(PseudomonashunanensisLVT)、菌株44(StaphylococcushaemolyticusMTCC 3383T)等同時具有3種促生特性，是后續(xù)用于研究提高芒草生長能力的良好菌種資源。細菌組成和促生能力分析表明，不同部位之間有所差異，根際細菌產ADC和溶磷能力較強菌株比例均低于內生細菌，產IAA能力較強菌株比例低于葉部，高于根部和莖部?？梢姡参锝M織內部作為重要的促生細菌來源，在后續(xù)芒草促生細菌篩選過程中應予以重視。