孟月，王丹，王雪蕾，郭曉茹，夏桂民

·論著·

建立共載米鉑與核酸miR-34a陽離子脂質(zhì)體中miR-34a的含量測(cè)定方法

孟月，王丹，王雪蕾，郭曉茹，夏桂民

100050 北京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所制劑室

建立共載米鉑與核酸 miR-34a 陽離子脂質(zhì)體中 miR-34a 的含量測(cè)定方法，分析檢測(cè) miR-34a 的包封率。

選用 RiboGreen-熒光分光光度法分析測(cè)定共載脂質(zhì)體中 miR-34a 的含量，并對(duì)建立的方法進(jìn)行方法學(xué)研究與驗(yàn)證。

建立的 RiboGreen-熒光分光光度法，最佳激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為 485 和 535 nm；miR-34a 在 0.5 ~ 100.0 nmol/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（= 6538+ 687.1，= 0.9998）；低、中、高 3 種濃度的平均回收率分別為98.23%（RSD = 1.88%，n = 3）、99.40%（RSD = 1.51%，n = 3）和99.03%（RSD = 1.28%，n = 3）；日內(nèi)精密度 RSD = 1.80%（n = 6），日間精密度 RSD = 0.99%（n = 6）。制備的連續(xù) 3 批共載脂質(zhì)體中 miR-34a 的濃度分別為 4.99、5.01 和 4.92 μmol/L，包封率分別為 99.0%、99.1% 和 99.1%。

本文建立的方法簡(jiǎn)便易行、重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高，可用于共載脂質(zhì)體中 miR-34a 的含量和包封率分析測(cè)定。

RiboGreen-熒光分光光度法； 含量測(cè)定； miR-34a； 陽離子脂質(zhì)體

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和復(fù)發(fā)與基因密切相關(guān)，抗腫瘤核酸藥物可通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)實(shí)現(xiàn)抗腫瘤效果。核酸藥物因易被核酸酶降解而不穩(wěn)定，將其制備成陽離子納米脂質(zhì)體是解決此類問題的有效途徑之一。鉑類藥物具有廣譜抗腫瘤作用，miR-34a 也具有廣泛的抗腫瘤活性，兩者的作用靶點(diǎn)不同，聯(lián)合給藥可以多靶點(diǎn)抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，利于控制或消除腫瘤的發(fā)展和（或）復(fù)發(fā)等。本課題組構(gòu)建了共載米鉑與核酸 miR-34a 的陽離子脂質(zhì)體，以期實(shí)現(xiàn)較好的抗腫瘤效果。

目前，核酸藥物的定量檢測(cè)方法主要有紫外分光光度法、凝膠電泳法和熒光分光光度法。利用核酸分子在 260 nm 處具有最大吸收峰，可采用紫外分光光度法進(jìn)行定量分析[1]，該法操作簡(jiǎn)便，是實(shí)驗(yàn)室常用的核酸定量方法。但該法靈敏度低，且易受到被檢樣品中其他雜質(zhì)的干擾，準(zhǔn)確度低，常常不適用于納米制劑中核酸藥物的定量檢測(cè)[2]。利用核酸分子與熒光染料結(jié)合后能夠產(chǎn)生較強(qiáng)熒光信號(hào)的特性，可以采用凝膠電泳法和熒光分光光度法進(jìn)行含量測(cè)定。熒光染料的選擇是這兩種方法的關(guān)鍵。常見的核酸染料有 EB、GelRed、SYBRGreen I 和RiboGreen 等[3-8]。

本研究嘗試建立 RiboGreen-熒光分光光度法和瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)共載米鉑和miR-34a 的陽離子脂質(zhì)體（MCL/miR-34a）中miR-34a 的含量，進(jìn)而分析檢測(cè) miR-34a 的包封率。經(jīng)過方法學(xué)研究與驗(yàn)證，認(rèn)為RiboGreen-熒光分光光度法更適合 MCL/miR-34a 中miR-34a 的分析檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料

RF-6000 熒光分光光度計(jì)購(gòu)自日本島津公司；Victor X5 多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)PerkinElmer 公司；OSB-2100 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購(gòu)自日本 Eyela 東京理化器械株式會(huì)社；KQ-250DB 數(shù)控超聲波清洗器購(gòu)自昆山市超聲儀器有限公司；共載米鉑和 miR-34a 陽離子脂質(zhì)體自制，批號(hào) 20191101、20191102、20191103；miR-34a購(gòu)自蘇州吉瑪基因股份有限公司，批號(hào) 380008；米鉑原料藥（純度99.6%）購(gòu)自昆明貴研藥業(yè)有限公司，批號(hào) M20171214；1,2-二油酰氧基丙基-N,N,N-三甲基溴化銨（DOTAP）、二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE）和膽固醇（Chol）購(gòu)自上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司；Triton X-100購(gòu)自索萊寶生物科技有限公司；十二烷基硫酸鈉（SDS）購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Quant-iTTMRiboGreen?RNA Assay Kit 購(gòu)自美國(guó) Thermo Fisher 公司；其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 miR-34a 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備 精密量取 1 ml 焦碳酸二乙酯（DEPC）水，置于含20 nmol miR-34a 的EP 管中，充分混勻，即得 20 μmol/L miR-34a 標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 共載米鉑和 miR-34a 陽離子脂質(zhì)體制備 采用薄膜分散法制備米鉑陽離子脂質(zhì)體（miriplatin cationic liposomes，MCL）：精密稱取處方量的米鉑及磷脂，溶于氯仿，再將其減壓旋蒸得均勻薄膜后，加入 5% 葡萄糖溶液（經(jīng) DEPC 除酶處理：加 1‰的DEPC，37 ℃振搖過夜，高壓蒸汽滅菌）水化、超聲，得MCL；采用共孵育法制備共載米鉑和 miR-34a 陽離子脂質(zhì)體：將處方量的miR-34a 與 MCL 等體積混合，室溫孵育 20 min，即得 MCL/miR-34a。

1.2.3 供試品溶液及空白對(duì)照溶液制備 吸取 40 μl MCL/miR-34a，置于 2 ml 量瓶中，向其中加入 8.0 μl 10% Triton X-100（v/v），超聲 5 min，用 1 × TE 緩沖液（10 mmol/L Tris-HCl 和 1 mmol/L EDTA）定容至刻度，充分振蕩、搖勻，即得供試品溶液。另吸取 20 μl MCL，加 20 μl 經(jīng) DEPC 除酶處理的 5% 葡萄糖溶液，同法操作，得空白對(duì)照溶液。

1.2.4 RiboGreen 熒光染料配制 將 Quant-iTTMRiboGreen?RNA Reagent 用 1 × TE 稀釋200 倍，即得。

1.2.5 最佳激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)的確定 吸取 20 μmol/L miR-34a 標(biāo)準(zhǔn)溶液 10 μl，用 1 × TE稀釋 200 倍，然后將其與 RiboGreen 熒光染料等體積混合并搖勻，得具有熒光活性的 RiboGreen-miR-34a 復(fù)合物溶液。固定發(fā)射波長(zhǎng)，通過改變激發(fā)波長(zhǎng)，得到激發(fā)波長(zhǎng)（λex）和熒光強(qiáng)度（）的關(guān)系曲線，即激發(fā)光譜；固定激發(fā)波長(zhǎng)，通過改變發(fā)射波長(zhǎng)，得到發(fā)射波長(zhǎng)（λem）和熒光強(qiáng)度（）的關(guān)系曲線，即發(fā)射光譜，最終確定最佳激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)。

1.2.6 破乳劑的選擇 為準(zhǔn)確測(cè)定制劑中 miR-34a的濃度，需向制劑中加入適宜的破乳劑，以確保 miR-34a 從制劑中完全釋放的同時(shí)，不干擾 miR-34a 的含量測(cè)定。為此，本研究對(duì)破乳劑的類型及濃度進(jìn)行篩選：選用兩種表面活性劑 Triton X-100（非離子型）和 SDS（陰離子型），按制劑/表面活性劑的體積比為 5:1，分別向制劑中加入不同濃度的 Triton X-100 和 SDS，照“1.2.3”項(xiàng)下方法處理樣品，得樣品溶液，將其與 RiboGreen 熒光染料等體積混合，進(jìn)行熒光強(qiáng)度測(cè)定，測(cè)定結(jié)果與 miR-34a標(biāo)準(zhǔn)溶液熒光強(qiáng)度對(duì)比，同時(shí)考察 miR-34a 的釋放。

1.2.7 線性與范圍 吸取適量 20 μmol/L miR-34a標(biāo)準(zhǔn)溶液，用 1 × TE 稀釋制備成 200 nmol/L miR-34a 標(biāo)準(zhǔn)溶液，再將其按梯度稀釋成 100、50、20、10、5、1 nmol/L 的一系列 miR-34a 標(biāo)準(zhǔn)溶液。測(cè)定時(shí)，將系列濃度的 miR-34a 標(biāo)準(zhǔn)溶液與 RiboGreen 熒光染料等體積混合（得濃度分別為 100.0、50.0、25.0、10.0、5.0、2.5、0.5 nmol/L 的一系列溶液），在特定的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)下分別測(cè)其熒光強(qiáng)度，并測(cè)定空白溶液的熒光強(qiáng)度，前者減去后者即為 RiboGreen-miR-34a復(fù)合物的熒光強(qiáng)度，以 miR-34a 濃度（）為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度（）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。

1.2.8 精密度實(shí)驗(yàn) 取同一 MCL/miR-34a，照“1.2.3”項(xiàng)下方法操作，得供試品溶液，將其與 RiboGreen 熒光染料等體積混合，分別于日內(nèi)及日間（6 日）測(cè)定 MCL/miR-34a 中 miR-34a 的含量，并計(jì)算精密度。

1.2.9 回收率實(shí)驗(yàn) 取 MCL 20 μl，分別加入低、中、高 3 個(gè)濃度的 miR-34a 標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μl，得低、中、高 3 個(gè)濃度的 MCL/miR-34a，照“1.2.3”項(xiàng)下方法操作，得供試品溶液，將其與 RiboGreen 熒光染料等體積混合，進(jìn)行熒光強(qiáng)度測(cè)定，計(jì)算 miR-34a 濃度，將 miR-34a 濃度的實(shí)測(cè)值與理論值相比，即得回收率，每個(gè)濃度平行測(cè) 3 次。

1.2.10 含量及包封率測(cè)定 取 MCL/miR-34a，照“1.2.3”項(xiàng)下方法操作，得供試品溶液，將其與 RiboGreen 熒光染料等體積混合，進(jìn)行熒光強(qiáng)度測(cè)定，采用外標(biāo)一點(diǎn)法，計(jì)算 miR-34a 的濃度，即為 MCL/miR-34a 中 miR-34a 的總濃度（total）；當(dāng) RiboGreen 熒光染料加入溶液中后，游離的 miR-34a 會(huì)與其結(jié)合，形成具有熒光活性的復(fù)合物 RiboGreen-miR-34a。而 MCL 固縮包載的 miR-34a不會(huì)與 RiboGreen 熒光染料結(jié)合，不產(chǎn)生熒光活性。吸取 40 μl MCL/miR-34a，用 1 × TE 稀釋50 倍，將其與 RiboGreen 熒光染料等體積混合，進(jìn)行熒光強(qiáng)度測(cè)定，采用外標(biāo)一點(diǎn)法，計(jì)算游離 miR-34a濃度（free）。

按以下公式計(jì)算包封率：

2 結(jié)果

2.1 最佳激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)的確定

RiboGreen-miR-34a復(fù)合物的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜如圖 1 所示，最佳激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為 485 nm 和 535 nm。

圖 1 RiboGreen-miR-34a 的激發(fā)光譜（a）和發(fā)射光譜（b）

Figure 1 Excitation (a) and emission (b) spectra of RiboGreen-miR-34a

2.2 破乳劑的選擇

破乳劑及其濃度的改變對(duì)熒光強(qiáng)度和 miR-34a釋放的影響如圖 2 所示。隨著 Triton X-100濃度的增加，熒光強(qiáng)度逐漸增加，miR-34a 釋放量逐漸增加，當(dāng) Triton X-100濃度為10%（v/v）時(shí)，miR-34a 可從制劑中完全釋放（圖 2A）；隨著 SDS 濃度的增加，熒光強(qiáng)度先增加后減小，當(dāng) SDS 濃度為 5%（m/v）時(shí)，miR-34a 釋放量達(dá)最大，僅為 70%，miR-34a釋放不完全（圖 2B）。因此，在該法中選用 10% Triton X-100 作為破乳劑。

2.3 線性與范圍

分別測(cè)定 100.0、50.0、25.0、10.0、5.0、2.5、0.5 nmol/L RiboGreen-miR-34a 復(fù)合物溶液的熒光強(qiáng)度（表 1），以 miR-34a 濃度（）為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度（）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：= 6538+ 687.1（= 0.9998）。結(jié)果表明，在 0.5 ~ 100.0 nmol/L范圍內(nèi) miR-34a 濃度與熒光強(qiáng)度呈良好的線性關(guān)系。

圖 2 miR-34a 釋放實(shí)驗(yàn)（A：Triton X-100 濃度與 miR-34a熒光強(qiáng)度及釋放量曲線；B：SDS 濃度與 miR-34a 熒光強(qiáng)度及釋放量曲線）

Figure 2 The release test of miR-34a in MCL/miR-34a (A: Curve of concentration of Triton X-100 and fluorescence intensity/release of miR-34a; B: Curve of concentration of SDS and fluorescence intensity/release of miR-34a)

表 1 miR-34a 濃度與熒光強(qiáng)度（n = 3）

表 2 回收率結(jié)果

2.4 精密度實(shí)驗(yàn)

照“1.2.8”項(xiàng)下操作，同一天內(nèi)連續(xù) 6 次測(cè)定 RiboGreen-miR-34a 復(fù)合物溶液的熒光強(qiáng)度，計(jì)算得 miR-34a 平均濃度為 4.96 μmol/L，日內(nèi)精密度 RSD 為 1.80%（n = 6）；連續(xù) 6 d，每天同法處理并平行測(cè)定 6 次，計(jì)算得 miR-34a 平均濃度為 4.94 μmol/L，日間精密度 RSD 為 0.99%（n = 6）。

2.5 回收率實(shí)驗(yàn)

低、中、高 3 種濃度的平均回收率分別為98.23%（RSD = 1.88%，n = 3）、99.40%（RSD = 1.51%，n = 3）、99.03%（RSD = 1.28 %，n = 3）（表 2）。

2.6 miR-34a 的含量及包封率測(cè)定

采用 RiboGreen-熒光分光光度法測(cè)定3 個(gè)批次共載脂質(zhì)體 MCL/miR-34a 中 miR-34a的含量及包封率。分別測(cè)定 MCL/miR-34a 中 miR-34a 的總濃度（total）和游離 miR-34a 濃度（free），計(jì)算包封率，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表 3 所示。

表 3 共載脂質(zhì)體 MCL/miR-34a 中 miR-34a 的含量和包封率

3 討論

瓊脂糖凝膠電泳法也是核酸藥物含量測(cè)定的常用方法，操作簡(jiǎn)便，但檢測(cè)靈敏度受熒光染料影響較大，且靈敏度較低。在開展RiboGreen-熒光分光光度法研究的同時(shí)也考察了瓊脂糖凝膠電泳法分析檢測(cè)共載脂質(zhì)體中 miR-34a 的含量。

在瓊脂糖凝膠電泳法分析檢測(cè) miR-34a 的研究中，選擇了常用的 GelRed 染料，檢測(cè)不同濃度 miR-34a 標(biāo)準(zhǔn)溶液的凝膠成像，結(jié)果顯示，該法的最低檢測(cè)限為 100nmol/L，靈敏度顯著低于 RiboGreen-熒光分光光度法（最低檢測(cè)限為0.5 nmol/L）。應(yīng)用此法檢測(cè)MCL/miR-34a 中 miR-34a 的包封率時(shí)，MCL/miR-34a 組未見游離 miR-34a 條帶，原因可能有兩種：①游離 miR-34a 濃度低于檢測(cè)限；②miR-34a 全部被 MCL 固縮包載，無游離 miR-34a，前者可能性更大。所以認(rèn)為：瓊脂糖凝膠電泳法無法靈敏地測(cè)定微量的游離核酸，不能滿足 MCL/miR-34a 中 miR-34a 的包封率測(cè)定。

本文建立的 RiboGreen-熒光分光光度法操作簡(jiǎn)便、專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高及重復(fù)性好。通過方法學(xué)研究與驗(yàn)證，認(rèn)為本法適合共載脂質(zhì)體MCL/miR-34a 中 miR-34a 的含量及包封率的測(cè)定。

[1] Yao DB, Chi DF, Yu J, et al. An improved method for extraction of nucleic acid from coleopteran insects. J Northeast Forestry Univ, 2009, 37(01):86-88. (in Chinese)

姚大彬, 遲德富, 宇佳, 等. 一種改良的鞘翅目昆蟲核酸的提取方法. 東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 37(01):86-88.

[2] Tsanev R. Fractionation of RNA in agar-gel electrophoresis studied by direct ultraviolet spectrophotometry. Biokhimiia, 1965, 30(1):124- 127.

[3] Sharma S, Mazumdar S, Italiya KS, et al. Cholesterol and morpholine grafted cationic amphiphilic copolymers for miRNA-34a delivery. Mol Pharm, 2018, 15(6):2391-2402.

[4] Lou J, Diao BW, Li W, et al. Comparative analysis of three types of nucleic acid staining for PFGE. Dis Surveill, 2011, 26(5):388-391. (in Chinese)

婁靜, 刁保衛(wèi), 李偉, 等. 三種核酸染料應(yīng)用于細(xì)菌脈沖場(chǎng)凝膠電泳染色的比較研究. 疾病監(jiān)測(cè), 2011, 26(5):388-391.

[5] Ye JS, Zhang N, Ma CH, et al. SYBR Green I-fluorometry determination of content and entrapment efficiency of protamine- pDNA complex loaded solid lipid nanoparticles. Chin J Pharm Anal, 2007, 27(11):1769-1772. (in Chinese)

葉杰勝, 張娜, 馬春紅, 等. SYBR Green I-熒光法測(cè)定載魚精蛋白縮合基因納米粒中pDNA的含量和包封率. 藥物分析雜志, 2007, 27(11):1769-1772.

[6] Jones LJ, Yue ST, Cheung CY, et al. RNA quantitation by fluorescence-based solution assay: ribogreen reagent characterization.Anal Biochem, 1998, 265(2):368-374.

[7] Zang X, Ding H, Zhao X, et al. Anti-EphA10 antibody-conjugated pH-sensitive liposomes for specific intracellular delivery of siRNA. Int J Nanomedicine, 2016, 11:3951-3967.

[8] Shen Y, Tu JS, Pang H, et al. Electrophoresis and fluorospectrophotometry methods to determine the content and entrapment efficiency of siRNA in cationic liposomes. Acta Pharm Sinica, 2009, 44(4):430-435. (in Chinese)

沈雁, 涂家生, 龐卉, 等. 凝膠電泳法及熒光光度法測(cè)定siRNA陽離子脂質(zhì)體的含量和包封率. 藥學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 44(4):430-435.

Establishment of a method for determination of miR-34a in codelivery miriplatin and miR-34a cationic liposomes

MENG Yue, WANG Dan, WANG Xue-lei, GUO Xiao-ru, XIA Gui-min

Pharmaceutics Department, Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China

To establish a method for determining miR-34a content of codelivery miriplatin and miR-34a cationic liposomes (MCL/miR-34a).

RiboGreen-fluorescence spectrophotometry was used for content determination as RiboGreen can combine with miR-34a to form a complex with strong fluorescent activity.

The optimal excitation and emission wavelengths of RiboGreen-miR-34a were 485 and 535 nm, respectively. RiboGreen-fluorescence spectrophotometry had a good linear correlation in a range at 0.5 - 100.0 nmol/Land the regression equation was= 6538+ 687.1,= 0.9998; the recovery at the low, middle and high concentrations were 98.23% (RSD = 1.88%, n = 3), 99.40% (RSD = 1.51%, n = 3) and 99.03% (RSD = 1.28%, n = 3), respectively. The inter-day and intra-day precision was reflected by RSD values of 1.80% (n = 6) and RSD = 0.99% (n = 6), respectively. The concentration of miR-34a in 3 batches of MCL/miR-34a measured by this method were 4.99, 5.01 and 4.92 μmol/L, and the encapsulation rate were 99.0%, 99.1% and 99.1%, respectively.

A convenient, sensitive and accurate method has been established for determination of the miR-34a content and the entrapment efficiency of MCL/miR-34a.

RiboGreen-fluorescence spectrophotometry; Determination; miR-34a; Cationic liposomes

XIA Gui-min, Email: xiaguimin@126.com

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2016YFA0201504）；國(guó)家自然科學(xué)基金（81673383、81603063、81803479）

夏桂民，Email：xiaguimin@126.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.03.003

2019-12-21